本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種可高效表達(dá)且表達(dá)產(chǎn)物具有明顯生物學(xué)活性的制備重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白的基因及方法。

背景技術(shù)：

紅鰭東方鲀是國(guó)內(nèi)主要養(yǎng)殖魚類品種，但是養(yǎng)殖中經(jīng)常會(huì)有一些病毒性疾病和細(xì)菌性疾病，例如：白嘴病，真鯛虹彩病毒病，弧菌病，鏈球菌病等等。對(duì)于這些疾病，往往想到的應(yīng)對(duì)方案就是使用化學(xué)類藥物或是抗生素，但是這種方法問題較多，近年來，天然免疫類產(chǎn)品在此方面發(fā)揮著重要的作用，它能夠代替抗生素作為一種安全的藥品應(yīng)用于實(shí)踐中。

白細(xì)胞介素簡(jiǎn)稱白介素（interleukins,IL），是能夠在免疫細(xì)胞和白細(xì)胞之間相互作用的一類細(xì)胞因子家族，其中白介素-2（IL-2）是該家族中的重要成員。研究發(fā)現(xiàn)，白介素-2在免疫系統(tǒng)中扮演重要角色，是影響機(jī)體免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子。對(duì)白介素2的廣泛研究是從1983年首次克隆并測(cè)序了人類IL-2基因之后， 1998年Choi等將含有信號(hào)肽的雞白介素2基因克隆入PUC18載體，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，得到的蛋白具有促進(jìn)雞T淋巴細(xì)胞增值的生物學(xué)活性；1999年Stepaniak等對(duì)雞白介素2基因的體外表達(dá)進(jìn)行了比較深入的研究，他將去除前導(dǎo)肽的雞白介素2基因序列在大腸桿菌Pgex-2t系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，所得表達(dá)產(chǎn)物雖具有生物學(xué)活性，但是表達(dá)量低，且多為非可溶性表達(dá)，不利于產(chǎn)物的回收及純化。為解決此問題Stepaniak等人將上述表達(dá)系統(tǒng)換為pET-32a+高表達(dá)系統(tǒng)，將IL-2基因與硫氧還蛋白在缺失硫代還原酶的大腸桿菌菌株中進(jìn)行融合表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白表達(dá)量有顯著提高，且產(chǎn)物多為可溶性蛋白。但是由于魚類細(xì)胞因子含量低等原因，一直以來對(duì)魚類白介素2基因的研究相對(duì)滯后。

2001年開始，魚類白介素2的研究廣泛展開，徐炳森等從草魚頭腎淋巴細(xì)胞中提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以高等動(dòng)物和牙鲆的IL-2基因兩端的保守序列為依據(jù)設(shè)計(jì)合成引物，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將其克隆入PET-28載體后在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。但是，迄今為止，還沒有關(guān)于原核表達(dá)和真核表達(dá)獲得重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的技術(shù)問題，提供一種可高效表達(dá)且表達(dá)產(chǎn)物具有明顯生物學(xué)活性的重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白的制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：一種制備重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白的基因，其特征在于所述基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。

一種制備重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白的方法，其特征在于依次按照如下步驟進(jìn)行：

a. 將DNA序列如SEQ ID NO:1所示的基因克隆入原核表達(dá)載體pET-32a上，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒；

b. 將原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，篩選陽(yáng)性克隆，構(gòu)建重組大腸桿菌BL21(DE3)；

c. 用LB作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，擴(kuò)大培養(yǎng)重組大腸桿菌BL21(DE3)；

d. 向擴(kuò)大培養(yǎng)物中加入IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心收集菌體；

e. 超聲破碎所收集菌體，離心后取上清液，即得重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白粗品。

將e步驟所得上清液經(jīng)過Ni柱蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化，即得重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白純品。

本發(fā)明是在天然紅鰭東方鲀白介素2基因的基礎(chǔ)上針對(duì)大腸桿菌密碼子的偏愛性進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在序列兩端加入酶切位點(diǎn)及標(biāo)簽序列等，繼而以改造的基因制備重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)：（1）能夠在大腸桿菌中更高效表達(dá)，表達(dá)量占菌體總蛋白的50%左右，表達(dá)率經(jīng)百次傳代不降低；（2）所表達(dá)的重組紅鰭東方鲀白介素-2蛋白主要以可溶蛋白的形式存在于基因工程菌中，超聲波細(xì)胞破碎即可以將目的蛋白釋放出來，不需要處理包涵體等繁瑣操作就可以得到重組紅鰭東方鲀白介素-2蛋白的粗品，且其穩(wěn)定性好，實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性高；用Ni-NTA Agarose蛋白純化系統(tǒng)即可得到純度更高的重組紅鰭東方鲀白介素-2蛋白，操作簡(jiǎn)單方便，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例重組質(zhì)粒的雙酶切電泳鑒定圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例重組蛋白Western Blot驗(yàn)證圖。

圖3是 CTLL-2細(xì)胞在紅鰭東方鲀白介素2標(biāo)準(zhǔn)品作用下的增值曲線圖。

圖4是CTLL-2細(xì)胞在本發(fā)明實(shí)施例重組蛋白作用下的增值曲線圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明是在天然紅鰭東方鲀白介素2基因的基礎(chǔ)上針對(duì)大腸桿菌密碼子的偏愛性進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在序列兩端加入酶切位點(diǎn)及標(biāo)簽序列等，優(yōu)化的基因DNA序列如SEQ ID NO:1所示，用于制備重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白。

本發(fā)明的重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白的制備方法，依次按照如下步驟進(jìn)行：

a. 合成SEQ ID NO:1所示的基因并將SEQ ID NO:1所示的基因克隆入原核表達(dá)載體pET-32a上，活化TOP10/pET-32a/IL-2菌體，提取原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a/IL-2；

b. 將原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a/IL-2轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行PCR鑒定后，經(jīng)XhoI、NcoI雙酶切（圖1）進(jìn)一步鑒定，構(gòu)建重組大腸桿菌BL21(DE3)；

c. 挑取單克隆接種到含有氨芐的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，按照1:100的比例將培養(yǎng)物接種到含氨芐的LB培養(yǎng)基中，200rmp振蕩培養(yǎng)4小時(shí)左右，使得OD600約為0.6左右；

d. 向該培養(yǎng)物中加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度1mmol/L，28℃，200rmp誘導(dǎo)過夜后，離心收集菌體；將菌體用5xSDS上樣緩沖液，用SDS-PAGE鑒定，產(chǎn)物表達(dá)量可達(dá)占菌體總蛋白的50%左右；

e. 超聲破碎所收集的重組大腸桿菌BL21(DE3)菌體，離心后取上清液，即得重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白粗品；

f. 進(jìn)一步用北京全式金公司的Ni柱蛋白純化系統(tǒng)即可得到重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白純品：用PBS透析融合蛋白純品，透析后每mg融合蛋白質(zhì)中加入10U腸激酶，37℃酶切24h，用Ni柱純化酶切產(chǎn)物即可得到重組蛋白純品。

經(jīng)測(cè)序，所得重組蛋白純品的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，經(jīng)Western Blot驗(yàn)證（圖2），鑒定為重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白。用微孔濾膜過濾除菌，可以作為抗病添加劑，免疫佐劑等。

用Bradford法對(duì)蛋白純化產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，經(jīng)測(cè)定每100ml大腸桿菌可以得到約40mg有活性的紅鰭東方鲀白介素2，純化后的重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白經(jīng)SDS-PAGE鑒定純度均在98%以上。

用MTT法測(cè)定所得重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白的生物活性：

將CTLL-2細(xì)胞用完全培養(yǎng)液于37℃、5%CO₂條件下培養(yǎng)24～48小時(shí)至足夠量，離心收集CTLL-2細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌3次，然后重懸于基礎(chǔ)培養(yǎng)液中配制成每lml含6.0×10⁵個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，將該懸液置于37℃、5%CO₂條件下備用。在加有標(biāo)準(zhǔn)品溶液（紅鰭東方鲀白介素2標(biāo)準(zhǔn)品）和供試品溶液（樣品1：本發(fā)明所得重組蛋白粗品；樣品2：本發(fā)明所得重組蛋白純品）的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液50μl，于37℃、5%CO₂條件下培養(yǎng)18～24小時(shí)。向上述96孔板中每孔加入MTT溶液20μl，于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)4～6小時(shí)后，每孔加入裂解液150μl，于37℃、5%CO2條件下保溫18～24小時(shí)。以上操作均在無菌條件下進(jìn)行。混勻上述96孔細(xì)胞板中的液體，并將其放入酶標(biāo)儀，以630nm為參比波長(zhǎng)，于波長(zhǎng)570nm測(cè)定吸光度。用公式：

供試品生物學(xué)活性（IU/ml）=Pr*

計(jì)算各樣品生物學(xué)活性。

結(jié)果如圖3、圖4所示，表明本發(fā)明實(shí)施例所得的重組蛋白粗品、純品均具有明顯的生物學(xué)活性，其效價(jià)分別為163100.44 IU/ml、187846.39 IU/ml 。

序列表

<110>大連海洋大學(xué)

<120>制備重組紅鰭東方鲀白介素2蛋白的基因及方法

<130>

<160>2

<210>1

<211>405

<212>DNA。

<213>人工序列

<220>

<221>allele

<222>(1)..(405)

<223>TkIL-2/A

<400> 1

atggcgttcc cgctgcatct ggaggatagc aacattgacg tgattcgcga ggacgtgaag 60

tgcgagccgg atagcaaatt ctacaccccg gccaatgtgc gcgatgatca ccactgcatt 120

atcgtggccc tggaatgcgt ggccgccgaa ctgaaaaccg tgcgccgcga atgtgaagat 180

ccggaagatg tgatcggcgt ggccgaagaa tttctgaccc acaccatcca gaaactgaaa 240

aacggcgtga aaattgaaaa aagcaatagc accgaatgca gcacctgcga aagctggccg 300

gaaaaaccgc tgaccaattt tctggacgcc acagaaagcc tgctgcagca ggtgcagagc 360

ggtgcaattc ctagcgccga gggtagccat catcaccacc atcac 405

<210>2

<211>135

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>SIMILER

<222>(1)..(135)

<223>TkIL-2/A的氨基酸序列

<400> 2

Met Ala Phe Pro Leu His Leu Glu Asp Ser Asn Ile Asp Val Ile Arg

1 5 10 15

Glu Asp Val Lys Cys Glu Pro Asp Ser Lys Phe Tyr Thr Pro Ala Asn

20 25 30

Val Arg Asp Asp His His Cys Ile Ile Val Ala Leu Glu Cys Val Ala

35 40 45

Ala Glu Leu Lys Thr Val Arg Arg Glu Cys Glu Asp Pro Glu Asp Val

50 55 60

Ile Gly Val Ala Glu Glu Phe Leu Thr His Thr Ile Gln Lys Leu Lys

65 70 75 80

Asn Gly Val Lys Ile Glu Lys Ser Asn Ser Thr Glu Cys Ser Thr Cys

85 90 95

Glu Ser Trp Pro Glu Lys Pro Leu Thr Asn Phe Leu Asp Ala Thr Glu

100 105 110

Ser Leu Leu Gln Gln Val Gln Ser Gly Ala Ile Pro Ser Ala Glu Gly

115 120 125

Ser His His His His His His

130 135