本發(fā)明涉及多重基因檢測的試劑盒及其檢測方法，尤其是一種用于他汀類降脂藥個(gè)體化用藥相關(guān)基因SNP檢測的試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
：他汀類藥物，(statins)，是羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，此類藥物通過競爭性抑制內(nèi)源性膽固醇合成限速酶(HMG-CoA)還原酶，阻斷細(xì)胞內(nèi)羥甲戊酸代謝途徑，使細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成減少，從而反饋性刺激細(xì)胞膜表面(主要為肝細(xì)胞)低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein，LDL)受體數(shù)量和活性增加、使血清膽固醇清除增加、水平降低。他汀類藥在降脂的同時(shí)，也帶來了肝功下降、肌肉疼痛等毒副作用HMGCR基因編碼的是膽固醇合成的限速酶，是膽固醇反饋抑制的重要調(diào)控位點(diǎn)。該酶的多態(tài)性影響個(gè)體血液中的膽固醇濃度。當(dāng)服用他汀類藥物后，rs17238540位點(diǎn)攜帶G等位基因的個(gè)體比攜帶T等位基因的個(gè)體，降低血液中膽固醇的效果不理想。載脂蛋白E(APOE)參與脂蛋白的轉(zhuǎn)化與代謝過程，其基因可以調(diào)節(jié)許多生物學(xué)功能，在膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)和脂蛋白代謝中起著重要作用，是主要的膽固醇與脂蛋白在體內(nèi)轉(zhuǎn)化代謝的調(diào)節(jié)蛋白之一，其基因多態(tài)性導(dǎo)致個(gè)體間血脂和脂蛋白水平產(chǎn)生明顯差異，也會(huì)影響個(gè)體對他汀類藥物的反應(yīng)。當(dāng)服用他汀類藥物后，rs7412位點(diǎn)攜帶C等位基因的個(gè)體比攜帶T等位基因的個(gè)體，降血脂效果不理想；rs429358位點(diǎn)攜帶C等位基因的個(gè)體比攜帶T等位基因的個(gè)體，降血脂效果不理想。SLC01B1編碼的蛋白，主要存在于人體肝臟的基底外側(cè)膜，主要承擔(dān)將多種內(nèi)源性和外源性物質(zhì)由血轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，SLC01B1基因的多態(tài)性影響個(gè)體轉(zhuǎn)運(yùn)他汀藥物到肝臟發(fā)揮作用的效率。在rs4149056位點(diǎn)攜帶C等位基因的個(gè)體，轉(zhuǎn)運(yùn)他汀藥物到肝臟效率較低，而血液中藥物濃度高，發(fā)生不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)增高。目前常用的檢測基因多態(tài)性的方法有DNA直接測序法、限制性片段長度多態(tài)性分析法(PCR-PFLP)、高分辨率溶解曲線(HRM)、基因芯片、液相芯片法、熒光定量PCR法等。測序技術(shù)是公認(rèn)的檢測基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)，但其設(shè)備成本高、檢測周期長、檢測通量低、檢測靈敏度低、對實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)操作要求高、結(jié)果判定步驟繁瑣等原因，較難形成商業(yè)化的診斷產(chǎn)品；限制性片段長度多態(tài)性分析法檢測靈敏度同樣不高、操作步驟繁瑣，檢測的結(jié)果仍需要進(jìn)行一代測序法的再次驗(yàn)證，尤其當(dāng)樣本量多時(shí)極易造成PCR產(chǎn)物的交叉污染且容易出現(xiàn)酶切不充分或酶切過度而出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果，因此也無法應(yīng)用到臨床上。芯片檢測因其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性較差，實(shí)驗(yàn)周期長等缺點(diǎn)，也不適于開發(fā)臨床檢測試劑盒。熒光定量PCR的檢測方法擁有成本低、靈敏度高、特異性強(qiáng)，結(jié)果的重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，是檢測SNP的非常好的一種檢測手段，但是常規(guī)的Taqman探針法探針訂購成本太高，多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)檢測時(shí)很難保證所有引物探針在同一擴(kuò)增條件下均達(dá)到非常好的擴(kuò)增效果。因此，急需要找到一種簡便易行的基因分型方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種快速、簡便、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的用于他汀類降脂藥個(gè)體化用藥相關(guān)基因SNP檢測的試劑盒及其檢測方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種用于他汀類降脂藥個(gè)體化用藥相關(guān)基因SNP檢測的試劑盒，包括2XqPCR混合反應(yīng)液、檢測HMGCR基因rs17238540位點(diǎn)的引物mix、檢測APOE基因rs7412位點(diǎn)的引物mix、檢測APOE基因rs429358位點(diǎn)的引物mix和檢測SLCO1B1基因rs4149056位點(diǎn)的引物mix；所述檢測HMGCR基因rs17238540位點(diǎn)的引物mix含有檢測該SNP位點(diǎn)的兩條特異性正向引物及一條反向引物，所述的檢測APOE基因rs7412位點(diǎn)的引物mix含有檢測該SNP位點(diǎn)的兩條特異性正向引物及一條反向引物，所述的檢測APOE基因rs429358位點(diǎn)的引物mix含有檢測該SNP位點(diǎn)的兩條特異性正向引物及一條反向引物，所述的檢測SLCO1B1基因rs4149056位點(diǎn)的引物mix含有檢測該SNP位點(diǎn)的兩條特異性正向引物及一條反向引物；所述檢測HMGCR基因rs17238540位點(diǎn)的兩條特異性正向引物及一條反向引物序列如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5所示，所述檢測APOE基因rs7412位點(diǎn)的兩條特異性正向引物及一條反向引物序列如SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8所示，所述檢測APOE基因rs429358位點(diǎn)的兩條特異性正向引物及一條反向引物序列如SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11所示，所述檢測SLCO1B1基因rs4149056位點(diǎn)的兩條特異性正向引物及一條反向引物序列如SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14所示。所述的2XqPCR混合反應(yīng)液中含PCRBuffer、MgCl2、dNTPs、TaqDNA聚合酶、兩條分別用FAM和HEX標(biāo)記的通用熒光探針，F(xiàn)AM標(biāo)記的通用熒光探針序列如SEQIDNO.1所示，HEX標(biāo)記的通用熒光探針序列如SEQIDNO.2所示。上述的用于他汀類降脂藥個(gè)體化用藥相關(guān)基因SNP檢測的試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：提取待檢測樣本的基因組DNA，然后分成4個(gè)反應(yīng)管(a、b、c、d)進(jìn)行檢測，首先在每個(gè)反應(yīng)管中分別加入2XqPCR混合反應(yīng)液，然后在第一反應(yīng)管(a)加入檢測HMGCR基因rs17238540位點(diǎn)的引物mix；在第二反應(yīng)管(b)加入檢測APOE基因rs7412位點(diǎn)的引物mix；在第三反應(yīng)管(c)加入檢測APOE基因rs429358位點(diǎn)的引物mix；在第四反應(yīng)管(d)加入檢測SLCO1B1基因rs4149056位點(diǎn)的引物mix，最后在4個(gè)反應(yīng)管(a、b、c、d)中加入待檢測樣本的基因組DNA，進(jìn)行核酸樣本的熒光定量PCR擴(kuò)增，在37℃進(jìn)行熒光信號的掃描，使用LightCycler480Softwarerelease軟件中的EndpiontGenotyping模塊根據(jù)兩種熒光信號的強(qiáng)度及比值對基因型進(jìn)行自動(dòng)判別。所述PCR擴(kuò)增程序如下：預(yù)變性的條件為：溫度為94℃，時(shí)間為15秒；PCR擴(kuò)增由第一階段和第二階段構(gòu)成；第一階段由10次擴(kuò)增循環(huán)構(gòu)成，其條件為：變性：溫度為94℃，時(shí)間為20秒；退火+延伸：起始溫度為61℃，每一輪擴(kuò)增循環(huán)溫度遞減0.5℃，直至擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束，時(shí)間為60秒；第二階段由29輪循環(huán)構(gòu)成，其條件為：變性：溫度為94℃，時(shí)間為20秒；退火+延伸：溫度為55℃，時(shí)間為60秒；信號掃描條件為：溫度為37℃，時(shí)間為60秒。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的試劑盒能快速、簡便、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的對基因分型，并且通過與一代測序技術(shù)檢測結(jié)果比對，結(jié)果符合度高達(dá)99％以上，有望在臨床快速基因分型中得到廣泛應(yīng)用。解決現(xiàn)有其他檢測技術(shù)價(jià)格昂貴、效率低下及通量不高的問題。附圖說明圖1為采用本發(fā)明試劑盒中的檢測HMGCR基因rs17238540位點(diǎn)的兩條特異性正向引物和一條反向引物對四個(gè)樣品的檢測結(jié)果圖。圖2為圖1中所示的1-1、1-2、1-3、1-4四個(gè)待測樣本的一代測序(Sanger測序)圖。圖3為采用本發(fā)明試劑盒中的檢測APOE基因rs7412位點(diǎn)的兩條特異性正向引物和一條反向引物對四個(gè)樣品的檢測結(jié)果圖。圖4為圖3中所示的2-1、2-2、2-3、2-4四個(gè)待測樣本的一代測序(Sanger測序)圖。圖5為采用本發(fā)明試劑盒中的檢測APOE基因rs429358位點(diǎn)的兩條特異性正向引物和一條反向引物對四個(gè)樣品的檢測結(jié)果圖。圖6為圖5中所示的3-1、3-2、3-3、3-4、3-5五個(gè)待測樣本的一代測序(Sanger測序)圖。圖7為采用本發(fā)明試劑盒中的檢測SLCO1B1基因rs4149056位點(diǎn)的兩條特異性正向引物和一條反向引物對五個(gè)樣品的檢測結(jié)果圖。圖8為圖7中所示的4-1、4-2、4-3、4-4四個(gè)待測樣本的一代測序(Sanger測序)圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明：本發(fā)明用于他汀類降脂藥個(gè)體化用藥相關(guān)基因SNP檢測的試劑盒，所述試劑盒包括包括2XqPCR混合反應(yīng)液，檢測HMGCR基因rs17238540位點(diǎn)的兩條正向引物及一條反向引物，和檢測APOE基因rs7412位點(diǎn)兩條正向引物和一條反向引物，和檢測APOE基因rs429358位點(diǎn)兩條正向引物和一條反向引物，和檢測SLCO1B1基因rs4149056位點(diǎn)兩條正向引物和一條反向引物。所述檢測HMGCR基因rs17238540位點(diǎn)的兩條特異性正向引物及一條反向引物序列如下所示：C等位基因正向引物：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCACAATGGATTAGGCTGATATGACCSEQIDNO.3A等位基因正向引物：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCACAATGGATTAGGCTGATATGACASEQIDNO.4反向引物：TAATTGGTCTTTTCCAAACTCTTTSEQIDNO.5所述檢測APOE基因rs7412位點(diǎn)的兩條特異性正向引物及一條反向引物序列如下所示：C等位基因正向引物：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTGGTACACTGCCAGGCGSEQIDNO.6T等位基因正向引物：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGGTACACTGCCAGGCASEQIDNO.7反向引物：CGATGCCGATGACCTGCSEQIDNO.8所述檢測APOE基因rs429358位點(diǎn)的兩條特異性正向引物及一條反向引物序列如下所示：C等位基因正向引物：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCGGACATGGAGGACGTGCSEQIDNO.9T等位基因正向引物：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCGGACATGGAGGACGTGTSEQIDNO.10反向引物：CGGTACTGCACCAGGCGSEQIDNO.11所述檢測SLCO1B1基因rs4149056位點(diǎn)的兩條特異性正向引物及一條反向引物序列如下所示：C等位基因正向引物：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGGTCATACATGTGGATATATGCSEQIDNO.12T等位基因正向引物：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGGGTCATACATGTGGATATATGTSEQIDNO.13反向引物：TCCACGAAGCATATTACCCATGAASEQIDNO.14其中，所述正向引物均由兩部分序列結(jié)合而成：野生型正向引物的5’端為通用序列GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(SEQIDNO.1)，3’端為識(shí)別相應(yīng)位點(diǎn)的特異序列；突變型正向引物的5’端為通用序列GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(SEQIDNO.2)，3’端為識(shí)別相應(yīng)位點(diǎn)的特異序列。所述的2XqPCR混合反應(yīng)液中含PCRBuffer、MgCl2、dNTPs、TaqDNA聚合酶、兩條分別用FAM和HEX標(biāo)記的通用熒光探針，F(xiàn)AM標(biāo)記的通用熒光探針序列如SEQIDNO.1所示，HEX標(biāo)記的通用熒光探針序列如SEQIDNO.2所示。本發(fā)明試劑盒的檢測方法，擴(kuò)增程序如下所示：預(yù)變性的條件為：溫度為94℃，時(shí)間為15秒；PCR擴(kuò)增由第一階段和第二階段構(gòu)成；第一階段由10次擴(kuò)增循環(huán)構(gòu)成，其條件為：變性：溫度為94℃，時(shí)間為20秒；退火+延伸：起始溫度為61℃，每一輪擴(kuò)增循環(huán)溫度遞減0.5℃，直至擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束，時(shí)間為60秒；第二階段由29輪循環(huán)構(gòu)成，其條件為：變性：溫度為94℃，時(shí)間為20秒；退火+延伸：溫度為55℃，時(shí)間為60秒；信號掃描條件為：溫度為37℃，時(shí)間為60秒。本發(fā)明的引物(primer)是PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)中的重要組成部分，它是一小段單鏈DNA，作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn)，在核酸合成反應(yīng)時(shí)，作為每個(gè)多核苷酸鏈進(jìn)行延伸的出發(fā)點(diǎn)而起作用的多核苷酸鏈，在引物的3’-OH上，核苷酸以二酯鍵形式進(jìn)行合成，因此引物的3’-OH必須是游離的。野生型正向引物的5’通用序列與2XPCR混合反應(yīng)液中用FAM熒光染料標(biāo)記的通用序列一致；突變型正向引物的5’通用序列與2XPCR混合反應(yīng)液中用HEX熒光染料標(biāo)記的通用序列一致；攜帶熒光染料標(biāo)記的通用序列用于為熒光定量PCR擴(kuò)增完成后提供熒光信號。本發(fā)明的工作原理是：針對每個(gè)位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)了兩條特異性正向引物和一條反向引物。兩條特異性正向引物3’端最后一個(gè)核苷酸分別與突變位點(diǎn)所檢測的堿基互補(bǔ)配對，在PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增時(shí)聯(lián)合反向引物對待測DNA模板進(jìn)行特異性擴(kuò)增。PCR前10個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增采用了TouchdownPCR，即降落PCR，是優(yōu)化和改良后的一種PCR方法，指每一個(gè)(或n個(gè))循環(huán)降低0.5℃(或n℃)退火溫度，直到達(dá)到一個(gè)較低的退火溫度(Touchdown退火溫度)，以此來保證不同Tm值的引物均可以與相應(yīng)的待測DNA模板結(jié)合并進(jìn)行特異性擴(kuò)增。隨后進(jìn)行的29個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增過程中，2XPCR混合反應(yīng)液中的分別用FAM和HEX標(biāo)記的兩條通用探針會(huì)以前10輪PCR擴(kuò)增時(shí)產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物為模板，配合反向引物產(chǎn)生出攜帶有不同熒光染料標(biāo)記的PCR產(chǎn)物。最后在37℃進(jìn)行熒光信號的掃描，由軟件根據(jù)兩種熒光信號的強(qiáng)度及比值對基因型進(jìn)行自動(dòng)判別。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下的優(yōu)點(diǎn)和效果：1、本發(fā)明采用特殊設(shè)計(jì)的引物，熒光信號由PCR混合液中的兩種攜帶不同熒光染料標(biāo)記的通用序列提供，無需單獨(dú)設(shè)計(jì)特異性探針，極大的減少了研發(fā)周期及檢測成本。2、本發(fā)明采用特殊的PCR程序，大大減少了由于Tm值太低而導(dǎo)致的引物與模板在錯(cuò)誤位點(diǎn)的結(jié)合，從而提高了PCR效率和靈敏度，為臨床他汀類降脂藥用藥劑量調(diào)整提供可靠的依據(jù)。3、本發(fā)明采用的SNP位點(diǎn)基因分型軟件，可以直觀的自動(dòng)判別每個(gè)待測位點(diǎn)的基因型，無需通過Ct值的繁瑣計(jì)算，極大的降低了結(jié)果判讀時(shí)的人為失誤，并縮短了結(jié)果判讀的時(shí)間，提高了檢測效率。4、本發(fā)明的試劑盒，可以根據(jù)待測樣本數(shù)量的多少，靈活的選用8連管、96孔板或者384孔板進(jìn)行檢測，一次的檢測通量分別為1人份、28人份和124人份。5、本發(fā)明的試劑盒，可以實(shí)現(xiàn)高準(zhǔn)確度、高效率的對HMGCR基因rs17238540位點(diǎn)、APOE基因rs7412位點(diǎn)、APOE基因rs429358位點(diǎn)和SLCO1B1基因rs4149056共四個(gè)SNP位點(diǎn)檢測，從而達(dá)到對他汀類降脂藥用藥劑量的量化控制，甚至對血栓性疾病的預(yù)防、抗凝藥物的選擇、新抗凝藥的研發(fā)、血栓性的疾病預(yù)后也起到一定的作用。實(shí)施例1一種用于指導(dǎo)他汀類降脂藥個(gè)體化用藥相關(guān)基因SNP檢測的試劑盒包含：2XPCR混合反應(yīng)液、檢測HMGCR基因rs17238540位點(diǎn)的引物mix和檢測APOE基因rs7412位點(diǎn)的引物mix和檢測APOE基因rs429358位點(diǎn)的引物mix和檢測SLCO1B1基因rs4149056位點(diǎn)的引物mix。所述檢測HMGCR基因rs17238540位點(diǎn)的兩條特異性正向引物及一條反向引物序列如下所示：G等位基因正向引物：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCACAATGGATTAGGCTGATATGACCSEQIDNO.3T等位基因正向引物：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCACAATGGATTAGGCTGATATGACASEQIDNO.4反向引物：TAATTGGTCTTTTCCAAACTCTTTSEQIDNO.5所述檢測APOE基因rs7412位點(diǎn)的兩條特異性正向引物及一條反向引物序列如下所示：C等位基因正向引物：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTGGTACACTGCCAGGCGSEQIDNO.6T等位基因正向引物：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGGTACACTGCCAGGCASEQIDNO.7反向引物：CGATGCCGATGACCTGCSEQIDNO.8所述檢測APOE基因rs429358位點(diǎn)的兩條特異性正向引物及一條反向引物序列如下所示：C等位基因正向引物：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCGGACATGGAGGACGTGCSEQIDNO.9T等位基因正向引物：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCGGACATGGAGGACGTGTSEQIDNO.10反向引物：CGGTACTGCACCAGGCGSEQIDNO.11所述檢測SLCO1B1基因rs4149056位點(diǎn)的兩條特異性正向引物及一條反向引物序列如下所示：C等位基因正向引物：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGGTCATACATGTGGATATATGCSEQIDNO.12T等位基因正向引物：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTGGGTCATACATGTGGATATATGTSEQIDNO.13反向引物：TCCACGAAGCATATTACCCATGAASEQIDNO.14其中，所述正向引物均由兩部分序列結(jié)合而成：野生型正向引物的5’端為通用序列GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(SEQIDNO.1)，3’端為識(shí)別相應(yīng)位點(diǎn)的特異序列；突變型正向引物的5’端為通用序列GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(SEQIDNO.2)，3’端為識(shí)別相應(yīng)位點(diǎn)的特異序列。實(shí)施例2一種用于指導(dǎo)他汀類降脂藥個(gè)體化用藥相關(guān)基因SNP檢測的試劑盒采用的PCR擴(kuò)增方法包括以下步驟：第一步：待測樣本基因組DNA提取(1)從患者抽取血液樣本。(2)從血液中獲取DNA，采用天根生化(北京)有限公司生產(chǎn)的TGuide血液基因組DNA提取試劑盒(OSR-M102)在其配套的TGuideM16核酸自動(dòng)提取儀上進(jìn)行提取。提取過程如下：a.往樣品管中加入200μl/400μl的哺乳動(dòng)物全血樣本，并加入10μl/20μl蛋白酶K混勻。b.放置樣品管于T型架的孔4位置。運(yùn)行編號102程序(全血基因組DNA提取程序)，選擇相應(yīng)的樣本量體積和最終洗脫體積。第二步：對DNA進(jìn)行擴(kuò)增采用10ng/10ul反應(yīng)體系，具體操作為：1、將上述一系列引物分別與血液基因組DNA、2XPCR混合反應(yīng)液、去離子水按照一定比例混合構(gòu)成單獨(dú)的反應(yīng)體系，具體見下表：試劑名稱體積(ul)基因組DNA(10ng)2ul引物mix1ul2XPCR混合反應(yīng)液5ul去離子水2ul2、對上述反應(yīng)體系進(jìn)行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)條件見下表：第三步：觀測結(jié)果表1為采用試劑盒中的檢測HMGCR基因rs17238540位點(diǎn)的兩條特異性正向引物和一條反向引物對四個(gè)樣品的基因型結(jié)果。表1如圖1所示，在HMGCR基因rs17238540位點(diǎn)的熒光定量PCR擴(kuò)增體系中，檢測G等位基因的特異性正向引物5’端序列與2*qPCR反應(yīng)混合液中FAM熒光標(biāo)記的引物序列一致，檢測T等位基因的特異性正向引物5’端序列與2*qPCR反應(yīng)混合液中HEX熒光標(biāo)記的引物序列一致。圖1中X軸代表了FAM熒光的強(qiáng)度，Y軸代表了HEX熒光的強(qiáng)度，1-1、1-2、1-3、1-4四個(gè)樣本的檢測結(jié)果靠近Y軸，說明僅有HEX熒光被檢出，因此基因型均為TT純合。如圖2所示，1-1、1-2、1-3、1-4四個(gè)樣本在rs17238540位點(diǎn)處僅檢測到T等位基因，說明四個(gè)樣本在rs17238540位點(diǎn)的基因型為TT純合。一代測序結(jié)果與試劑盒檢測結(jié)果一致。表2為采用試劑盒中的檢測APOE基因rs7412位點(diǎn)的兩條特異性正向引物和一條反向引物對四個(gè)樣品的基因型結(jié)果。表2如圖3所示，在APOE基因rs7412位點(diǎn)的熒光定量PCR擴(kuò)增體系中，檢測C等位基因的特異性正向引物5’端序列與2*qPCR反應(yīng)混合液中FAM熒光標(biāo)記的引物序列一致，檢測T等位基因特異性正向引物5’端序列與2*qPCR反應(yīng)混合液中HEX熒光標(biāo)記的引物序列一致。圖3中X軸代表了FAM熒光的強(qiáng)度，Y軸代表了HEX熒光的強(qiáng)度,2-1、2-2和2-3三個(gè)樣本檢測結(jié)果靠近X軸，說明只有FAM熒光被檢出，因此基因型為CC純合；2-4樣本檢測結(jié)果靠近對角線的位置，說明FAM和HEX兩種熒光均被檢出，因此基因型為CT雜合。如圖4所示，2-1、2-2合2-3三個(gè)樣本在rs7412位點(diǎn)處只檢測到C等位基因，所以2-1、2-2合2-3三個(gè)樣本在rs7412位點(diǎn)的基因型為CC純合；2-4樣本在rs7412位點(diǎn)處同時(shí)檢測到C和T兩種等位基因，所以2-4樣本在rs7412位點(diǎn)的基因型為CT雜合。一代測序結(jié)果與試劑盒檢測結(jié)果一致。表3為采用試劑盒中的檢測APOE基因rs429358位點(diǎn)的兩條特異性正向引物和一條反向引物對5個(gè)樣品的基因型結(jié)果。表3如圖5所示，在APOE基因rs429358位點(diǎn)的熒光定量PCR擴(kuò)增體系中，檢測C等位基因的特異性正向引物5’端序列與2*qPCR反應(yīng)混合液中FAM熒光標(biāo)記的引物序列一致，檢測T等位基因特異性正向引物5’端序列與2*qPCR反應(yīng)混合液中HEX熒光標(biāo)記的引物序列一致。圖5中X軸代表了FAM熒光的強(qiáng)度，Y軸代表了HEX熒光的強(qiáng)度,3-1樣本檢測結(jié)果靠近X軸，說明只有FAM熒光被檢出，因此基因型為CC純合；3-2和3-3兩樣本檢測結(jié)果靠近對角線的位置，說明FAM和HEX兩種熒光均被檢出，因此基因型為CT雜合；3-4和3-5兩個(gè)樣本的檢測結(jié)果靠近Y軸，說明只有HEX熒光被檢出，因此基因型為TT純合。如圖6所示，3-1樣本在rs429358位點(diǎn)處只檢測到C等位基因，所以3-1樣本在rs429358位點(diǎn)的基因型為CC純合；3-2和3-3兩個(gè)樣本在rs429358位點(diǎn)處同時(shí)檢測到C和T兩種等位基因，所以3-2和3-3兩個(gè)樣本在rs429358位點(diǎn)的基因型為CT雜合。3-4和3-5兩個(gè)樣本在rs429358位點(diǎn)處只檢測到T等位基因，所以3-4和3-5兩個(gè)樣本在rs429358位點(diǎn)的基因型為TT純合；一代測序結(jié)果與試劑盒檢測結(jié)果一致。表4為采用試劑盒中的檢測SLCO1B1基因rs4149056位點(diǎn)的兩條特異性正向引物和一條反向引物對4個(gè)樣品的基因型結(jié)果。表4如圖7所示，在SLCO1B1基因rs4149056位點(diǎn)的熒光定量PCR擴(kuò)增體系中，檢測C等位基因的特異性正向引物5’端序列與2*qPCR反應(yīng)混合液中FAM熒光標(biāo)記的引物序列一致，檢測T等位基因特異性正向引物5’端序列與2*qPCR反應(yīng)混合液中HEX熒光標(biāo)記的引物序列一致。圖7中X軸代表了FAM熒光的強(qiáng)度，Y軸代表了HEX熒光的強(qiáng)度,4-1和4-2兩樣本檢測結(jié)果靠近對角線的位置，說明FAM和HEX兩種熒光均被檢出，因此基因型為CT雜合；4-3和4-4兩個(gè)樣本的檢測結(jié)果靠近Y軸，說明只有HEX熒光被檢出，因此基因型為TT純合。如圖8所示，4-1和4-2兩個(gè)樣本在rs4149056位點(diǎn)處同時(shí)檢測到C和T兩種等位基因，所以4-1和4-2兩個(gè)樣本在rs4149056位點(diǎn)的基因型為CT雜合。4-3和4-4兩個(gè)樣本在rs4149056位點(diǎn)處只檢測到T等位基因，所以4-3和4-4兩個(gè)樣本在rs429358位點(diǎn)的基因型為TT純合；一代測序結(jié)果與試劑盒檢測結(jié)果一致。綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識(shí)之士可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實(shí)施例，但這種實(shí)施例都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3