本發(fā)明所涉及動(dòng)物病原分子診斷
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種檢測(cè)臍帶血中豬附紅細(xì)胞體的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒及其用途。
背景技術(shù)：
：附紅細(xì)胞體(Eperythrozoon)是一種人畜共患病原體，是一類附著于人和動(dòng)物紅細(xì)胞表面，或游離于血漿中的不可培養(yǎng)的病原微生物，引起寄生宿主以貧血、發(fā)熱、黃疸等為主要臨床癥狀的附紅細(xì)胞體病(Eperythozoonosis)。我國對(duì)于附紅細(xì)胞體病研究的報(bào)道相對(duì)較晚。1982年晉希民首次在兔體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并報(bào)道兔附紅細(xì)胞體病。同年，許耀成等人在江蘇南部地區(qū)報(bào)道了“豬紅皮病”，此病后來經(jīng)證實(shí)是由豬附紅細(xì)胞體感染所引起。1991年，內(nèi)蒙古自治區(qū)的邰秀珍等人首次報(bào)道了人的附紅細(xì)胞體病。次年，人附紅細(xì)胞體病先后被馮立明、裴標(biāo)等人報(bào)道。國內(nèi)學(xué)者華修國于1992年至1995年間依次在牛奶、豬和犬中檢測(cè)到了附紅細(xì)胞體的存在。豬附紅細(xì)胞體病是嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的重要傳染病之一，其不僅導(dǎo)致畜產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量降低，而且導(dǎo)致豬的生育能力下降，在臨床上又常與其他疾病并發(fā)感染，給診斷造成困難，導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)生嚴(yán)重的臨床癥狀甚至死亡，阻礙了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，是亟待控制的疫病之一。國內(nèi)外對(duì)此病的研究大多集中在對(duì)該病的診斷方法和藥物治療上，并取得了一系列進(jìn)展。根據(jù)國內(nèi)外報(bào)道，目前已建立的附紅細(xì)胞體病的診斷方法主要包括直接鏡檢發(fā)，血清學(xué)診斷方法以及分子生物學(xué)診斷方法。直接鏡檢法是最早的附紅細(xì)胞體診斷方法，通過鮮血壓片、血涂片、染色及電鏡觀察，因操作繁瑣，時(shí)間長及對(duì)設(shè)備要求較高，因此不適用于臨床樣品的檢測(cè)。目前為止，已經(jīng)嘗試使用的血清學(xué)診斷附紅細(xì)胞體病的方法有補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，熒光抗體試驗(yàn)，間接血凝抑制試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等。但這些方法使用的抗原都是附紅細(xì)胞體全蟲蟲體粗制抗原，存在較高的變異性，可能會(huì)影響診斷的重復(fù)性，特異性差、敏感性低，難以推廣應(yīng)用。相對(duì)于血清診斷方法，附紅細(xì)胞體的分子生物學(xué)診斷方法發(fā)展較晚，目前為止，已經(jīng)建立的分子生物學(xué)診斷方法有DNA探針雜交技術(shù)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)(LAMP)以及PCR-ELISA檢測(cè)方法。對(duì)于附紅細(xì)胞體難于分離培養(yǎng)的特性，上述分子生物學(xué)診斷方法能快速、準(zhǔn)確的進(jìn)行檢測(cè)。目前，用于診斷方法建立的基因主要是16SrRNA基因、G1(MSG1)基因和A1(HspA1)基因。近幾年雖然用PCR方法診斷豬附紅細(xì)胞體病的報(bào)道屢見不鮮，尤其是以16SrRNA為目的基因的PCR方法已被成功應(yīng)用于豬附紅細(xì)胞體病的診斷，收效顯著。但是實(shí)際應(yīng)用過程中，常規(guī)PCR方法仍會(huì)表現(xiàn)出非特異性和重復(fù)性差的現(xiàn)象，這是因?yàn)椋贺i附紅細(xì)胞體的16SrRNA基因與其它病原微生物的16SrRNA基因有較高的同源性，如與血巴爾通體亞種的同源率為79.2％～83％，與邊緣血孢子蟲的同源性在72％～75％之間，因此這些基于16SrRNA基因設(shè)計(jì)的PCR方法特異性不高，易造成假陽性結(jié)果；加之常規(guī)PCR檢測(cè)應(yīng)用的EB為有害物質(zhì)，因此，常規(guī)PCR方法也不是非常理想的方法。在實(shí)際應(yīng)用過程中，建立一種簡便、快速、敏感性高、特異性強(qiáng)的診斷方法在豬附紅細(xì)胞體病的防治中非常重要。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種較新的核酸檢測(cè)技術(shù)，具備靈敏度高、快速便捷、抗污染能力強(qiáng)、安全系數(shù)好等優(yōu)點(diǎn)，1-2小時(shí)便能得出結(jié)果。結(jié)合臍帶血檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果可同時(shí)反映母、仔豬感染狀況，進(jìn)一步有助于豬場(chǎng)做好該疾病的防控工作。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提出一種檢測(cè)臍帶血中豬附紅細(xì)胞體的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒及其用途。該試劑盒的引物與特異性探針基于豬附紅細(xì)胞體oxaA基因，具有靈敏度高、特異性好、抗溶血、重復(fù)性優(yōu)、檢測(cè)結(jié)果快速客觀準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，通過檢測(cè)臍帶血、血液與其它組織樣品中的豬附紅細(xì)胞體核酸，能同時(shí)反映母、仔豬該病原帶毒和排毒狀況，有益于豬群豬附紅細(xì)胞體病早期預(yù)警、檢測(cè)診斷和免疫情況評(píng)估，進(jìn)一步有助于做好豬場(chǎng)該疾病的防控工作?；谏鲜瞿康模景l(fā)明提供了一種檢測(cè)臍帶血中豬附紅細(xì)胞體的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，該試劑盒包括擴(kuò)增引物和特異性熒光探針，所述擴(kuò)增引物和特異性熒光探針的序列如下所示：上游擴(kuò)增引物oxaA-F：5’-TTGGAAGTCAAGTGAGAACAA-3’，其為SEQIDNO:1序列；下游擴(kuò)增引物oxaA-R：5’-CTTCTGGATATAAATTCCTACTAGAAA-3’，其為SEQIDNO:2序列；特異性熒光探針oxaA-P：FAM-5’-TCCAGGTTGCGGACAAATAACTCAAT-3’-TAMARA，其為SEQIDNO:3序列，其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，TAMARA為熒光淬滅基團(tuán)。合理的引物和熒光探針設(shè)計(jì)是成功應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的關(guān)鍵。引物和探針的特異性對(duì)反應(yīng)有很大影響，如果引物和探針特異性不高，可能在擴(kuò)增構(gòu)成中產(chǎn)生非靶標(biāo)條帶，影響檢測(cè)結(jié)果的判定。OxaA基因是豬附紅細(xì)胞體基因組中的膜蛋白基因，其基因全長1026個(gè)堿基，編碼341個(gè)氨基酸。發(fā)明人從全長oxaA基因上篩選出一段基因片段，該基因片段在豬附紅細(xì)胞體中非常保守，大小為130bp，發(fā)明人針對(duì)該保守片段設(shè)計(jì)了多對(duì)引物和探針，最終根據(jù)擴(kuò)增效果(擴(kuò)增效率、靈敏度等)篩選出本發(fā)明的引物和探針。試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明引物和探針的特異性強(qiáng)，能有效從臍帶血、血液與組織樣品中檢測(cè)到豬附紅細(xì)胞體核酸。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述上游擴(kuò)增引物oxaA-F、所述下游擴(kuò)增引物oxaA-R和所述特異性熒光探針oxaA-P的摩爾比為2:2:1。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述上游擴(kuò)增引物oxaA-F、所述下游擴(kuò)增引物oxaA-R和所述特異性熒光探針oxaA-P在所述試劑盒中的終濃度均為0.2～0.4μM。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述試劑盒還包括陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、2×熒光PCR反應(yīng)液；所述2×熒光PCR反應(yīng)液中含有UNG酶系統(tǒng)。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述陰性對(duì)照為無DNA酶的ddH2O；所述陽性對(duì)照為克隆有豬附紅細(xì)胞體oxaA基因片段的克隆質(zhì)粒pEASY-oxaA，克隆質(zhì)粒pEASY-oxaA的終濃度為1.0×105copies/μL～1.0×107copies/μL。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述豬附紅細(xì)胞體oxaA基因片段的核苷酸序列如下所示：TTGGAAGTCAAGTGAGAACAAAGAGAAGAGTCTACTTCCACCCCTAAGTAGACTTTTTCTTCTAACTCAATATATTGAGTTATTTGTCCGCAACCTGGACCAATTTCTAGTAGGAATTTATATCCAGAAG(SEQIDNO:4序列)。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述克隆質(zhì)粒pEASY-oxaA采用以下方法制備得到：利用SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物擴(kuò)增豬附紅細(xì)胞體oxaA基因片段，通過TA克隆將oxaA基因片段克隆至pEASY-T1載體，篩選陽性克隆，測(cè)序正確的克隆質(zhì)粒命名為pEASY-oxaA。進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了所述的檢測(cè)臍帶血中豬附紅細(xì)胞體的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒的使用方法，包括以下步驟：(1)使用該實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)體系以20μL計(jì)為：10μMSEQIDNO:1所示的上游擴(kuò)增引物oxaA-F：0.4～0.8μL；10μMSEQIDNO:2所示的下游擴(kuò)增引物oxaA-R：0.4～0.8μL；10μMSEQIDNO:3所示的特異性熒光探針oxaA-P：0.2～0.4μL；2×熒光PCR反應(yīng)液：10μL；DNA模板：2μL；ddH2O：補(bǔ)足至20μL；(2)熒光PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性10Sec，60℃退火45Sec并收集熒光，共40個(gè)循環(huán)；最后25℃冷卻10sec，結(jié)束反應(yīng)；(3)結(jié)果分析：質(zhì)量控制：陰性對(duì)照FAM通道檢測(cè)無Ct值；陽性對(duì)照FAM通道檢測(cè)Ct值≤30；上述條件同時(shí)滿足，檢測(cè)結(jié)果有效；結(jié)果判定：FAM通道檢測(cè)Ct值≤40，則判定樣品為豬附紅細(xì)胞體感染陽性；FAM通道檢測(cè)無Ct值，則判定樣品為豬附紅細(xì)胞體感染陰性。在本發(fā)明中，為了使同一樣本獲得最大的擴(kuò)增效率和最小的Ct值，對(duì)退火溫度、引物濃度和特異性熒光探針的濃度進(jìn)行了優(yōu)化。本發(fā)明經(jīng)過優(yōu)化確定了最佳的退火溫度之后，對(duì)引物和特異性熒光探針的濃度進(jìn)行了優(yōu)化，引物濃度過低會(huì)影響擴(kuò)增效率，引物濃度過高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)，同樣特異性熒光探針濃度過低會(huì)引起特異性的熒光信號(hào)變?nèi)酰鴿舛冗^高則會(huì)引起探針與模板發(fā)生非特異性結(jié)合，產(chǎn)生非特異性熒光信號(hào)從而干擾特異性熒光信號(hào)。本發(fā)明經(jīng)過一系列優(yōu)化試驗(yàn)，最終確定本發(fā)明的熒光PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，采用本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)豬附紅細(xì)胞體的擴(kuò)增效率接近100％，并可獲得最小的Ct值。在PCR反應(yīng)體系中加入2×熒光PCR反應(yīng)液，該反應(yīng)液中含有UNG酶系統(tǒng)，在擴(kuò)增環(huán)節(jié)可以有效解決擴(kuò)增污染現(xiàn)象，抗污染能力強(qiáng)等。更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了上述試劑盒在制備檢測(cè)臍帶血中豬附紅細(xì)胞體的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑中的用途。本發(fā)明首次將豬附紅細(xì)胞體的oxaA基因和TaqMan探針相結(jié)合，在豬附紅細(xì)胞體的oxaA基因選取保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物和特異性探針，通過對(duì)退火溫度、引物濃度以及特異性熒光探針濃度等進(jìn)行優(yōu)化，建立了臍帶血中豬附紅細(xì)胞體的實(shí)時(shí)熒光PCR方法。靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的檢測(cè)范圍為109-101copies/μL，可以從豬附紅細(xì)胞體感染臍帶血中檢測(cè)到最低10copies的豬附紅細(xì)胞體核酸，靈敏度是常規(guī)PCR方法的300倍。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法對(duì)豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒、豬偽狂犬病毒、豬附紅細(xì)胞體、豬弓形體、和豬豬常見傳染病的病原體均無非特異性反應(yīng)，說明該方法特異性和可靠性強(qiáng)。準(zhǔn)確性試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于陽性對(duì)照與陰性對(duì)照的檢測(cè)，該方法與16SrRNAPCR方法檢測(cè)結(jié)果100％符合；對(duì)于臨床樣品的檢測(cè)，該方法檢測(cè)陽性9/63，16SrRNAPCR方法檢測(cè)陽性7/63，且后者檢測(cè)的7份樣品使用該方法檢測(cè)均為陽性，說明該方法比普通PCR方法更敏感，準(zhǔn)確性高。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法對(duì)不同核酸濃度的陽性對(duì)照檢測(cè)變異系數(shù)(CV)均小于1％，具有較好的重復(fù)性。綜上所述，本發(fā)明建立的檢測(cè)臍帶血中豬附紅細(xì)胞體的實(shí)時(shí)熒光PCR方法和基于該方法建立的試劑盒具有準(zhǔn)確度高，靈敏度高，特異性強(qiáng)和重復(fù)性優(yōu)的特點(diǎn)，可以用于豬附紅細(xì)胞體感染的病原學(xué)研究、早期診斷，對(duì)豬附紅細(xì)胞體病的快速診斷、綜合防控、病原凈化和早期治療具有重要意義。本發(fā)明應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)臍帶血中豬附紅細(xì)胞體的的工作原理：由于豬屬于上皮絨毛胎盤，母豬和胎兒獨(dú)立血液循環(huán)系統(tǒng)之間存在血胎盤屏障的緣故，正常的“臍帶血”是不含病原體和抗體物質(zhì)的，即不存在任何病原的相關(guān)基因片段，因此，可通過檢測(cè)“臍帶血”中是否存在豬附紅細(xì)胞體核酸來判斷無癥狀母豬的帶毒情況，亦可以預(yù)警仔豬感染豬附紅細(xì)胞體的風(fēng)險(xiǎn)。具體步驟為：(1)樣品采集；(2)樣品處理；(3)DNA提?。?4)實(shí)時(shí)熒光PCR：利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物和探針進(jìn)行；(5)判定結(jié)果。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的試劑盒具有以下有益效果：(1)本發(fā)明首次利用oxaA基因進(jìn)行豬附紅細(xì)胞體的檢測(cè)，豐富了豬附紅細(xì)胞體檢測(cè)的手段。(2)本發(fā)明的檢測(cè)方法克服了常規(guī)檢測(cè)技術(shù)耗時(shí)長、敏感度低、安全系數(shù)低、抗污染能力差和不能準(zhǔn)確定量等問題，檢測(cè)快速高效，不會(huì)造成樣品交叉污染。(3)本發(fā)明的檢測(cè)方法準(zhǔn)確度高，靈敏度高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性優(yōu)，可以實(shí)現(xiàn)大通量樣品的檢測(cè)。(4)本發(fā)明的檢測(cè)方法不僅適用于檢測(cè)臍帶血檢測(cè)，還適用于待檢豬的脾臟、淋巴結(jié)、血清及血漿等樣品，可用于任何實(shí)驗(yàn)室和基層各級(jí)防控單位、獸醫(yī)站及大中小型養(yǎng)殖場(chǎng)等。(5)在日常病原檢測(cè)及疾病凈化過程中，需進(jìn)行活體采樣，對(duì)豬群的應(yīng)激較大，難度也高，而臍帶血避免了這些問題，臍帶血雖然含毒量相對(duì)于組織而言要低，但在實(shí)際應(yīng)用中也對(duì)組織及對(duì)應(yīng)臍帶血進(jìn)行了相互印證，確保了本發(fā)明檢測(cè)方法的特異性及敏感性。附圖說明圖1為本發(fā)明陽性對(duì)照10倍稀釋的梯度擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖2為本發(fā)明試劑盒的敏感性檢測(cè)結(jié)果圖；圖3為本發(fā)明試劑盒的特異性檢測(cè)結(jié)果圖；圖4為本發(fā)明試劑盒的重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1檢測(cè)臍帶血中豬附紅細(xì)胞體的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒的組成(1)2×熒光PCR反應(yīng)液(含酶)：購自湖南圣湘生物科技有限公司；該反應(yīng)液中含有UNG酶系統(tǒng)，在擴(kuò)增環(huán)節(jié)可以有效解決擴(kuò)增污染現(xiàn)象，抗污染能力強(qiáng)等；(2)擴(kuò)增引物組oxaA-F和oxaA-R：由上海生工生物工程公司合成，用DEPC水配制成濃度為10μM。上游擴(kuò)增引物oxaA-F序列：5’-TTGGAAGTCAAGTGAGAACAA-3’，其為SEQIDNO:1序列；下游擴(kuò)增引物oxaA-R：5’-CTTCTGGATATAAATTCCTACTAGAAA-3’，其為SEQIDNO:2序列；(3)特異性熒光探針oxaA-P：由華大基因公司合成，用DEPC水配制成濃度為10μM；特異性熒光探針oxaA-P：FAM-5’-TCCAGGTTGCGGACAAATAACTCAAT-3’-TAMARA，其為SEQIDNO:3序列，其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，TAMARA為熒光淬滅基團(tuán)；OxaA基因是豬附紅細(xì)胞體基因組中的膜蛋白基因，其基因全長1026個(gè)堿基，編碼341個(gè)氨基酸。發(fā)明人從全長oxaA基因上篩選出一段基因片段，該基因片段在豬附紅細(xì)胞體中非常保守，大小為130bp，發(fā)明人針對(duì)該保守片段設(shè)計(jì)了多對(duì)引物和探針，最終根據(jù)擴(kuò)增效果(擴(kuò)增效率、靈敏度等)篩選出本發(fā)明的引物和探針。試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明引物和探針的特異性強(qiáng)，能有效從臍帶血、血液與組織樣品中檢測(cè)到豬附紅細(xì)胞體核酸。(4)陽性對(duì)照為克隆有豬附紅細(xì)胞體oxaA基因片段的克隆質(zhì)粒pEASY-oxaA，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，質(zhì)粒在紫外分光光度計(jì)OD260nm測(cè)定質(zhì)量濃度，按公式6.02×1023×(Xng/μL×10-9)/DNAlength×660換算為拷貝數(shù)，配制濃度為1.0×105copies/μL～1.0×107copies/μL；其中，克隆質(zhì)粒pEASY-oxaA的構(gòu)建方法如下：①按照天恩澤柱式血液DNAout試劑盒操作說明書提取豬附紅細(xì)胞體滅活疫苗基因組DNA；以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2作為特異性引物擴(kuò)增豬附紅細(xì)胞體oxaA序列，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；95℃變性15Sec，60℃退火30Sec，72℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10min，4℃保溫5min。PCR產(chǎn)物于2％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定；②PCR產(chǎn)物的純化、克隆及序列分析：PCR產(chǎn)物用AXYGEN公司的AxyPrepDNAGelExcractionKit膠回收試劑盒回收，通過TA克隆將oxaA基因片段克隆至pEASY-T1載體，然后轉(zhuǎn)化Trans1-T1PhageResistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含IPTG和X-gal的LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12h-18h。經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，用OMEGA公司的PlasmidMiniKit1質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，然后用引物進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，測(cè)序后比對(duì)成功的克隆質(zhì)粒命名pEASY-oxaA。其中，豬附紅細(xì)胞體oxaA基因片段的大小為130bp，具體序列如下所示：TTGGAAGTCAAGTGAGAACAAAGAGAAGAGTCTACTTCCACCCCTAAGTAGACTTTTTCTTCTAACTCAATATATTGAGTTATTTGTCCGCAACCTGGACCAATTTCTAGTAGGAATTTATATCCAGAAG(SEQIDNO:4序列)；(5)陰性對(duì)照為無DNAase的ddH2O；(6)使用說明書。實(shí)施例2檢測(cè)臍帶血中豬附紅細(xì)胞體的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒的使用方法本發(fā)明試劑盒使用方法具體包括以下步驟：(1)樣品采集；(2)樣品處理；(3)DNA提??；(4)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR：利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)；(5)判定結(jié)果。(1)樣品采集1.取干凈的青霉素瓶和瓶塞，清洗干凈，煮沸滅菌30分鐘，烘干后收集備用；2.當(dāng)仔豬出生時(shí)，將每頭母豬分娩的所有仔豬的“臍帶血”都擠到一個(gè)干凈的青霉素瓶中，每頭仔豬3-5滴即可，將其“臍帶血”擠到青霉素瓶，密封；注意事項(xiàng)：①必須要采集同窩母豬產(chǎn)的所有的仔豬，避免同窩母豬所產(chǎn)仔豬的個(gè)體差異造成漏檢；②可以雙人操作，也可以單獨(dú)操作，若仔豬臍帶血不便擠出，可以將臍帶剪成幾段再操作即可；③若母豬分娩出現(xiàn)木乃伊，死胎時(shí)，同窩仔豬臍帶血重點(diǎn)檢測(cè)；④弱仔的臍帶血可以另外單獨(dú)再收集一份，重點(diǎn)檢測(cè)；3.臍帶血收集完后蓋好瓶塞，用標(biāo)簽紙或者醫(yī)用白膠布在青霉素瓶做好標(biāo)記，注明采集時(shí)間、母豬耳號(hào)、胎次等信息；4.將收集的臍帶血的青霉素瓶放至-20°冰箱冷凍保存，送至實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，并附上采集臍帶血樣品的數(shù)量、母豬耳號(hào)、需要檢測(cè)項(xiàng)目的清單。(2)DNA提取根據(jù)商品化血液DNA提取試劑盒的說明書進(jìn)行待檢臍帶血樣品的DNA提取，備用；組織樣品的DNA提取依照商品化動(dòng)物組織DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。(3)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化原則為：通過優(yōu)化使同一樣本獲得最大的擴(kuò)增效率和最小的Ct值。經(jīng)過優(yōu)化，實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下所示：實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系：SEQIDNO:1所示的上游擴(kuò)增引物oxaA-F(10μM)：0.4～0.8μL；SEQIDNO:2所示的下游擴(kuò)增引物oxaA-R(10μM)：0.4～0.8μL；SEQIDNO:3所示的特異性熒光探針oxaA-P(10μM)：0.2～0.4μL；2×熒光PCR反應(yīng)液(含酶)：10μL；DNA模板：2μL；ddH2O：補(bǔ)足至20μL。實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)條件為：50℃酶激活2min；95℃預(yù)變性5min；循環(huán)步驟95℃變性15Sec，60℃退火30Sec并收集熒光，共40個(gè)循環(huán)；最后25℃冷卻10sec，結(jié)束反應(yīng)；同時(shí)設(shè)有陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，陰性對(duì)照和陽性對(duì)照的加入量均為2μL。(4)判定結(jié)果質(zhì)量控制：陰性對(duì)照FAM通道檢測(cè)無Ct值；陽性對(duì)照FAM通道檢測(cè)Ct值≤30；上述條件同時(shí)滿足，檢測(cè)結(jié)果有效；結(jié)果判定：FAM通道檢測(cè)Ct值≤40，則判定樣品為豬附紅細(xì)胞體感染陽性；FAM通道檢測(cè)無Ct值，則判定樣品為豬附紅細(xì)胞體感染陰性。實(shí)施例3檢測(cè)臍帶血中豬附紅細(xì)胞體的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒的驗(yàn)證1.試劑盒擴(kuò)增效率驗(yàn)證對(duì)陽性對(duì)照克隆質(zhì)粒pEASY-oxaA進(jìn)行10倍梯度稀釋，使其拷貝數(shù)為：108-101copies/μl，每個(gè)梯度重復(fù)三次進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖1為本發(fā)明陽性對(duì)照10倍稀釋的梯度擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線(FAM通道)，其中該標(biāo)準(zhǔn)曲線的參數(shù)如下：斜率：-3.20，截距：40.57，相關(guān)系數(shù)：0.999，擴(kuò)增效率：1.05。說明該試劑盒檢測(cè)豬附紅細(xì)胞體的擴(kuò)增效率接近100％。2.靈敏度試驗(yàn)以10倍梯度稀釋的陽性對(duì)照克隆質(zhì)粒pEASY-oxaA作為模板，進(jìn)行本發(fā)明試劑盒的靈敏度檢測(cè)，檢測(cè)范圍為109-101copies/μL。結(jié)果表明，該方法的檢測(cè)范圍為109-101copies/μL，在此范圍的豬附紅細(xì)胞體檢測(cè)可以得到可靠的結(jié)果，即該方法的靈敏度可以檢測(cè)到最低10copies的豬附紅細(xì)胞體核酸，靈敏度是常規(guī)PCR方法的300倍，檢測(cè)結(jié)果見圖2。3.特異性研究為了檢測(cè)本發(fā)明試劑盒的特異性，利用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)豬細(xì)小病毒，豬圓環(huán)病毒，豬偽狂犬病毒，豬附紅細(xì)胞體，豬弓形體，豬肺炎支原體等6種病毒。檢測(cè)結(jié)果表明：本發(fā)明的試劑盒僅對(duì)豬附紅細(xì)胞體進(jìn)行特異性擴(kuò)增，不與其它核酸發(fā)生交叉反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果見圖3。4.準(zhǔn)確性研究同時(shí)采用本發(fā)明的試劑盒以及基于16SrRNA的常規(guī)PCR方法對(duì)63份臨床臍帶血樣品、10份豬附紅細(xì)胞體陽性血樣以及10份陰性血樣進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見表1。表1采用本發(fā)明試劑盒以及普通PCR對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的比較從表1中可以看出：對(duì)于陽性樣品與陰性樣品的檢測(cè)，本試劑盒實(shí)時(shí)熒光PCR方法與16SrRNAPCR方法檢測(cè)結(jié)果100％符合；對(duì)于臨床樣品的檢測(cè)，本試劑盒實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)陽性9/63，16SrRNAPCR方法檢測(cè)陽性7/63，且后者檢測(cè)的7份樣品使用前者檢測(cè)均為陽性，本試劑盒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)比普通PCR檢測(cè)更敏感，準(zhǔn)確度高。5.重復(fù)性研究選用陽性對(duì)照pEASY-oxaA克隆質(zhì)粒106、105、104copies/μL，對(duì)每個(gè)濃度的樣本做3個(gè)重復(fù)，結(jié)果不同核酸濃度的檢測(cè)變異系數(shù)(CV)均小于1％，具有較好的重復(fù)性。檢測(cè)結(jié)果見表2和圖4。表2實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)豬附紅細(xì)胞體的重復(fù)性試驗(yàn)質(zhì)?？截悢?shù)(copies/μL)106105104Ct118.2021.6024.72Ct218.0421.5024.72Ct318.1821.5024.72CtMean18.1421.5324.72SD0.0870.0580CV0.48％0.27％0綜上可見，本發(fā)明設(shè)計(jì)的一對(duì)特異性引物和一條特異性熒光探針以及構(gòu)成的試劑盒可以快速鑒定臍帶血中的豬附紅細(xì)胞體，而且該檢測(cè)方法簡單、快速、特異性好、靈敏度高、可重復(fù)性好，檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可靠。所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：以上任何實(shí)施例的討論僅為示例性的，并非旨在暗示本公開的范圍(包括權(quán)利要求)被限于這些例子；在本發(fā)明的思路下，以上實(shí)施例或者不同實(shí)施例中的技術(shù)特征之間也可以進(jìn)行組合，并存在如上所述的本發(fā)明的不同方面的許多其它變化，為了簡明它們沒有在細(xì)節(jié)中提供。因此，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何省略、修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。。序列表<110>湖南新南方養(yǎng)殖服務(wù)有限公司<120>一種檢測(cè)臍帶血中豬附紅細(xì)胞體的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒及其用途<130>FI160637-ND<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1ttggaagtcaagtgagaacaa21<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>2cttctggatataaattcctactagaaa27<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>3tccaggttgcggacaaataactcaat26<210>4<211>130<212>DNA<213>EperythrozoonoxaA基因序列<400>4ttggaagtcaagtgagaacaaagagaagagtctacttccacccctaagtagactttttct60tctaactcaatatattgagttatttgtccgcaacctggaccaatttctagtaggaattta120tatccagaag130當(dāng)前第1頁1 2 3