本發(fā)明提供了一種用于快速檢測耐藥結核分枝桿菌EmbB基因A233G突變的特異性引物組，屬于耐藥結核分支桿菌突變技術領域。

背景技術：

結核病是一種嚴重危害人類健康的慢性傳染病，主要是結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染導致。據(jù)WHO統(tǒng)計，結核分枝桿菌感染是傳染病界的頭號殺手，全球現(xiàn)有結核病患者約2000萬，其中90%左右為肺結核患者。2014年，兒童約有100萬結核病患者，約14萬死亡病例。由此可見，結核病的發(fā)生和傳染對全球社會和經(jīng)濟造成了嚴重的影響。

近年來由于抗結核藥物的長期使用及濫用，導致耐藥結核菌的產(chǎn)生。分為單耐藥結核、多耐藥結核（MDR-TB，Multidrug-resistant TB）和泛耐藥結核（XDR-TB，Extensively drug-resistant TB），單耐藥結核菌指針對單一藥物耐受，多耐藥結核為至少對異煙肼（Isonicotinic acid hydrazide，INH）、利福平（Rifampicin，RFP）耐藥，泛耐藥結核為至少對兩種主要一線抗結核藥物異煙肼、利福平耐藥外，還對任何氟喹諾酮類（Quinolones）抗生素產(chǎn)生耐藥，以及三種二線抗結核注射藥物中的至少一種耐藥。目前研究表明，結核分枝桿菌基因突變是其產(chǎn)生耐藥性的主要原因。

乙胺丁醇（Ethambutol，EMB）與異煙肼、利福平、吡嗪酰胺（Pyrazinamide， PZA）等屬于一線抗結核藥物，常聯(lián)用治療結核病。該藥物可干擾細胞壁阿拉伯半乳聚糖的合成，抑制細胞壁阿拉伯聚糖層阿拉伯半乳聚糖和脂質(zhì)阿拉伯甘露聚糖的聚合作用，誘導D-阿拉伯呋喃糖殘基的積累。已經(jīng)證實結核分枝桿菌EmbB基因突變可導致乙胺丁醇耐藥，該基因全長3285 bp，編碼阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶主要成分（阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因Emb 操縱子由EmbA、EmbB、EmbC三部分組成）。Brossier等發(fā)現(xiàn)EmbB基因的306（A916G、A916T、G918S和G918C）和406（G1217C）位氨基酸突變，改變了所編碼酶的結構，由此產(chǎn)生耐藥。EmbB基因第78位密碼子（A233G）突變是我們新發(fā)現(xiàn)的耐乙胺丁醇的突變，之前沒有相關報道。

目前市場上已有的結核分枝桿菌耐乙胺丁醇藥物突變檢測試劑盒所用方法與本發(fā)明不同，這些試劑盒均以熒光定量PCR技術或一代測序技術為基礎，無論儀器還是試劑，均比普通PCR使用成本高出很多，不適合在常規(guī)的實驗室及醫(yī)院中推廣使用。等位基因特異PCR（Allele-specific PCR，AS-PCR）方法操作簡便、快速，所需實驗器材簡單，實驗試劑經(jīng)濟，因此該方法被廣泛的應用于DNA突變或單核苷酸多態(tài)性（SNP）的檢測。本發(fā)明不僅提供了簡便、快速、經(jīng)濟的突變檢查方法，還增加了突變的檢查范圍。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速、簡易、經(jīng)濟的檢測耐藥結核分枝桿菌EmbB基因A233G突變的AS-PCR特異性引物，其中EmbB 233-F EmbB 233G-R是檢測EmbB基因A233G突變的特異性引物，EmbB 233-F和EmbB 233A-R是檢測野生型菌株EmbB基因的特異性引物，16S 915-F和16S 1018-R為內(nèi)參引物，引物序列如下：

；

該方法基于AS-PCR的原理，將檢測突變型引物中的反向引物的3′端設計為C，并且在引物3′端第二位引入一個錯配堿基（將堿基G突變成堿基A，形成A/C錯配），以增強引物對突變DNA模板擴增的特異性，為確定突變是純合突變或雜合突變，同時用一對檢測野生型樣本的引物進行檢測，將檢測野生型引物中的反向引物的3′端第四位引入一個錯配堿基（將堿基A突變成堿基G，形成G/T錯配）；同時，在結核分枝桿菌16S rRNA的相對保守的區(qū)域中的915-1018區(qū)段還設計了一對內(nèi)參引物（見上表，16S 915-F/1018-R），用于監(jiān)測PCR擴增反應體系是否合適及反應是否正常進行擴增。采用上述2對AS-PCR引物（EmbB 233-F/233G-R和EmbB233-F/233A-R）及一對內(nèi)參引物對待測標本DNA進行PCR擴增。設計檢測突變的引物只能擴增出含有突變的樣本，不能擴增出野生型的樣本；而設計檢測野生型的引物，只能擴增出野生型的樣本，不能擴增出含有突變的樣本，并且無論樣品中是否包含突變，均加入內(nèi)參引物16S 915-F/1018-R，這樣就避免了由于PCR失敗而造成的假陰性的檢測結果。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，依據(jù)能否擴增出目的片段來實現(xiàn)基因突變簡便、快速的檢測。

為確定AS-PCR方法檢測耐乙胺丁醇突變的特異性和靈敏度，選取14個野生型樣本及所有突變型樣本進行引物特異性檢測，同時對所有突變位點構建了陽性質(zhì)粒，對不同拷貝數(shù)的陽性質(zhì)粒進行擴增，以確定其靈敏度，并提供本技術檢測到的最低水平的突變DNA的技術參數(shù)。

本發(fā)明利用等位基因特異PCR（Allele-specific PCR，AS-PCR）方法檢測結核分枝桿菌在EmbB233位突變位點，具體步驟如下：

（1）DNA提?。菏褂迷噭┖蟹◤慕Y核分枝桿菌臨床分離株中提取基因組DNA；

（2）以步驟（1）提取的基因組DNA為模板，進行PCR反應；

PCR反應引物：擴增引物序列及產(chǎn)物大小見上表；

PCR反應體系：總體系為20 μL，包含30 ng基因組DNA，10 μL 2×TSINGKE^TM Master Mix，AS-PCR引物和內(nèi)參引物中的正反向引物各0.5 μM，余下用dd H₂O補齊；

PCR反應程序：95℃，預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，重復35個循環(huán)；72℃延伸5 min。

（3） PCR產(chǎn)物檢測：取PCR產(chǎn)物2.5 μL在2 %的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳緩沖液為1×TAE，120 V恒壓電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。

（4）靈敏度檢測

使用構建成功的陽性質(zhì)粒作為模板，設置三個梯度（即3000、10⁴和10⁵個拷貝）用以檢測出本技術所能檢測到的最低水平的突變DNA的技術參數(shù)，并且使用10⁶個拷貝作為陽性對照；按照與步驟（2）和（3）相同的PCR反應體系和程序擴增并檢測。

（5）特異性實驗

本發(fā)明為了驗證AS-PCR引物的特異性，隨機的選擇了14個野生型樣本對突變型AS-PCR引物進行測試，并用野生型AS-PCR引物對所有突變型樣本進行檢測；并且在進行每一個特異性試驗中我們都加入了內(nèi)參；將模板按照與步驟（2）和（3）相同的PCR反應體系和程序擴增并檢測。

本發(fā)明與其它現(xiàn)有技術相比，具有快速、簡單、經(jīng)濟、準確、靈敏的特點，儀器設備要求不高，適合于在大規(guī)模的臨床樣本檢測中推廣應用；本發(fā)明對于結核分枝桿菌耐藥性研究中具有重要意義。

附圖說明

圖1為本發(fā)明方法的靈敏度檢測電泳圖譜；

圖2為本發(fā)明方法的特異性實驗電泳圖譜。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明保護范圍不局限于所述內(nèi)容，實施例中方法如無特殊說明的采用常規(guī)方法，使用的試劑如無特殊說明的使用常規(guī)市售試劑或按常規(guī)方法配制的試劑。

1、引物設計

基于AS-PCR的原理，將檢測突變型引物中的反向引物的3′端設計為C，并且在引物3′端第二位引入一個錯配堿基（將堿基G突變成堿基A，形成A/C錯配），以增強引物對突變DNA模板擴增的特異性，為確定突變是純合突變或雜合突變，同時用一對檢測野生型樣本的引物進行檢測，將檢測野生型引物中的反向引物的3′端第四位引入一個錯配堿基（將堿基A突變成堿基G，形成G/T錯配），擴增出大小為151bp的片段；同時，在結核分枝桿菌16S rRNA的相對保守的區(qū)域中的915-1018區(qū)段還設計了一對內(nèi)參引物（16S 915-F/1018-R），并且無論樣品中是否包含突變，內(nèi)參引物16S 915-F/1018-R都會擴增出一條104 bp的片段。

2、樣本采集

采集經(jīng)測序證實攜帶有EmbB233位突變位點的DNA樣本和野生型樣本。

3、樣品基因組DNA提取

使用試劑盒法提取結核桿菌臨床分離株基因組DNA。

4、PCR擴增

PCR反應體系：總體系為20 μL，包含30 ng基因組DNA，10 μL 2×TSINGKE^TM Master Mix，AS-PCR引物和內(nèi)參引物中的正反向引物各0.5 μM，余下用dd H₂O補齊；

PCR反應程序：95℃，預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，重復35個循環(huán)；72℃延伸5 min；

5、PCR產(chǎn)物檢測

PCR產(chǎn)物檢測：取PCR產(chǎn)物2.5 μL在2 %的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳緩沖液為1×TAE，120 V恒壓電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。

6、靈敏度檢測

使用構建成功的陽性質(zhì)粒作為模板，設置三個梯度（即3000、10⁴和10⁵個拷貝）用以檢測出本技術所能檢測到的最低水平的突變DNA的技術參數(shù)，并且使用10⁶個拷貝作為陽性對照。按照與步驟4和5相同的PCR反應體系和程序擴增并檢測。

發(fā)明方法進行等位基因特異PCR檢測結核分枝桿菌EmbB233位突變位點的靈敏度實驗的電泳結果（見圖1）。

圖1中，泳道1、3、5、7、9、11、13和15使用含有突變的質(zhì)粒作為模板，泳道2、4、6、8、10、12、14和16使用不含突變的質(zhì)粒作為模板；泳道1、2、5、6、9、10、13和14使用檢測野生型引物（即EmbB 233-F/ EmbB 233A-R），泳道3、4、7、8、11、12、15和16使用檢測突變型引物（即EmbB 233-F/ EmbB 233G-R）；泳道1-4的陽性質(zhì)粒拷貝數(shù)為3000，泳道5-8的陽性質(zhì)?？截悢?shù)為10⁴，泳道9-12的陽性質(zhì)粒拷貝數(shù)為10⁵，泳道13-16的陽性質(zhì)?？截悢?shù)為10⁶（即陽性對照）。泳道M為2000 bp的核酸分子量標準，泳道17為陰性對照（用不含結核分枝桿菌DNA的dd H₂O作為模板）。

圖1中檢測野生型的引物只能同野生型樣本共同擴增出大小為151bp的條帶，同樣檢測突變型引物只能同含有相應突變型的樣本共同擴增出大小為151bp的條帶，與預期效果相同。模板拷貝數(shù)由低到高時，可以明顯的看出條帶由微弱到明亮的變化。在3000拷貝數(shù)的質(zhì)粒作為模板時，條帶同Marker相比，泳道2可以看到稍弱的條帶，而泳道3幾乎看不見條帶，說明在3000拷貝數(shù)的質(zhì)粒作為模板時，檢測突變的引物進行PCR后用瓊脂糖凝膠電泳不能有效檢測突變，表明檢測突變型引物在模板量較少的情況下不能有效工作；在10⁴拷貝數(shù)的質(zhì)粒作為模板時，條帶同Marker相比，泳道6可以看到明顯的條帶，而泳道7可以看到微弱的條帶，說明在10⁴拷貝數(shù)的質(zhì)粒作為模板時，此引物進行PCR后用瓊脂糖凝膠電泳可以檢測突變，但條帶微弱；在10⁵拷貝數(shù)的質(zhì)粒作為模板時，條帶同Marker相比，泳道10和泳道11均可看到明顯的條帶，說明在10⁵拷貝數(shù)的質(zhì)粒作為模板時，此引物進行PCR后用瓊脂糖凝膠電泳可以檢測突變且條帶明亮。綜上，用于檢測EmbB A233G的兩對AS-PCR引物檢測下線在10⁴個拷貝數(shù)。

7、特異性實驗

本發(fā)明為了驗證AS-PCR引物的特異性，隨機的選擇了14個野生型樣本對AS-PCR引物進行測試，并用野生型AS-PCR引物對所有突變型樣本進行檢測，并且在進行每一個特異性試驗中我們都加入了內(nèi)參；將模板按照與步驟4和5相同的PCR反應體系和程序擴增并檢測。

用本發(fā)明方法進行等位基因特異PCR檢測結核分枝桿菌EmbB233位突變位點的特異性實驗的電泳結果（見圖2）。圖2表示用野生型樣本對檢測EmbB A233G突變的AS-PCR引物進行測試。

圖2中，泳道1-14使用的均為野生型樣本；A圖使用的是檢測野生型的AS-PCR引物（即EmbB 233-F/233A-R），而B圖使用的是檢測突變型的引物（即EmbB 233-F/233G-R）；泳道M為2000bp的核酸分子量標準，泳道15為陰性對照（用不含結核分枝桿菌DNA的dd H₂O作為模板）。

圖2-A中，用檢測野生型AS-PCR引物EmbB 233-F/233A-R對隨機挑選的14個野生型樣本進行擴增，均能擴增出明亮且大小為151bp的條帶，且內(nèi)參引物均能擴增出明亮且大小為104bp的條帶；圖2-B中，用檢測突變型AS-PCR引物EmbB 233-F/233G-R對隨機挑選的14個野生型樣本進行擴增，僅有內(nèi)參引物所擴增出的條帶；由此，可以得出用于檢測EmbB A233G的兩對AS-PCR引物具有良好的特異性。

序列表

<110>昆明理工大學

<120>用于檢測耐藥結核分枝桿菌EmbB基因A233G突變的特異性引物

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 1

gggctgattg gctttgtg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 2

gcacggtggc ggtaaaac 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 3

gcacggtggc ggtagagt 18

<210>4

<211> 18

<212> DNA

<213>人工合成

<400>4

cgcacaagcg gcggagca 18

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

gccacaaggg aacgcctatc t 21