本發(fā)明屬于微衛(wèi)星分子標(biāo)記領(lǐng)域，具體涉及一種達(dá)氏鱘微衛(wèi)星標(biāo)記及其篩選方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

微衛(wèi)星標(biāo)記(SSRs：simple sequence repeats)或短串聯(lián)重復(fù)(Short tandem repeats，STRS)，是一種廣泛應(yīng)用的遺傳學(xué)領(lǐng)域的DNA分子標(biāo)記。SSRs是廣泛存在真核生物基因組中的簡(jiǎn)單重復(fù)DNA片段，一般每個(gè)重復(fù)單位為1-6個(gè)堿基。SSR與其它遺傳標(biāo)記相比較，具有位點(diǎn)眾多，多態(tài)性程度高，檢測(cè)時(shí)對(duì)DNA模板要求程度低，檢測(cè)簡(jiǎn)單快速的優(yōu)點(diǎn)，是一個(gè)良好的遺傳標(biāo)記。微衛(wèi)星DNA的高突變性、共顯性表達(dá)及其在真核生物基因組中的普遍性，使其成為群體遺傳多樣性的分析、親緣關(guān)系的鑒定、基因組作圖和遺傳育種的優(yōu)越的分子標(biāo)記，與等位酶、RAPD方法相比也有一定的優(yōu)越性。SSR標(biāo)記雖然效果好，可靠性高，但其關(guān)鍵點(diǎn)又在于SSR引物的開發(fā)。只有在有一定數(shù)量的SSR引物之后，才可能對(duì)某一物種進(jìn)行SSR標(biāo)記的分析。開發(fā)微衛(wèi)星引物的方法有：1、經(jīng)典的構(gòu)建與篩選基因組、轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的方法；2、微衛(wèi)星富集法；3、近緣種的引物(例如同屬不同種)；4、數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋法：在GenBank等公共數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋SSR序列，根據(jù)側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物。針對(duì)那些大多數(shù)測(cè)序很少的物種，第1種方法為最有效的方法。

達(dá)氏鱘又稱長(zhǎng)江鱘、沙臘子，是我國(guó)特有物種，主要分布于長(zhǎng)江干流及金沙江下游，以四川宜賓-合江段產(chǎn)量較高。近20年來(lái)，由于葛洲壩工程的興建以及水體污染、過(guò)度捕撈等原因，達(dá)氏鱘的野生資源量已經(jīng)極其稀少，1988年被列為國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物和長(zhǎng)江上游一級(jí)急切保護(hù)魚類。因此，迫切需要采取人工繁殖和增殖放流等技術(shù)及時(shí)有效地對(duì)該物種進(jìn)行保護(hù)。本發(fā)明中利用高通量測(cè)序技術(shù)開發(fā)的8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，不僅對(duì)其遺傳多樣性的檢測(cè)、遺傳圖譜構(gòu)建和人工增殖放流效果評(píng)估等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，還可后續(xù)用于達(dá)氏鱘的親子鑒定等研究領(lǐng)域，來(lái)防止近親衰退，指導(dǎo)人工繁殖。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供達(dá)氏鱘微衛(wèi)星標(biāo)記及其擴(kuò)增引物，即提供8個(gè)達(dá)氏鱘的微衛(wèi)星標(biāo)記，以及相應(yīng)的擴(kuò)增引物，為達(dá)氏鱘的種群遺傳多樣性分析、親子鑒定及分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)提供有效的工具。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：1、一種達(dá)氏鱘微衛(wèi)星分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記具有SEQ ID No.1-8中任意一條或多條的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供一種達(dá)氏鱘微衛(wèi)星分子標(biāo)記在達(dá)氏鱘遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位、品種鑒定、種質(zhì)保存、數(shù)量性狀基因的分析、親子關(guān)系鑒定中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種篩選達(dá)氏鱘微衛(wèi)星分子標(biāo)記，包括以下步驟：

(1)達(dá)氏鱘cDNA文庫(kù)的構(gòu)建：用TRIzol試劑盒提取達(dá)氏鱘組織RNA、構(gòu)建達(dá)氏鱘轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)；

(2)測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制：高通量測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)Illumina Casava堿基識(shí)別軟件分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列，隨后對(duì)原始序列進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估及統(tǒng)計(jì)；

(3)組裝：原始測(cè)序序列(raw reads)經(jīng)過(guò)濾處理得到高質(zhì)量測(cè)序序列(clean reads)，采用Trinity軟件對(duì)clean reads進(jìn)行拼接得到轉(zhuǎn)錄本序列，取每條基因中最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本作為unigene；

(4)SSR檢測(cè)：對(duì)于已經(jīng)組裝好的數(shù)據(jù)，用QDD3軟件進(jìn)行SSR檢測(cè)，并設(shè)計(jì)SSR引物，鑒定其在不同達(dá)氏鱘個(gè)體中的多態(tài)性，篩選出具有穩(wěn)定性和多態(tài)性的引物。

本發(fā)明還提供一種適于分子標(biāo)記的特異性引物，具有SEQ ID No.9-24中任意一條或多條的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供一種利用分子標(biāo)記的特異性引物分析其在不同達(dá)氏鱘個(gè)體中的多樣性的方法，包括以下步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備：達(dá)氏鱘采樣，并分別提取用于檢測(cè)分析的每個(gè)個(gè)體的基因組DNA；

(2)PCR擴(kuò)增：利用權(quán)利要求2所述的引物，以提取的不同個(gè)體的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒，退火30秒，72℃延伸30秒，變性至延伸三個(gè)步驟重復(fù)32次，最后72℃充分延伸8分鐘，4℃保存；

(3)電泳檢測(cè)：對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于有多樣性的引物進(jìn)一步用熒光標(biāo)記進(jìn)行分型以確認(rèn)條帶大?。?/p>

(4)結(jié)果分析：用ATetra軟件計(jì)算期望雜合度，Shannon-wiener多樣性指數(shù)以及檢測(cè)哈迪-溫伯格平衡，以此來(lái)描述達(dá)氏鱘相關(guān)微衛(wèi)星DNA多態(tài)性的特征

本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：本發(fā)明利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)達(dá)氏鱘進(jìn)行微衛(wèi)星分子標(biāo)記的開發(fā)不僅比傳統(tǒng)方法更為快捷，花費(fèi)更少，而且在獲得微衛(wèi)星位點(diǎn)的同時(shí)可以查找對(duì)應(yīng)EST序列的功能性狀，與基因關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)。本發(fā)明開發(fā)出的微衛(wèi)星位點(diǎn)，不僅為達(dá)氏鱘的遺傳多樣性提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也可進(jìn)行遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位、品種鑒定、種質(zhì)保存、數(shù)量性狀基因的分析、親子關(guān)系鑒定等研究領(lǐng)域。根據(jù)實(shí)際需要，可以采用本發(fā)明公開的任意一種或多種標(biāo)記，或與相關(guān)標(biāo)記對(duì)應(yīng)的任意一對(duì)或多對(duì)特異性引物進(jìn)行分析研究。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

達(dá)氏鱘微衛(wèi)星位點(diǎn)和特異性引物的獲得和驗(yàn)證：

達(dá)氏鱘樣品收集及RNA提?。?/p>

從四川省水產(chǎn)研究所挑選四尾健康、性腺已分化的達(dá)氏鱘，解剖取其性腺進(jìn)行total RNA的提取，具體步驟如下：(1)將達(dá)氏鱘性腺組織約30mg放入預(yù)冷的研缽中，利用液迅速研磨成粉末，放入1.5mL離心管中，并加入1mLTRIzol；(2)離心管中加入200μL的氯仿，劇烈震蕩15s，室溫靜止3min；(3)4℃，12,000r/min離心10min，吸取上清放入新的離心管中；(4)加入與上清等體積的異丙醇，輕搖混勻，室溫放置5-10min；(5)4℃，12,000r/min離心10min，棄去上清，小心吸去剩余異丙醇；(6)加入1mL 75％的乙醇，充分洗滌沉淀，4℃，7,500r/min離心1min，短暫離心，吸去剩余乙醇，重復(fù)一次該步驟；(7)室溫晾干乙醇，加入20μL DEPC處理水使RNA充分溶解；(8)取1uL左右的樣品進(jìn)行電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，并用紫外分光光度儀檢測(cè)RNA濃度和質(zhì)量。

達(dá)氏鱘轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序、拼接及組裝并查找微衛(wèi)星位點(diǎn)：

RNA樣品檢測(cè)合格后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA。隨后加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物(random hexamers)合成一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs和DNA polymerase I和RNase H合成二鏈cDNA，再用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA先進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，再用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇。最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，得到最終的文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建完成后，先使用Qubit2.0進(jìn)行初步定量，稀釋文庫(kù)至1.5ng/ul，隨后使用Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的insert size進(jìn)行檢測(cè)，insert size符合預(yù)期后，使用Q-PCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫(kù)有效濃度＞2nM)，以保證文庫(kù)質(zhì)量，經(jīng)CASAVA 1.8軟件進(jìn)行堿基識(shí)別(Base Calling)和Bcl2Fastq分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列。去除原始序列的接頭和低質(zhì)量序列，獲得高質(zhì)量序列，采用Trinity軟件對(duì)其進(jìn)行從頭組裝，得到147,265個(gè)達(dá)氏鱘的Unigenes。用QDD3軟件在Unigenes序列中進(jìn)行微衛(wèi)星位點(diǎn)的查找，隨機(jī)挑選出80對(duì)SSR序列用Primer3軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

達(dá)氏鱘基因組DNA提?。?/p>

達(dá)氏鱘DNA的制備采用CTAB法進(jìn)行，具體步驟如下：(1)將達(dá)氏鱘的鰭條約30mg放入1.5mL離心管中；(2)離心管中加入500μL的組織裂解液(Tris-HCl 10mM，EDTA 100mM，SDS 0.6％，NaCl 400mM，10M NaOH調(diào)節(jié)pH＝7.5)，用干凈的剪刀將組織剪碎，離心管中加入1μl 20mg/ml蛋白酶K；(3)55℃水浴3h，每隔半個(gè)小時(shí)輕輕顛倒混勻；(4)向離心管中加入120μl飽和NaCl，混勻，冰上放置5～10min；(5)4℃，12000r/min離心10min，并轉(zhuǎn)移上清液(約500μL)到另一干凈1.5mL離心管中；(6)加入等體積的異丙醇，輕搖，放置5min；(7)4℃，12000r/min離心10min，棄上清液；(8)加入1ml 70％預(yù)冷的乙醇洗滌DNA沉淀一次，自然晾干后以適量雙蒸水溶液溶解DNA樣品；(9)取1uL左右的樣品進(jìn)行電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

微衛(wèi)星位點(diǎn)PCR擴(kuò)增和多態(tài)性驗(yàn)證：

以達(dá)氏鱘的DNA為模板，在已獲得的微衛(wèi)星位點(diǎn)中隨機(jī)選取，根據(jù)其兩端序列，利用Primer3軟件設(shè)計(jì)微衛(wèi)星位點(diǎn)的特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系為10μL，包括50ng基因組DNA，1×PCR緩沖液，Mg2+(1.5mM)，1U Taq酶，dNTPs 0.2mM，正反引物均為0.25μM。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，退火30s(各個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的最佳退火溫度不同)，72℃延伸30s，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸8min，最后4℃保存。

PCR擴(kuò)增完成后，利用8％的非變性聚丙烯凝膠電泳驗(yàn)證其多態(tài)性，具體步驟如下：(1)膠的制備：用自來(lái)水和洗滌劑把玻璃長(zhǎng)板和耳板洗凈晾干后夾緊，配制PAGE膠(純水41mL，5×TBE Buffer14mL,40％丙烯酰胺14mL，10％APS650μL，TEMED65μL)并沿灌膠口灌進(jìn)兩個(gè)板中間，輕輕插上梳子，聚合至少2h。(2)電泳：將玻璃板放入電泳槽，上下槽分別加入0.5×TBE Buffer，將梳子拔出并加樣，150V恒電壓電泳120min。(3)銀染：電泳完成后將膠取出，用純水浸泡片刻；用0.1％AgNO₃浸泡并輕搖20min左右；用純水搖晃洗滌；稱取10g NaOH和0.4g Na₂CO₃配制0.5L顯色液，量取1.5mL甲醛加入其中，輕搖顯色；待顯色完畢，條帶清晰，將膠放在純水中終止顯色；(4)置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照，篩選出不同位點(diǎn)具有擴(kuò)增穩(wěn)定，雜帶少的微衛(wèi)星引物。

對(duì)微衛(wèi)星引物多態(tài)性的檢測(cè)：

分別用FAM、HEX、TAMRA三種熒光對(duì)非變性聚丙烯凝膠電泳初篩后有多態(tài)性的引物進(jìn)行標(biāo)記，選取43個(gè)達(dá)氏鱘個(gè)體DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

將擴(kuò)增產(chǎn)物避光保存，在ABI 3730XL測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳和STR分析以確定達(dá)氏鱘微衛(wèi)星標(biāo)記在不同個(gè)體上的等位基因大小。

遺傳多樣性分析：根據(jù)每個(gè)微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物的等位基因大小確定基因型，用ATetra軟件計(jì)算期望雜合度，Shannon-wiener多樣性指數(shù)以及檢測(cè)哈迪-溫伯格平衡，以此來(lái)描述達(dá)氏鱘相關(guān)微衛(wèi)星DNA多態(tài)性的特征。

如表1所示，在43個(gè)達(dá)氏鱘樣本中對(duì)上述8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析的結(jié)果表明：微衛(wèi)星標(biāo)記的期望雜合度的范圍從0.3831到0.8369，Shannon-Wiener多樣性指數(shù)從0.6541到1.9663，從而證明本發(fā)明篩選的微衛(wèi)星標(biāo)記和設(shè)計(jì)的引物具有遺傳多態(tài)性。

表1 8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性相關(guān)信息

綜上所述，本發(fā)明開發(fā)出了達(dá)氏鱘8個(gè)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)。本發(fā)明的微衛(wèi)星標(biāo)記及其擴(kuò)增引物還可用于達(dá)氏鱘的遺傳多樣性、放流效果評(píng)估、親緣關(guān)系分析及分子標(biāo)記輔助育種等領(lǐng)域研究。

本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，除非另外定義，這里使用的所有術(shù)語(yǔ)(包括技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ))具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員的一般理解相同的意義。還應(yīng)該理解的是，諸如通用字典中定義的那些術(shù)語(yǔ)應(yīng)該被理解為具有與現(xiàn)有技術(shù)的上下文中的意義一致的意義，并且除非像這里一樣定義，不會(huì)用理想化或過(guò)于正式的含義來(lái)解釋。

最后所應(yīng)說(shuō)明的是：以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解：依然可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所

<120> 一種達(dá)氏鱘微衛(wèi)星標(biāo)記及其篩選方法和應(yīng)用

<130> 權(quán)利要求書、說(shuō)明書

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 156

<212> DNA

<213> ADX11分子標(biāo)記核苷酸序列

<400> 1

aaacttactg agaacctgga gcgtgacaga gatcacatgc ggggcaagca gtctaaaaac 60

aagaaacaag agtggaagaa caagcagaag aagcaccaca agcagcttcc tagcagcagc 120

agcagcagca gcagttctag tggcagcaat tctagc 156

<210> 2

<211> 352

<212> DNA

<213> ADX13分子標(biāo)記核苷酸序列

<400> 2

gttctgtagc aagacacgtg aagggttcca gttgcagaaa tgctacaaac gagagatgca 60

gaagagattc ttgcatatga acacgtgcag tctagctgct gtatgaaact cttgatctgc 120

ctccagaaac tgtcatttat cttatgaaca atattgaaca tgcagaacaa tttcctgagt 180

ttgcatcggc gtgacatggg ccacggagag agagagagag agagagagag agagagagag 240

agagagagag agagagagag agagagaaga acacaaatag aactgctgct aagtccttag 300

aggtttttaa atctgagatg ttatctgccc atccctgttg tgaatgaatt tc 352

<210> 3

<211> 277

<212> DNA

<213> ADX23分子標(biāo)記核苷酸序列

<400> 3

gtgcgagatg ctctttgggc gagagaggga gggagggagg gagggaggga gggagggagg 60

gagacctgcc agtcctcagg gctctgcaca cgcatcacaa tcaagaaaac cactccagag 120

ctcccgttgt caaggtaacc tcttgttgcc gtgcgtgccg tcatgctccg tccctccctc 180

aggctgagag cagctgtaac caggccctgg gtcccacgca ctgactcact gcagccctgt 240

cccagagcca gcagccattt cctgtttctc acggagc 277

<210> 4

<211> 153

<212> DNA

<213> ADX31分子標(biāo)記核苷酸序列

<400> 4

cctatgacaa cccagtaaat ggtgataagc tgcatgtatg tatgtatgta tgtatgtatg 60

tatgtatgta tgtatgtatg tatgtatgta aaaactgaaa tagttacttt ctaaataaga 120

aaaggaaaaa acatgtaggg ctcattgaat tct 153

<210> 5

<211> 209

<212> DNA

<213> ADX37分子標(biāo)記核苷酸序列

<400> 5

tgtggaattt ctataacctt gagcagatag gagtctgaat gttgtaactt ctagagaaat 60

aacaggggtt ggttagttca gcttttggta gttaagctat gaaataaata atattgcgtc 120

tccactgcaa aatgctttct ttctttcttt ctttctttct ttctttcttt ctttctttct 180

ttctttcacc aatctttttg catgttata 209

<210> 6

<211> 355

<212> DNA

<213> ADX44分子標(biāo)記核苷酸序列

<400> 6

atggactgac atagaaagag gaaatcaaag aaagaaaagt aaaagaaaag aaaaaagaca 60

aaaaaattaa taataaacaa ataaaaaatc ctattttgca gattttcacg aggactgtag 120

caatttattt tcatggcaat tattacaagt gaaaatattt ccatacagta tatggagggc 180

agcttaagag gagcaacact tgtgtatgtc tgtcctttct tccctggttg ttgctagtgc 24

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 300

cgtgtatcat gtgtaacttt aaatgaggta aacttaacac aatgtatttg ctttg 355

<210> 7

<211> 204

<212> DNA

<213> ADX54分子標(biāo)記核苷酸序列

<400> 7

acaatgaaag actcctccac acgcgcgcag cacaggtgat taaaaagacc tttatatttc 60

ttccagtatc caatttaagt acttaaaaaa tgttcaaatg gtttgtttat ttatttattt 120

atttatttat ttatttaagg taatagaaaa gtgtatattt ttttttaaag aaagtgtttt 180

gtaattcaat tagatctggg cgag 204

<210> 8

<211> 182

<212> DNA

<213> ADX64分子標(biāo)記核苷酸序列

<400> 8

gttgctgttg tccttcattc agtaagtgtt gctgtcggtc tctgtgtgtg tgtgtgtgtg 60

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg cgcgctcctg aatgtacagg gatgagaggc tgctgttctc 120

ctggttctgc aggtgctgag tagaggatat tattcatgga ggtgagatgt gtatgggggg 180

ag 182

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> ADX11引物正向序列

<400> 9

aaacttactg agaacctgga gc 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> ADX11引物反向序列

<400> 10

gctagaattg ctgccactag aa 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> ADX13引物正向序列

<400> 11

gttctgtagc aagacacgtg aa 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> ADX13引物反向序列

<400> 12

gaaattcatt cacaacaggg at 22

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> ADX23引物正向序列

<400> 13

gtgcgagatg ctctttggg 19

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> ADX23引物反向序列

<400> 14

gctccgtgag aaacaggaaa t 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> ADX31引物正向序列

<400> 15

cctatgacaa cccagtaaat g 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> ADX31引物反向序列

<400> 16

agaattcaat gagccctaca t 21

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> ADX37引物正向序列

<400> 17

tgtggaattt ctataacctt ga 22

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> ADX37引物反向序列

<400> 18

tataacatgc aaaaagattg gt 22

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> ADX44引物正向序列

<400> 19

atggactgac atagaaagag gaa 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> ADX44引物反向序列

<400> 20

caaagcaaat acattgtgtt aag 23

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> ADX54引物正向序列

<400> 21

acaatgaaag actcctccac ac 22

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> ADX54引物反向序列

<400> 22

ctcgcccaga tctaattgaa 20

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> ADX64引物正向序列

<400> 23

gttgctgttg tccttcattc a 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> ADX64引物反向序列

<400> 24

ctccccccat acacatctca c 21