本發(fā)明屬于食品檢測和動(dòng)物分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種qPCR鑒定羊肉的方法，適用于鑒定未知樣品是否為羊肉或是否含有羊肉或羊的其他組織成份。

背景技術(shù)：

隨著我國人民生活水平的提高，對(duì)肉類的需求量越來越多，為不法經(jīng)營者乘虛而入創(chuàng)造了條件。因此，有必要確立一種肉源性成份鑒定方法。DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (polymerase chain reaction，PCR) 是20世紀(jì)80年代發(fā)明的分子生物學(xué)技術(shù)，集高度特異性、靈敏性、高效性為一體，廣泛應(yīng)用于涉及生物的諸多領(lǐng)域，如物種鑒定、親子鑒定以及食品/藥品等諸多產(chǎn)品中源自生物的成份及其含量的分析。PCR分為傳統(tǒng)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qPCR)。

與傳統(tǒng)PCR耗時(shí)較長相比，qPCR雖有成本高的特點(diǎn)，但因具有檢測時(shí)間短，靈敏度高等的特點(diǎn)倍受使用者的青睞。本發(fā)明自行設(shè)計(jì)一組引物并建立了一種qPCR鑒定羊肉的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一種qPCR鑒定羊肉的方法，適用于檢測未知樣品是否為羊肉或是否含有羊肉或羊的其他組織成份。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：1) 設(shè)計(jì)引物1組 (上游引物：5′-tctctcctaggcatttgctta-3′，下游引物P2：5′-cccgtcctacatgcatgaat-3′，濃度均為2 pmol/μL)；2) 將樣品總DNA的濃度調(diào)至20 ng/ μL作為檢測模板；3) 使用步驟1) 的引物和步驟2) 的模板實(shí)施qPCR；4) 根據(jù)qPCR的Ct值判斷樣品是否為羊肉或是否含有羊肉或羊的其他組織成份。

所述實(shí)施qPCR，其特征在于qPCR反應(yīng)體系為10 μL (2×qPCR Master mix：5μL；上、下游引物各0.5μL；模板DNA：0.5μL；滅菌純水3.5μL)。

所述實(shí)施qPCR，其特征還在于qPCR程序?yàn)椋?5℃變性/3 s，62℃退火/30 s，72℃延伸反應(yīng)/25 s，40次循環(huán)。

所述根據(jù)qPCR的Ct值判斷樣品是否為羊肉或是否含有羊肉或羊的其他組織成份, 其特征在于Ct值介于15～31時(shí)出現(xiàn)特異性SYBR熒光信號(hào)，則表明檢測樣品是羊肉或含有羊肉或羊的其他組織成份；反之不是羊肉或不含有羊肉或羊的其他組織成份。

采用上述技術(shù)方案，能夠快速鑒定羊肉成份，該發(fā)明可直接用于生產(chǎn)鑒定肉成份的試劑盒。

附圖說明

圖1示出羊肉引物與豬肉、豬肝和牛肉特異性實(shí)驗(yàn)比較結(jié)果。

圖2示出將20 ng/μL的羊肉總DNA連續(xù)稀釋10倍的樣品qPCR檢測的極限濃度。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步說明使用本發(fā)明的引物結(jié)合qPCR鑒定羊肉的優(yōu)異效果。本發(fā)明使用KAPA Biosystems公司試劑盒——KAPA SYBR Fast qPCR Kit Master Mix (2×) Universal 和Agilent StrataGene Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，但并不限制本發(fā)明使用其他公司的qPCR試劑與儀器設(shè)備。

實(shí)施例1

制備完全相同的3組（每組4個(gè)樣品，分別以羊肉、豬肉、豬肝和牛肉總DNA為模板，其他條件相同) 共計(jì)12管10 μL PCR反應(yīng)體系：2× KAPA SYBR Fast qPCR Master mix：5 μL；上、下游引物P1和P2各0.5μL；模板DNA：0.5μL；滅菌純水3.5μL。然后按PCR程序：95℃變性/3 s，62℃退火/30 s，72℃延伸反應(yīng)/25 s，40次循環(huán)，實(shí)施qPCR。圖1示出僅在以羊肉總DNA為模板的PCR樣品中檢測到信號(hào)，Ct值為18，而以牛肉總DNA為模板進(jìn)行qPCR樣品中，Ct值為34～38，表明本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物優(yōu)良特異性。

實(shí)施例2

制備完全相同的3組（每組5個(gè)樣品，分別以2 ng/μL、0.2 ng/μL、0.02 ng/μL、2 pg/μL和0.2 pg/μL的羊肉總DNA為模板，其他條件相同) 共計(jì)15管10 μL PCR反應(yīng)體系：2× KAPA SYBR Fast qPCR Master mix：5 μL；上、下游引物P1和P2各0.5μL；模板DNA：0.5μL；滅菌純水3.5μL。然后按PCR程序：95℃變性/3 s，62℃退火/30 s，72℃延伸反應(yīng)/25 s，40次循環(huán)實(shí)施qPCR。圖2示出當(dāng)羊肉總DNA濃度稀釋至2 pg/μL時(shí)，Ct值為31，qPCR仍能夠很好地鑒定出檢測樣品是羊肉.。