本發(fā)明涉及生物技術(shù)，疾病診斷和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說，涉及一種帕金森病診斷試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)又稱震顫麻痹，是僅次于阿爾茨海默病的第二常見神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。除黑質(zhì)紋狀體變性引起的靜止性震顫、肌強(qiáng)直及運動遲緩等運動癥狀外，非運動癥狀如嗅覺缺失、抑郁、自主神經(jīng)功能障礙、快動眼睡眠行為異常(rapid eye movement sleep behavior disorder，RBD)及認(rèn)知損害等也是PD的重要組成部分。隨著人口老齡化的加劇，PD的患病率呈逐年上升趨勢，給患者的家庭和社會造成了嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。當(dāng)PD患者出現(xiàn)臨床癥狀時，其黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元死亡已超過60％，此時，藥物治療僅能改善患者的臨床癥狀，并不能減緩其疾病的進(jìn)展。對PD臨床前期或早期的識別和診斷，是PD及其他神經(jīng)變性疾病發(fā)病機(jī)制研究和新藥研發(fā)的基礎(chǔ)。

目前臨床上常規(guī)的藥物主要有(1)多巴胺替代藥物；(2)單胺氧化酶(MAO)抑制劑；(3)兒茶酚胺氧位甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)抑制劑；(4)抗膽堿能藥物；(5)多巴胺受體激動劑等等。以上藥物能夠暫時緩解和改善相關(guān)癥狀，但不能推遲病程，也不能治愈該病。近年來，隨著PD病理機(jī)制研究進(jìn)一步深入，與PD有關(guān)的致病基因及調(diào)控此類基因的非編碼RNA(例如miRNA)備受矚目。

miRNA(microRNA，miR)是有21-23個核苷酸的非編碼單鏈微小RNA，能夠通過序列特異性的方式來調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)。miRNA具有高度保守性、組織特異性、階段特異性和時序性等特點。近期研究表明，有大量的miRNA與PD病理機(jī)制密切相關(guān)，可能為PD治療提供新的思路。miRNA可調(diào)節(jié)與遺傳性PD相關(guān)的基因，如miR-7和miR-153可以調(diào)控PD致病基因PARK1/PARK4，miR-205可以調(diào)控PARK8，miR-34b/miR-34c可以調(diào)控PARK2，miR-494可以調(diào)控PARK7等；miRNA也可以調(diào)控多種與PD發(fā)病機(jī)制相關(guān)的基因，如miR-34a、miR-132、miR-133b可以分別調(diào)控與多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育有關(guān)的基因Nurr1、Notch1、Pitx3，miR-320可以調(diào)控與突觸形成有關(guān)的基因ARPP-19，miR-433可以調(diào)控與神經(jīng)營養(yǎng)因子有關(guān)的基因FGF20等。直接調(diào)控PD致病基因的miRNA可能具有直接的治療作用，而調(diào)節(jié)PD相關(guān)基因的miRNA可能具有輔助治療作用。miRNA能夠調(diào)控PD致病基因與相關(guān)基因的表達(dá)，是一種非常具有前景的治療手段。因此，進(jìn)一步研究miRNA在PD發(fā)病機(jī)制探索以及臨床診斷中具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供四種miRNAs：miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p和miR-30e-5p的新用途。

第一方面，本發(fā)明提供了miRNA在制備診斷帕金森病的試劑中的應(yīng)用，所述的miRNA選自下列中的任一種：

a)miR-105-5p，

b)miR-21-5p，

c)miR-29a-5p，

d)miR-30e-5p，

e)miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p和miR-30e-5p中任兩種或任幾種的組合。

第二方面，本發(fā)明提供了檢測血漿中miRNA表達(dá)水平的試劑在制備診斷帕金森病的試劑中的應(yīng)用，所述的miRNA選自下列中的任一種：

a)miR-105-5p，

b)miR-21-5p，

c)miR-29a-5p，

d)miR-30e-5p，

e)miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p和miR-30e-5p中任兩種或任幾種的組合。

作為本發(fā)明的一種具體實施方式，所述的試劑為檢測miRNA的引物。

第三方面，本發(fā)明提供了一種帕金森病診斷試劑盒，所述的試劑盒含有檢測血漿中miRNA表達(dá)水平的試劑，所述的miRNA選自下列中的任一種：

a)miR-105-5p，

b)miR-21-5p，

c)miR-29a-5p，

d)miR-30e-5p，

e)miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p和miR-30e-5p中任兩種或任幾種的組合。

第四方面，本發(fā)明提供了miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p或miR-30e-5p的抑制劑在制備治療帕金森病的藥物中的應(yīng)用。

第五方面，本發(fā)明提供了miR-21-5p在制備篩選治療帕金森病的藥物中的應(yīng)用。

本文中，各miRNA具有如下序列：

miR-105-5p：UCAAAUGCUCAGACUCCUGUGGU(SEQ ID NO.1)，

miR-21-5p：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(SEQ ID NO.2)，

miR-29a-5p：ACUGAUUUCUUUUGGUGUUCAG(SEQ ID NO.3)，

miR-30e-5p：UGUAAACAUCCUUGACUGGAAG(SEQ ID NO.4)。

本發(fā)明優(yōu)點在于：

本發(fā)明對263例帕金森病患者和242例年齡性別匹配的健康對照組血漿中的miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p表達(dá)水平進(jìn)行單盲檢測，發(fā)現(xiàn)這4種miRNAs在帕金森病患者和健康人群血漿中有明顯差異，提示四種miRNAs包括miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p可作為診斷分子標(biāo)志物用于制備診斷帕金森病的試劑盒，或用于制備治療帕金森病的藥物。同時，我們發(fā)現(xiàn)服藥情況對miR-21-5p有顯著影響，提示其可用于篩選治療帕金森病的藥物。本發(fā)明對進(jìn)一步研究miRNAs在帕金森病發(fā)病以及臨床診斷和治療中的功能具有重要的意義。

附圖說明

圖1.miRNAs在帕金森病患者血漿中的表達(dá)。熒光定量RT-PCR方法檢測健康對照(n＝242)和帕金森病患者(n＝263)血漿中miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p的表達(dá)。HC：健康對照；PD：帕金森病患者。

圖2.服藥情況對帕金森病患者血漿中miRNAs的影響。分析與健康對照相比，帕金森病患者未服藥(n＝66)，服用左旋多巴(n＝65)，服用左旋多巴與多巴胺受體激動劑聯(lián)合用藥(n＝71)對血漿中miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p表達(dá)的影響。ctrl：健康對照；naive：帕金森病患者未服藥組；L-dopa：帕金森病患者服用左旋多巴組；L-dopa+DR：帕金森病患者服用左旋多巴與多巴胺受體激動劑聯(lián)合用藥組。與健康對照組相比，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。與帕金森病患者未服藥組相比，^###p<0.001。

圖3.年齡對帕金森病患者血漿中miRNAs的影響。將入組帕金森病患者分為四個年齡段40～59歲(HC組n＝34；PD組n＝58)、60～69歲(HC組n＝101；PD組n＝85)、70～79歲(HC組n＝76；PD組n＝87)和80～89歲(HC組n＝30；PD組n＝27)，分析比較健康對照組和帕金森病患者在不同年齡段血漿中miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p表達(dá)水平變化。HC：健康對照；PD：帕金森病患者。與健康對照組相比，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。

圖4.性別對帕金森病患者血漿中miRNAs的影響。分析比較不同性別健康對照組和帕金森病患者血漿中miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p表達(dá)水平變化。與健康對照組相比，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。

圖5.病程對帕金森病患者血漿中miRNAs的影響。將入組帕金森病患者病程分為四個階段1～3年(n＝86)、4～6年(n＝65)、7～9年(n＝57)和10～20年(n＝39)，分析與健康對照組相比，帕金森病患者在病程不同階段血漿中miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p表達(dá)水平變化。與健康對照組相比，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式作詳細(xì)說明。

實施例1

一、材料與方法

1.樣本收集和miRNA提取

實驗共收集了748例血漿樣本，其中包括242個健康對照者，263個帕金森病患者和243個神經(jīng)系統(tǒng)其他疾病患者。經(jīng)卡方檢驗，三組人群在性別年齡方面沒有顯著差異。每個個體采2mL抗凝血，采集完成后送入實驗室，3000rpm常溫離心15min后分離血漿分裝到滅菌的離心管中，-80℃保存。采用miRcute miRNA提取分離試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取miRNA，方法按照試劑盒說明實施。

表1入組人群性別年齡情況表

Ref：reference；NS：not significant，無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.miRNA反轉(zhuǎn)錄和檢測

取上述miNRA，參照天根生化科技(北京)有限公司的miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒及miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量RT-PCR檢測了miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p的表達(dá)，方法按照試劑盒說明實施。所用引物購自天根生化科技(北京)有限公司，商品號分別為CD201-0048，CD201-0092，CD201-0328和CD201-0340。內(nèi)參選用miRNA-16，所用引物序列為5’-GCTAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3’(SEQ ID NO.5)。

3.分析服藥情況、年齡、性別和病程對帕金森病患者miRNAs影響

收集入組人群臨床病例，對帕金森病患者服藥情況、年齡、性別和病程信息進(jìn)行匯總，并分析其對miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p表達(dá)的影響。

4.統(tǒng)計分析和數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Means±SEM)表示。用GraphPad Prism software version 4(GraphPad Inc.,San Diego,CA,USA)對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行獨立樣本t-檢驗，多組數(shù)據(jù)比較采用Oneway-ANOVA，P<0.05視為有統(tǒng)計學(xué)差異。二、實驗結(jié)果

1.miRNAs在帕金森病患者血漿中的表達(dá)

我們發(fā)現(xiàn)與健康對照者相比，帕金森病患者血漿中miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p的表達(dá)均顯著增加，分別增加了267.72％、832.62％、187.76％和163.10％(圖1)。

2.服藥情況對帕金森病患者血漿中miRNAs的影響

根據(jù)入組帕金森病患者的服藥情況(包括未服藥，服用左旋多巴，服用左旋多巴和多巴胺受體激動劑聯(lián)合用藥)，發(fā)現(xiàn)帕金森病患者服用多巴胺受體激動劑能明顯上調(diào)miR-21-5p的表達(dá)，而對檢測的其他miRNA無明顯影響(圖2)。

3.年齡對帕金森病患者血漿中miRNAs的影響

將入組健康對照和帕金森病患者按其年齡分為40～59、60～69、70～79和80～89四個年齡段，發(fā)現(xiàn)除了40～59年齡段健康對照和帕金森病患者miR-105-5p表達(dá)水平相比無統(tǒng)計學(xué)意義，帕金森病患者在不同年齡段miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p表達(dá)水平均顯著上調(diào)(圖3)。

4.性別對帕金森病患者血漿中miRNAs的影響

我們發(fā)現(xiàn)與健康對照者相比，帕金森病患者男性和女性血漿中miR-105-5p，miR-21-5p的表達(dá)均顯著上調(diào)。男性帕金森病患者血漿中miR-30e-5p的表達(dá)水平比男性健康對照組顯著增多，而女性帕金森患者不明顯。miR-29a-5p在帕金森病患者男性和女性血漿中有增高趨勢但尚無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4)。

5.病程對帕金森病患者血漿中miRNAs的影響

我們將入組帕金森病患者病程分為四個階段1～3年、4～6年、7～9年和10～20年，發(fā)現(xiàn)與健康對照者相比，帕金森病患者血漿中miR-30e-5p，miR-21-5p在病程不同階段的表達(dá)均顯著上調(diào)。帕金森病患者血漿中miR-105-5p的表達(dá)水平在病程的前三個階段顯著增高，其在患病10～20年的帕金森病患者血漿中的表達(dá)有上升趨勢。miR-29a-5p在帕金森病患者不同病程階段血漿中變化不顯著(圖5)。

三、討論

本發(fā)明在帕金森病患者血漿中驗證了4種miRNAs：miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p可作為帕金森病生物標(biāo)志物或治療靶點，血漿中miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p或它們的組合，及其引物可用于制備診斷試劑盒，用于帕金森病的輔助早期診斷，miR-105-5p，miR-21-5p，miR-29a-5p，miR-30e-5p的抑制劑可用于制備治療帕金森病的藥物。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補充，這些改進(jìn)和補充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。