本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)小麥低籽粒蛋白質(zhì)含量的引物、試劑盒、檢測(cè)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著我國(guó)小麥產(chǎn)量的不斷提高，人們對(duì)優(yōu)質(zhì)小麥的需求日益增大，依據(jù)小麥品質(zhì)，我國(guó)將小麥分為強(qiáng)筋小麥、中筋小麥和弱筋小麥，弱筋小麥主要用于生產(chǎn)餅干、糕點(diǎn)和南方饅頭等面制品，小麥籽粒蛋白質(zhì)含量(GPC)是品質(zhì)的重要指標(biāo)，籽粒蛋白含量較低的小麥品種可以作為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)弱筋小麥制品的原料，我國(guó)優(yōu)質(zhì)弱筋小麥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T17893-1999)規(guī)定小麥籽粒粗蛋白含量不超過(guò)11.5％。

由于籽粒蛋白質(zhì)含量必須在收獲后才能進(jìn)行品質(zhì)測(cè)試，且易受環(huán)境條件影響，因此選擇效率較低，分子標(biāo)記輔助選擇可在DNA水平針對(duì)低蛋白質(zhì)含量基因或QTL對(duì)育種材料進(jìn)行選擇，因而可以在苗期進(jìn)行選擇，并且可以克服籽粒蛋白質(zhì)含量鑒定的不穩(wěn)定性，降低表型評(píng)價(jià)的成本，提高弱筋小麥品質(zhì)育種效率。Blanco等(2002)發(fā)現(xiàn)了7個(gè)控制籽粒蛋白質(zhì)含量的QTL位點(diǎn)，分別位于4B、5A、6A、6B、7A和7B染色體上；Prasad等(1999)把控制籽粒蛋白質(zhì)含量的QTL位點(diǎn)定位在2D染色體上；Huang(2006)等利用加倍單倍體群體，在4B和4D染色體上發(fā)現(xiàn)控制籽粒蛋白質(zhì)含量的QTL；Li等(2007)利用含有229個(gè)和485個(gè)家系的兩個(gè)重組自交系群體分別檢測(cè)到3個(gè)和10個(gè)影響籽粒蛋白質(zhì)含量的QTL，分別定位于2B、3A、4A、4D、5B、7A、7B和1A、1B、2A、2D、3A、4B、5A、5D、6B、7D染色體上，以目前公開(kāi)的文獻(xiàn)資料來(lái)看，控制籽粒蛋白質(zhì)含量的基因或QTL較多，但單效應(yīng)值不高，且常規(guī)方法只能在雜交第4代之后才能對(duì)籽粒蛋白質(zhì)含量進(jìn)行檢查，因此增加了育種家對(duì)該性狀選擇的工作量，準(zhǔn)確性和育種效率低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種檢測(cè)小麥低籽粒蛋白質(zhì)含量的引物；

本發(fā)明的另一目的在于提供檢測(cè)小麥低籽粒蛋白質(zhì)含量的試劑盒；

本發(fā)明的第三目的在于提供一種檢測(cè)小麥低籽粒蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：一種檢測(cè)小麥低籽粒蛋白質(zhì)含量的引物，所述引物的上游引物序列如SEQ ID NO：Ⅰ所示，下游引物序列如SEQ ID NO：Ⅱ所示。

一種檢測(cè)小麥低籽粒蛋白質(zhì)含量的試劑盒，所述試劑盒包括如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)小麥低籽粒蛋白質(zhì)含量的引物。

進(jìn)一步地，它還包括：10×PCR buffer、dNTP、Taq DNA polymerase、Mg²⁺和電泳常規(guī)試劑。

一種檢測(cè)小麥低籽粒蛋白質(zhì)含量的方法，它包括以下步驟：

S1.PCR擴(kuò)增：以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，以上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物；

S2.結(jié)果判斷：檢測(cè)步驟S1所得PCR產(chǎn)物的大小，按如下方法確定所述待測(cè)小麥?zhǔn)欠駷榈妥蚜５鞍踪|(zhì)含量：

A.所述PCR產(chǎn)物中含有大小為2013bp的DNA片段，則所述待測(cè)小麥為低籽粒蛋白質(zhì)含量的小麥；

B.所述PCR產(chǎn)物中不含有大小為2013的DNA片段，則所述待測(cè)小麥為非低籽粒蛋白質(zhì)含量的小麥。

進(jìn)一步地，所述大小為2013bp的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：Ⅲ所示。

進(jìn)一步地，所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為54℃。

如上述的方法在篩選和培育低含量小麥籽粒蛋白質(zhì)小麥中的應(yīng)用。具體為篩選低含量小麥籽粒蛋白質(zhì)的小麥品種；培育低小麥籽粒蛋白質(zhì)的小麥品種。

在實(shí)際應(yīng)用中，判斷PCR產(chǎn)物中是否含有目的DNA片段時(shí)，可通過(guò)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(凝膠濃度具體可為1％)，看電泳圖譜上是否含有目的條帶，電泳圖譜上含有目的條帶，則PCR產(chǎn)物中含有目的DNA片段。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提供了一種檢測(cè)小麥低籽粒蛋白質(zhì)含量的引物、檢測(cè)小麥低籽粒蛋白質(zhì)含量的試劑盒、檢測(cè)小麥低籽粒蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)方法及其應(yīng)用。通過(guò)對(duì)80份小麥品種的統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用引物擴(kuò)增出2013bp目的條帶的38份小麥品種GPC變幅為10.2％-15.2％，均值為12.6％，未擴(kuò)增出2013bp的42份小麥品種GPC變幅為15.0％-19.2％，均值為16.4％，方差分析結(jié)果顯示，兩者達(dá)到極顯著水平?？梢?jiàn)，本發(fā)明所提供的檢測(cè)小麥低GPC的方法可靠、簡(jiǎn)便、實(shí)用，在小麥種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和分子標(biāo)記輔助育種中具有重要應(yīng)用前景，同時(shí)為培育小麥低籽粒蛋白質(zhì)含量的小麥品種提供了參考依據(jù)。本發(fā)明在育種雜交第2代即可對(duì)低籽粒蛋白質(zhì)含量進(jìn)行篩選，克服了常規(guī)育種只能在雜交第4代之后才能對(duì)籽粒蛋白質(zhì)含量進(jìn)行檢查，因此減少了育種家對(duì)該性狀選擇的工作量，提高選擇的準(zhǔn)確性和育種效率，是一種高育效、快速的種新技術(shù)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明引物分別對(duì)不同GPC含量的小麥品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果。其中，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，各條帶由大到小依次為5000bp、3000bp、2000bp、1000bp；編號(hào)為1的泳道是使用本發(fā)明引物在低GPC品種川育12中擴(kuò)增出2013bp的DNA片段；編號(hào)為2的泳道是使用本發(fā)明引物在非低GPC品種ZM7186中未擴(kuò)增出2013bp的DNA片段。

圖2為本發(fā)明引物分別對(duì)16個(gè)不同GPC高低的小麥品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果。其中，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，各條帶由大到小依次為5000bp、3000bp、2000bp、1000bp；編號(hào)為泳道1-泳道20的品種分別為：ZM6352，ZM5723，ZM12064，ZM6333，藏春6號(hào)，加查幫達(dá)冬麥，白朗麥，ZM3489，W5293，川麥41，川育12，綿45，綿28白，川育20，川麥51，綿20。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于以下所述。

實(shí)施例1：小麥籽粒GPC的測(cè)定

以表1中80份小麥品種作為實(shí)驗(yàn)材料，采用GB 50095-2010中所示的方法測(cè)定小麥籽粒的GPC。該GPC數(shù)據(jù)為80份小麥品種種植在兩年三點(diǎn)間的均值，種植地力一致。

表1：小麥GPC的測(cè)定結(jié)果及PCR擴(kuò)增條帶

注：表中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物一欄中“+”表示擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶，“-”表示未擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶。

實(shí)施例2：小麥籽粒GPC相關(guān)分子標(biāo)記的合成及檢測(cè)方法

1、小麥GPC相關(guān)分子標(biāo)記的合成

合成由序列表中序列Ⅰ和序列Ⅱ組成的引物，簡(jiǎn)稱GPC-B。

引物GPC-B中上下游引物如下：

GPC-B-F(序列Ⅰ)：5’-CTACCGTACTCTCTCTGATT-3’(序列Ⅲ的第1-20位)；

GPC-B-R(序列Ⅱ)：5’-TGGATCTCGCAGCAAGTTCT-3’(序列Ⅲ的第1992-2013位的反向互補(bǔ)序列)。

2、利用步驟1的分子標(biāo)記檢測(cè)小麥GPC含量的方法

(1)PCR擴(kuò)增

以小麥基因組DNA為模板，采用引物GPC-B分別進(jìn)行PCR。

反應(yīng)體系(20μl)：2.0μL 10×PCR buffer、50ng/μL DNA 1.0μL、2.5mmol/L總dNTPs 2.0μL、濃度為10μmol/L的上游引物(GPC-B-F)0.20μL、濃度為10μmol/L的下游引物(GPC-B-R)0.20μL、5U/μL高保真酶0.4μL、ddH₂O 13.2μL。

采用引物GPC-B進(jìn)行擴(kuò)增的反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性35s；54℃退火35s，72℃延伸1min30s，共循環(huán)34次；最后72℃延伸10min。

反應(yīng)結(jié)束后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1％瓊脂糖凝膠電泳分離，緩沖體系為1×TAE溶液，200V電壓電泳25min，EB染色顯影后照相統(tǒng)計(jì)并保存。

(2)目標(biāo)條帶的測(cè)序與分析

(3)根據(jù)結(jié)果判定待測(cè)小麥?zhǔn)欠駷榈虶PC

用引物對(duì)GPC-B檢測(cè)小麥?zhǔn)欠駷榈虶PC：若所述PCR產(chǎn)物中含有大小為2013bp的DNA片段(序列Ⅲ)，則所述待測(cè)小麥為低GPC小麥；若所述PCR產(chǎn)物中不含有大小為2013bp的DNA片段(序列Ⅲ)，則所述待測(cè)小麥為非低GPC小麥。

實(shí)施例3：引物GPC-B用于檢測(cè)小麥低GPC的有效性驗(yàn)證

用引物GPC-B對(duì)表1中共80份小麥品種進(jìn)行了PCR分析，操作方法同實(shí)施例2中步驟二。根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，參照實(shí)施例2步驟二2(3)中的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷。

結(jié)果如表1所示，部分小麥品種的瓊脂糖凝膠檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，從結(jié)果中可以看出：在這80份小麥品種中，利用引物GPC-B進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)均得到了大小為2013bp的目的條帶(序列Ⅲ)的小麥品種有38份，GPC變幅和均值如表1所示在(10.2％-15.2％)之間均值為12.6％；有42份小麥品種未擴(kuò)增出均大小為2013bp的目的條帶，GPC變幅和均值如表1所示在(15.0％-19.2％)之間均值為16.4％，方差分析結(jié)果顯示，兩者達(dá)到極顯著水品(P<0.01)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所

<120> 一種檢測(cè)小麥低籽粒蛋白質(zhì)含量的引物、試劑盒、檢測(cè)方法及其應(yīng)用

<130> 2016

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctaccgtact ctctctgatt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tggatctcgc agcaagttct 20

<210> 3

<211> 2013

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctaccgtact ctctctgatt ctaaatataa gtctttttag agattccaat atggacgttg 60

gcgtcaaggt cagagatatt ctgctatctt ttcagttttg tcatgtcggt acttatgtga 120

cttgtacttt gatctttatg aaagaaataa gacagtatta ccatgcaaaa aaatatgaac 180

tacatacaga gcaaaatgaa tggatctaca ttctaaaatg tgtctatata catctggata 240

tagtttatat taaaatccct aaaatgaatg gagtatttag gaatagagga agtacataag 300

tttgttccat ataattctca taattatgac ttttttaagt aattacggct tttattatta 360

catgaggtac aatctaccgt accgtacaaa agtttacgtg gttaaatgag caatcggttt 420

cccgtttccc ttccgcgatt acgcttcact tatggttttt ccgttctcgg ttcagcgttc 480

caccgtcgtc gtccaaatac gtactagtac caacagcgtc caaatacacc gtacggcacc 540

gccagaagag gagtctgccg gaaatttagc tcggcattca ctcgtttcct tggcgaagct 600

ggcaagcagc cgccacttac catagatgat ctgctttgac tcgcggcgga aatgtttccc 660

cgaaacgatg aaggggacgg ccggattcgt gggattccgc gaggcagagt aattgaccga 720

tcgccgcatt aaaagaatga atgtacagtg gaaggccggt caggtgcaag gcccggcggc 780

ccttatatat acccgccgcc cgcggctacg acagaatcca tcaaatttcc cgagagagag 840

accgacagcg gtgcccgagc ggaggaagag gcggggagag agagggagag agggagagag 900

atggacgtgg agaaggtgac ggaggtggcg ccggaggtgg acgacgacgg ccgcgtaaga 960

acaggtagcg cacacgactc ccccttgtag agagctccgt tgttcgcggt ttcagttcgt 1020

tggttccttc gcttgatgcc ttccgtctga gccgtgatgc gataccggca aacccgctcg 1080

tccttgtggc gaggaggcat ggccggatgc ggtgttttca ggtccgtgcg tgagaaacgg 1140

taggaagcta ggtagacgac agcggtagaa cagttcatgt ctcggttgca gaggttttag 1200

agggcgatgc tggcgatcaa attggcactc aaaatggatt atatcatact cttgccgatt 1260

tgcctctcaa gtctttaggt acttgaagtg gcaaacttct cgttctgcac cggaatgtca 1320

aaaaaagatt ggcacactgc aaactagtac tagcttggta tgggtagtat cacaaattca 1380

caatcatgga gaaaagaaaa agaattatcg catatcctga aactattgtc ttatagaaca 1440

ttaacacaca ttcttttttc cggaaacaaa cgtccatggt taggacttag gacctggaac 1500

tctgctttga cagaggaaca tgttgtagca gagcaattca aaattttgcc catcgcttgt 1560

gatcagcagc gtagcccagg atccaggcag cgctgtcgct tttagatgtt tgcatgcatg 1620

caggccgagc tagtttagta ctccctccgt cccaaaattc ttgtcttaga tttgtttaga 1680

tacggatgta cctaatacta aaacgtgact tggcagtacc tccatatctt ccccatttct 1740

cttgacagtt gacacatcac ttgtccaact ccaatccaga tgacaaccct gacatcggga 1800

cgaaatacat gcaccctgca tctacatgct ctatctgaaa atcagccatc ccctgagaat 1860

gtgccatcca tggtgtggcg cctctgcgcc attcctttta caacgcccca aatgatggga 1920

accgggttgg tggcatggta ttgatgcagg aattaggtcc aaatgccctg tgtccccgat 1980

ccggtagagc aaaagaactt gctgcgagat cca 2013