本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種與桃抗蚜基因緊密連鎖的SNP標(biāo)記的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

桃[Prunus persica(L.)Batsch]汁多味美，營養(yǎng)豐富，是深受我國人們喜愛的傳統(tǒng)果品。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織數(shù)據(jù)，2013年我國桃栽培面積1166萬畝，產(chǎn)量1195萬噸，分別占世界栽培總面積和總產(chǎn)量的50.5％和55.0％(FDA)。同時(shí)，桃也是我國的第三大落葉果樹，廣泛栽培于全國各地，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)重要組成部分。

蚜蟲為半翅目昆蟲，包含近5000種，是世界上種類最多、分布最廣、危害最嚴(yán)重的植食刺吸式昆蟲。蚜蟲為害輕則影響植物生長，重者直接導(dǎo)致新梢甚至樹體死亡，此外，蚜蟲還是眾多植物病毒的攜帶和傳播媒介。桃蚜以桃樹為初始寄主，從桃樹萌芽期開始寄居于桃幼嫩新梢和葉片，以孤雌繁殖方式快速增殖，直接危害桃新梢及幼葉，取食汁液，導(dǎo)致桃葉片卷曲、新梢生長受限，同時(shí)，桃蚜還為害幼果，導(dǎo)致果實(shí)畸形，品質(zhì)下降。

目前，蚜蟲的防治主要以化學(xué)防治為主，但農(nóng)藥的大范圍、長期、持續(xù)使用很容易導(dǎo)致蚜蟲抗藥性的產(chǎn)生，導(dǎo)致防治難度和成本持續(xù)增加。在我國和美國、法國、西班牙等歐美國家，桃蚜已對近些年來應(yīng)用最廣泛的煙堿類殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性?？寡列滤幯邪l(fā)周期長、成本高昂，在與蚜蟲進(jìn)化的賽跑中已顯吃力。植物抗蚜資源挖掘和抗性品種的培育應(yīng)用可以減少農(nóng)藥使用和殘留、保護(hù)益蟲群體和病毒傳播等。在美國，僅抗蚜苜蓿和高梁品種的使用每年就可以產(chǎn)生高達(dá)25億元的效益。

通過確定與抗蚜基因緊密連鎖的分子標(biāo)記可以實(shí)現(xiàn)早期對目標(biāo)性狀進(jìn)行分子鑒定，利于加快獲得抗蚜性狀的桃品種，提高育種效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題：本發(fā)明提供一種與桃抗蚜基因緊密連鎖的SNP分子標(biāo)記的應(yīng)用。

技術(shù)方案：與桃抗蚜基因緊密連鎖的SNP分子標(biāo)記在桃樹育種中的應(yīng)用，所述分子標(biāo)記為KyHRM-17-45.71和KyHRM-3-46.12，分別位于桃基因組(Version 2.0)Scaffold 1的45.713Mb和46.121Mb處，其中KyHRM-17-45.71的等位基因?yàn)門和G，序列如SEQ ID NO.1所示：ACTCGAAACTCGTTTAACAAAACAAGTCACAGAACAACCGCAAGTGTACGTAAGCAATCCAACATCCAACTACATGCAACCGA，KyHRM-3-46.12的等位基因?yàn)镃和G，序列如SEQ ID NO.2所示：GCAGCAACGAAACAGGGTTACTAACTGGACAAAGCATTAAGATGTTTGCTTTTCATTTTTTCAGAAAATAAACTTAACCCCGGGAGCAATTTGGAACATATACATTTGTGAAAACAGAAGCTTACAAGTTGTGGCATCATCCTCGCTCATTCCAAGGAAGAGAGCTGT。下劃線表示等位基因位點(diǎn)。

所述KyHRM-17-45.71位點(diǎn)基因型為T，KyHRM-3-46.12抗蚜位點(diǎn)基因型為G。

檢測權(quán)利要求1所述與桃抗蚜基因緊密連鎖的SNP分子標(biāo)記的引物對，

KyHRM-17-45.71：5-CGGTTGCATGTAGTTGGATGTT-3

5-CCGGCCGGCTATACTATTTCT-3

KyHRM 3-46.12：5-GCAGCAACGAAACAGGGTTA-3

5-ACAGCTCTCTTCCTTGGAATGA-3

檢測雜交后代單株的引物對：

KYYZ-SNP：5-CGAATCGCAATTTCCTCCTCA-3

5-AGTATGCTTTCACCTGCCCT-3。

一種檢測抗蚜桃的試劑盒，含有KyHRM-17-45.71和KyHRM 3-46.12所述的引物對。

上述檢測抗蚜桃的試劑盒，還含有KYYZ-SNP所述的引物對。

與桃抗蚜基因緊密連鎖的SNP標(biāo)記，所獲得的SNP標(biāo)記為KyHRM-17-45.71和KyHRM3-46.12，分別位于桃基因組(Version 2.0)Scaffold 1的45.713Mb和46.121Mb處，主要通過如下方法得到：

(1)采用人工接種和套袋的方法對雜交后代單株進(jìn)行表型鑒定，根據(jù)蚜蟲危害特征進(jìn)行表型評價(jià)，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性；

(2)以抗蚜的01-77-3為母本，感蚜的中油13號為父本進(jìn)行雜交，并獲得雜交分離群體，在前期鑒定抗蚜和感蚜表型的基礎(chǔ)上，對雜交后代單株的抗蚜和感蚜表型進(jìn)行鑒定，根據(jù)表型鑒定結(jié)果確定分離比例；

(3)參考Genome Database for Rosaceae數(shù)據(jù)庫的桃基因組(Version 2.0)序列，采用primer3Web Version 4.0(http://primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)引物，約每1Mb設(shè)計(jì)1對引物，擴(kuò)增片段長度為約1600bp，用于開發(fā)基于Sanger測序的SNP標(biāo)記；

(4)基因組DNA的提取采用CTAB法，略作修改；

(5)基于Sanger測序法獲得SNP標(biāo)記，并根據(jù)母本和父本的基因型確定候選SNP標(biāo)記，并在雜交群體單株中進(jìn)行序列測定，確定交換單株并進(jìn)行精細(xì)定位；

(6)在精細(xì)定位區(qū)間內(nèi)，結(jié)合母本為Aa，父本為aa的基因型開發(fā)緊密連鎖的SNP標(biāo)記，以進(jìn)行性狀鑒定。

有益效果：本發(fā)明采用基于SNP的第三代標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合構(gòu)建的分離雜交群體，采用圖位克隆的方法，對桃抗蚜的基因進(jìn)行了精細(xì)定位，在精細(xì)定位區(qū)域內(nèi)，開發(fā)穩(wěn)定的、共顯性和多態(tài)性的SNP標(biāo)記，以獲得與目標(biāo)性狀緊密連鎖的標(biāo)記。由于研究的對象具有抗蚜性狀的種質(zhì)，可依據(jù)獲得的緊密連鎖標(biāo)記克隆目標(biāo)性狀的基因，應(yīng)用于分子輔助選種。

附圖說明

圖1抗蚜表型圖；

圖2感蚜表型圖；

圖3 DNA瓊脂糖電泳圖(M1和M2為DNAmarker，1-7為部分提取DNA樣品)；

圖4與抗蚜基因緊密連鎖的SNP標(biāo)記KyHRM-3-46.12的基因分型結(jié)果示意圖；

圖5與抗蚜基因緊密連鎖的SNP標(biāo)記KyHRM-17-45.71的測序峰圖和SNP位點(diǎn)示意圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

(一)、抗蚜表型的鑒定和群體構(gòu)建

(1)抗蚜表型的鑒定

以01-77-3(抗蚜)為母本，中油桃13號(感蚜)為父本進(jìn)行雜交，手工去雄并后人工授粉，行人工雜交后代108株實(shí)生苗分別放入網(wǎng)室中進(jìn)行接種處理，人工接種綠蚜10頭后套上小紗網(wǎng)，觀察蚜蟲對新梢的危害，以確定抗蚜和感蚜的表型，其中呈紅點(diǎn)狀無其他危害癥狀的為抗蚜類型(圖1)，明顯危害癥狀的為感蚜類型(圖2)。

(二)、雜交群體分離表型的鑒定

本發(fā)明以01-77-3(抗蚜)和中油桃13號(感蚜)進(jìn)行雜交，共得到108個(gè)實(shí)生苗單株。定植后于2014年4月進(jìn)行人工接種蚜蟲進(jìn)行抗蚜、感蚜評價(jià)。通過對后代單株進(jìn)行表型評價(jià)，發(fā)現(xiàn)其中抗蚜52株，感蚜56株，二者比例接近1:1，P值為0.700，符合孟德爾遺傳規(guī)律，抗蚜性狀為顯性單基因控制。

(三)、基因組DNA的提取，SNP標(biāo)記的開發(fā)、目標(biāo)性狀的定位

(1)基因組DNA的提取

采用CTAB法提取桃葉片基因組DNA，略作修改，具體如下：(1)取新鮮的葉子，放入玻璃碾缽中，加入液N₂進(jìn)行碾磨，直至碾磨細(xì)粉狀為止；(2)將葉片粉末轉(zhuǎn)入2mL離心管，再加入配制好的CTAB液1300μL，進(jìn)行1h長的65℃水浴，其間約每10min輕搖勻；(3)加入氯仿和異戊醇混合液，體積比為24：1，直至2mL的離心管滿載線，后緩慢顛倒混勻10分鐘。放入冷凍離心機(jī)(Eppendorf 5810R)4℃條件下，12000rpm,離心10分鐘；(4)吸取約1mL的上清液，轉(zhuǎn)入2mL的離心管，加入氯仿和異戊醇的混合液，體積比為24:1，直至離心管滿載線，輕輕顛倒搖勻10min。放入冷凍離心機(jī)(Eppendorf 5810R)，4℃條件下，12000rpm,離心10分鐘；(6)二次抽提后，用200μL的移液器小心吸取上清液600μL于1.5mL管中，加入等體積的無水乙醇，于-20℃冰箱1小時(shí)。之后，4℃條件下，12000rpm，離心10分鐘，棄上清液；(8)在帶有沉淀的離心管中加入500μL的70％的乙醇，10000rpm瞬時(shí)離心，洗滌沉淀2次，加入無水乙醇洗滌沉淀一次，用200μL移液器(Eppendorf)吸除離心管底部剩余無水乙醇，后自然晾干；(9)在室溫下自然風(fēng)干沉淀后，加入100μL體積的0.1×TE溶解沉淀DNA，同時(shí)加入0.5μL的RNase，37℃放置1h，祛除RNA污染(長期保存在-20℃冰箱，常用則存于4℃冰箱)；(10)采用NanoDrop 1000spectrophotometer(Themo)和1％的瓊脂糖膠對提取的DNA進(jìn)純度濃度和完整度進(jìn)行檢測，并稀釋成工作液濃度(25ng/μL)，以用于后續(xù)研究。

(2)SNP開發(fā)的引物設(shè)計(jì)

參考Genome Database for Rosaceae數(shù)據(jù)庫的桃基因組序列，采用primer3Web Version4.0(http://primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)引物，引物參數(shù)為退火溫度在60-63℃之間，引物長度20-23bp，開發(fā)基于Sanger測序的SNP標(biāo)記，選擇每1Mb設(shè)計(jì)1對引物，擴(kuò)增片段長度約為1600bp。

(3)PCR反應(yīng)體系以及SNP標(biāo)記的獲得

PCR擴(kuò)增體系總體積為40μL，具體組分如下：

混勻后，在離心機(jī)(5810R，Eppendorf)離心，并在PCR儀(Eppendorf)上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃3min；94℃30s，54.3℃30s，72℃90s，34個(gè)循環(huán)；72℃10min。

我們對親本、后代各兩個(gè)單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行序列測定，將測序結(jié)果在Contig軟件中打開，序列對齊后尋找多態(tài)性SNP標(biāo)記。

(4)基于HRM(High Resolution Melting)的SNP基因分型

在獲得親本基因型和表型一直的SNP后，我們采用了HRM技術(shù)對雜交組合后代群體單株進(jìn)行SNP基因分型。HRM master mix試劑購自Roche，在LightCycler 480II定量PCR儀(Roche)上進(jìn)行SNP基因分型，HRM分析參考說明書進(jìn)行。

(三)、目標(biāo)性狀緊密連鎖標(biāo)記的開發(fā)

基于測序結(jié)果，尋找緊密連鎖的SNP標(biāo)記，表現(xiàn)為抗蚜型母本基因型為Aa、感蚜父本基因型為aa，子代表型與基因型一致。在4個(gè)子代中獲得緊密連鎖的SNP標(biāo)記后，擴(kuò)大至子代各20個(gè)單株中，進(jìn)而擴(kuò)大至全部后代單株樣品，確定緊密連鎖的SNP標(biāo)記后，繼續(xù)開發(fā)SNP標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)精細(xì)定位。在精細(xì)定位區(qū)間依據(jù)父母本的基因型和表型開發(fā)更多的SNP標(biāo)記，用于區(qū)分不同雜交后代單株，確立緊密連鎖的SNP標(biāo)記。

(四)、基于分子標(biāo)記的植株表型鑒定

根據(jù)已經(jīng)獲得的緊密連鎖的SNP標(biāo)記的物理位置，參考桃基因組數(shù)據(jù)在新的親本(10-7*96-5-1)中開發(fā)表型和基因型一致的SNP標(biāo)記KYYZ-SNP。即在同一位點(diǎn)，抗蚜親本基因型為Aa，感蚜基因型為aa，目的是利用分子標(biāo)記對雜交后代單株的表型進(jìn)行鑒定。通過標(biāo)記表型和基因型比較，顯示驗(yàn)證符合率為100％。

表1本發(fā)明所采用緊密連鎖SNP標(biāo)記的引物信息

SEQUENCE LISTING

<110> 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所

<120> 與桃抗蚜基因緊密連鎖的SNP分子標(biāo)記的應(yīng)用

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

actcgaaact cgtttaacaa aacaagtcac agaacaaccg caagtgtacg taagcaatcc 60

aacatccaac tacatgcaac cga 83

<210> 2

<211> 168

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcagcaacga aacagggtta ctaactggac aaagcattaa gatgtttgct tttcattttt 60

tcagaaaata aacttaaccc cgggagcaat ttggaacata tacatttgtg aaaacagaag 120

cttacaagtt gtggcatcat cctcgctcat tccaaggaag agagctgt 168

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cggttgcatg tagttggatg tt 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccggccggct atactatttc t 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcagcaacga aacagggtta 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acagctctct tccttggaat ga 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgaatcgcaa tttcctcctc a 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agtatgcttt cacctgccct 20