本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及與中國(guó)山羊產(chǎn)奶性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記、以及檢測(cè)中國(guó)山羊產(chǎn)奶性狀的方法。

背景技術(shù)：

單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(SNP)主要是指在基因組脫氧核酸(DNA)序列上由單個(gè)脫氧核苷酸的變異所引起的DNA片段的多態(tài)性。SNP的多態(tài)性僅涉及到單個(gè)堿基的變異，表現(xiàn)的形式有替換、插入和缺失等。SNP的檢測(cè)方法，目前常用的包括，sanger測(cè)序、DNA芯片、飛行時(shí)間質(zhì)譜、以及最新的高通量二代測(cè)序等技術(shù)。通過(guò)檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記檢測(cè)基因型是近些年興起的一種方法。SNP作為遺傳標(biāo)記已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于基因定位、克隆、遺傳育種以及遺傳多樣性等研究領(lǐng)域。分子標(biāo)記在動(dòng)物育種中的應(yīng)用已有一段時(shí)間，相比傳統(tǒng)育種方法，分子育種大大加快了選育效率，節(jié)省了育種時(shí)間，使得育種學(xué)家可以在分子水平上不斷探索并選育更優(yōu)良的家畜品種。

山羊是一種很早就被馴化的家畜，為人類文明的發(fā)展作出了重大貢獻(xiàn)，在馴化過(guò)程中，形成了多種多樣的品種，且表型差異很大，如毛色、體型、繁殖力、泌乳能力等。借助高通量技術(shù)尋找影響表型性狀的特定的基因組區(qū)域已成為動(dòng)物遺傳學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。雖然我國(guó)的羊奶產(chǎn)量逐年增長(zhǎng)，但是羊奶在奶類中所占的比例反而處于下降趨勢(shì)，說(shuō)明奶山羊育種工作力度有待加強(qiáng)。

真核翻譯起始因子4γ1(eukaryotic translation initiation factor 4gamma 1，EIF4G1)，主要參與RNA的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，可與真核翻譯起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E，EIF4E)互作，影響mTORC1介導(dǎo)的mRNA翻譯的起始，而翻譯的起始是對(duì)于乳蛋白合成至關(guān)重要的mTOR信號(hào)通路的核心部分，因此該基因的突變可能會(huì)影響山羊的產(chǎn)奶性狀。

鑒于此，本發(fā)明利用奶山羊引進(jìn)品種和中國(guó)奶山羊培育品種進(jìn)行全基因組掃描和產(chǎn)奶性狀關(guān)鍵基因的定位，發(fā)現(xiàn)EIF4G1基因座位的多態(tài)性變異對(duì)奶山羊引進(jìn)品種和中國(guó)奶山羊培育品種產(chǎn)奶性狀的影響達(dá)到全基因組顯著水平，為培育具有強(qiáng)泌乳能力的專門化奶山羊品種提供理論基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種輔助鑒定中國(guó)山羊產(chǎn)奶性狀的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于檢測(cè)與中國(guó)山羊產(chǎn)奶性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記的引物及含有該引物的試劑盒。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了一種與中國(guó)山羊產(chǎn)奶性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記，所述SNP標(biāo)記位于山羊第1號(hào)染色體第81243942bp處，該SNP分子標(biāo)記的多態(tài)性為A/G。

發(fā)明人對(duì)引進(jìn)奶山羊和中國(guó)培育奶山羊品種及來(lái)自不同地區(qū)和品種的中國(guó)非奶用山羊進(jìn)行了大量的基因型與產(chǎn)奶性狀相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所提供的SNP位點(diǎn)在不同泌乳能力的山羊群體中基因頻率差異顯著。等位基因A在奶山羊中的頻率均在72％以上，而在非奶用山羊中該等位基因頻率均在8％以下，在非奶用山羊品種之一的遼寧絨山羊中最低，為0％，這對(duì)于通過(guò)基因型區(qū)分和篩選不同泌乳能力的中國(guó)山羊具有較大的指導(dǎo)意義。當(dāng)中國(guó)山羊的基因型為AA時(shí)該山羊泌乳能力較強(qiáng)，當(dāng)中國(guó)山羊的基因型為GG時(shí)可以判定山羊泌乳能力差，不適于作為奶用山羊進(jìn)行早期選育，可以加速奶用山羊的育種進(jìn)程。

本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)本發(fā)明所述SNP分子標(biāo)記的特異性引物，包括：

正向引物：5’-CTCAGTTCCATCACGGGGTC-3’；(SEQ ID NO.2)

反向引物：5’-CTGCGAAAGGTGTGTGTTCC-3’(SEQ IDNO.3)。

本發(fā)明提供了所述SNP分子標(biāo)記在中國(guó)山羊育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的與中國(guó)山羊產(chǎn)奶性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記在中國(guó)山羊分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明提供了所述SNP分子標(biāo)記在鑒定中國(guó)山羊產(chǎn)奶性狀中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供一種檢測(cè)中國(guó)山羊產(chǎn)奶性狀的方法，包括以下步驟：

(1)提取待測(cè)山羊基因組DNA，以其為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物片段；

(2)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物片段的第219bp處的堿基種類，若堿基種類為A，則待測(cè)山羊泌乳能力較強(qiáng)，其為奶用山羊，若堿基種類為G，則判定待測(cè)山羊泌乳能力差，為非奶用山羊；

所述特異性引物包括：

正向引物：5’-CTCAGTTCCATCACGGGGTC-3’；

反向引物：5’-CTGCGAAAGGTGTGTGTTCC-3’。

其中，步驟(1)中PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以25μl計(jì)為：50-100ng/μl模板DNA 2μl，10pmol/μl正向引物和反向引物各0.5μl，2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，余量為雙蒸水。

其中，步驟(1)中PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，61℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)；72℃保溫10分鐘。

本發(fā)明對(duì)于檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段的方法沒(méi)有特別的限制，可以利用本領(lǐng)域常規(guī)的檢測(cè)方法進(jìn)行，優(yōu)選的，可以利用Sanger測(cè)序或飛行質(zhì)譜分型等方法來(lái)檢測(cè)待測(cè)中國(guó)山羊品種的基因型。

本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明所述特異性引物的輔助鑒定中國(guó)奶用山羊的試劑盒。

優(yōu)選的，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。

優(yōu)選的，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。

進(jìn)一步，本發(fā)明提供了上述試劑盒在中國(guó)山羊育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了上述試劑盒在鑒定中國(guó)奶用山羊中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的特異性引物還可以與其他用于中國(guó)山羊產(chǎn)奶性狀檢測(cè)的特異性引物相結(jié)合用于中國(guó)山羊分類和育種研究。

本發(fā)明的與中國(guó)山羊產(chǎn)奶性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用具有如下優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明提供的分子標(biāo)記不受中國(guó)山羊品種、年齡等限制，可用于中國(guó)山羊產(chǎn)奶性狀的早期選育，甚至剛出生即可進(jìn)行準(zhǔn)確地篩選，可顯著促進(jìn)中國(guó)奶用山羊品種的育種進(jìn)程。

(2)檢出中國(guó)山羊品種EIF4G1基因單核苷酸多態(tài)性的方法準(zhǔn)確可靠，操作簡(jiǎn)便。

(3)中國(guó)山羊品種EIF4G1基因的SNP位點(diǎn)的檢出，為中國(guó)山羊產(chǎn)奶性狀的標(biāo)記輔助選擇提供了科學(xué)依據(jù)。

附圖說(shuō)明

圖1為三種基因型測(cè)序峰圖；其中，(a)為AA型；(b)為GG型；(c)為AG型。

圖2為嶗山奶山羊EIF4G1基因座位的SNP位點(diǎn)分型結(jié)果與日均產(chǎn)奶量進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。

實(shí)施例1山羊不同基因型與產(chǎn)奶性狀的全基因組分析

對(duì)引進(jìn)和中國(guó)培育品種共17份奶山羊以及中國(guó)59份非奶用山羊的全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行奶山羊-非奶用山羊的全基因組掃描分析，發(fā)現(xiàn)位于綿羊第1號(hào)染色體第81243942堿基對(duì)的SNP與產(chǎn)奶性狀最為密切相關(guān)(費(fèi)雪檢驗(yàn)P<0.001)。

實(shí)施例2中國(guó)山羊EIF4G1基因多態(tài)性位點(diǎn)的鑒定

1、提取待測(cè)山羊品種的基因組DNA

采集來(lái)自中國(guó)各地方62只奶山羊(包括20只來(lái)自黑龍江綏棱縣的吐根堡奶山羊，42只來(lái)自山東青島的嶗山奶山羊)和70只非奶用山羊(包括18只來(lái)自遼寧的遼寧絨山羊，14只來(lái)自新疆的南疆絨山羊，19只來(lái)自西藏的班戈白絨山羊，19只來(lái)自西藏的日土白絨山羊)的血樣，采用常規(guī)的方法提取血液中的基因組DNA。

2、擴(kuò)增含SNP位點(diǎn)的核苷酸片段

針對(duì)實(shí)施例1中篩選到的EIF4G1基因座位的SNP位點(diǎn)，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的EIF4G1基因座位(Gene ID:102183267)的序列設(shè)計(jì)引物，包括正向引物F：5’-CTCAGTTCCATCACGGGGTC-3’和反向引物R：5’-CTGCGAAAGGTGTGTGTTCC-3’，以1中的基因組DNA為模板，擴(kuò)增出待測(cè)SNP所在的核苷酸片段，如SEQ ID NO.1所示。該SNP位點(diǎn)位于PCR擴(kuò)增片段的219bp處，此處堿基為A或G。

其中PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以25μl計(jì)為：50-100ng/μl模板DNA 2μl，10pmol/μl正向引物和反向引物各0.5μl，2×Taq PCRMasterMix 12.5μl，余量為雙蒸水。

其中PCR反應(yīng)的條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，61℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)；72℃保溫10分鐘。3、檢測(cè)PCR擴(kuò)增片段，獲得SNP標(biāo)記

對(duì)2中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序檢測(cè)，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列中第219bp處的堿基為A，則待測(cè)中國(guó)山羊泌乳能力較強(qiáng)，屬于奶用山羊。山羊DNA樣品三種基因型的Sanger測(cè)序峰圖如圖1所示。個(gè)體基因型可分為AA型，GG型和AG型。三種基因型的分型結(jié)果如圖1所示。

實(shí)施例3對(duì)132只引進(jìn)及中國(guó)山羊的EIF4G1基因座位的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)大群體分析

按照實(shí)施例2提取62份奶山羊和70只非奶用山羊的基因組DNA樣品采用實(shí)施例2的特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，再進(jìn)行基于Sanger測(cè)序的基因型分型檢測(cè)。70只非奶用山羊分別是遼寧絨山羊，南疆絨山羊，班戈白絨山羊，日土白絨山羊；62只奶山羊分別是吐根堡奶山羊，嶗山奶山羊。EIF4G1基因如SEQ ID NO.1所示序列的219bp位點(diǎn)的基因型分型結(jié)果如表1所示。該SNP位點(diǎn)在奶山羊中的等位基因A的頻率均高達(dá)72％以上。非奶用山羊中該等位基因A的頻率均低于8％，在非奶用山羊品種之一的遼寧絨山羊中為0％(如表1所示)。運(yùn)用Fisher exact test在線軟件進(jìn)行的費(fèi)雪精確檢驗(yàn)顯示，等位基因A在奶山羊中的頻率極顯著高于在非奶用山羊中的頻率(p＝4.44e-29)。表明了該SNP位點(diǎn)的等位基因A與中國(guó)山羊產(chǎn)奶性狀的相關(guān)性。

表1 EIF4G1基因的SNP位點(diǎn)在山羊品種中的基因型頻率

實(shí)施例4對(duì)42只中國(guó)嶗山奶山羊的日均產(chǎn)奶量與EIF4G1基因座位的多態(tài)性位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析

按照實(shí)施例3對(duì)42只中國(guó)嶗山奶山羊EIF4G1基因座位的SNP位點(diǎn)分型結(jié)果與日均產(chǎn)奶量進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見圖2。根據(jù)42只中國(guó)嶗山奶山羊?qū)υ揝NP位點(diǎn)的分型結(jié)果，26只為AA基因型，16只為AG基因型。該SNP位點(diǎn)AA基因型個(gè)體的日均產(chǎn)奶量顯著高于AG基因型個(gè)體(P＝0.021)，平均增高(0.465±0.194)kg/d。

上述來(lái)源于不同地方的引進(jìn)及中國(guó)山羊品種產(chǎn)奶性狀鑒定結(jié)果表明，山羊產(chǎn)奶性狀基因型判定可以通過(guò)chr1：81243942bp位點(diǎn)的多態(tài)性判定實(shí)現(xiàn)。利用分子標(biāo)記檢測(cè)確定山羊產(chǎn)奶性狀可以加快選育具有較強(qiáng)泌乳能力的山羊，節(jié)省了育種時(shí)間，使得快速獲得具有純合強(qiáng)泌乳能力基因型的優(yōu)良山羊種質(zhì)資源成為可能。

上文雖然已對(duì)本發(fā)明以及其實(shí)施方式做了詳盡的描述，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以對(duì)相應(yīng)的條件等做一些改進(jìn)，這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

序列表

<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所

<120>與中國(guó)山羊產(chǎn)奶性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記及其應(yīng)用

<130> KHP161117119.4

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 401

<212> DNA

<213>山羊

<400> 1

ctcagttcca tcacggggtc tcagtggccc agacacgtgg cactaataag aagtcatcat 60

tggaaagcat aacccctcac actgtccccc ccctcagtcc cagcctcaaa ctcactgatg 120

ggtgggcctg gagggccacc tcgacgcttg tcactgccct tggccattag ctgctgcact 180

tttatgtgct cccgatgctc ctccatctca gcttccttrt ggatttggtc aattgtcttg 240

ggaccctggt cccctcggcg tggcacccag ttgctctgtg ggacaagcca gtcacagggt 300

aattacatca gagaagacca gaccagtgtc aggaagtggg ggctgtgggg tcagaggcag 360

cagactgaca gtggaaaaga gggaacacac acctttcgca g 401

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

ctcagttcca tcacggggtc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

ctgcgaaagg tgtgtgttcc 20