本發(fā)明涉及一組用于癌癥診斷的CDK4基因外顯子基因群及其引用，以及一種基于所述CDK4基因外顯子基因群的癌癥診斷試劑盒。

(二)

背景技術(shù)：

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，目前癌癥的死亡率已超過冠狀動(dòng)脈心臟病和腦卒中成為死亡率排名第一的慢性疾病，嚴(yán)重威脅人類健康。世界范圍內(nèi)，2012年全球新發(fā)癌癥病例1410萬，死亡820萬，肺癌和乳腺癌分別位居男性和女性惡性腫瘤發(fā)病和死亡首位。癌癥的發(fā)病機(jī)制依舊不明確，但與人口增長(zhǎng)和老齡化、微生物感染、吸煙、飲食習(xí)慣、家族腫瘤史和環(huán)境污染等密切相關(guān)。我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率總體呈上升趨勢(shì)，每年以3％-5％的速度遞增。由于惡性腫瘤細(xì)胞具有容易侵襲和轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，且臨床就診者多為中晚期患者，延誤了早期治療的最佳時(shí)機(jī)，導(dǎo)致治療方法選擇有限和治療效果不理想。未經(jīng)治療的癌癥患者五年生存率極低，約為0-14％，因此早期診斷、獲得根治性切除是患者長(zhǎng)期生存的唯一方式。

癌癥診斷方法包括光學(xué)和形態(tài)學(xué)的檢查等，但是由于腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟，涉及到多個(gè)基因的過程，即使同一個(gè)腫瘤中也存在不同特性的細(xì)胞，生長(zhǎng)速率，免疫特性和侵襲轉(zhuǎn)移性不同，因此癌癥診斷的準(zhǔn)確度和靈敏度不高。隨著癌癥的發(fā)病機(jī)制的研究越來越廣泛，分子生物標(biāo)記物在其中的重要性越來越明顯。這些標(biāo)記物已成為癌癥診斷和治療的重要靶點(diǎn)。

Cyclin-Dependent Kinase 4(CDK4)基因位于12q13-q14，是細(xì)胞周期G1期的重要調(diào)控因子，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族。抑制CDK4基因的表達(dá)可導(dǎo)致白血病細(xì)胞的終末分化，而CDK4基因的過表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失去控制最終惡性轉(zhuǎn)化。CDK4基因核苷酸序列共4721bp。其中包含8個(gè)外顯子，分別是：Exon 1，1-273bp；Exon 2，274-510bp；Exon 3，511-646bp；Exon 4，647-814bp；Exon 5，815-924bp；Exon 6，925-975bp；Exon 7，976-1111bp；Exon 8,1112-2002。

基因擴(kuò)增是指細(xì)胞內(nèi)特定基因拷貝數(shù)特異性大量增加的現(xiàn)象，按擴(kuò)增范圍的不同進(jìn)而分為全基因組擴(kuò)增及特定基因簇的擴(kuò)增，常見于生物發(fā)育及腫瘤發(fā)生等過程，是癌基因激活的主要機(jī)制。細(xì)胞內(nèi)選擇性復(fù)制DNA，從而產(chǎn)生大量的拷貝，最終可能導(dǎo)致基因產(chǎn)物的過表達(dá)，過表達(dá)程度隨腫瘤類型的不同而存在差異。發(fā)明人在癌癥患病人群中發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織相比，癌組織中的CDK4基因的一個(gè)或多個(gè)外顯子發(fā)生擴(kuò)增，即外顯子不同程度的擴(kuò)增引起CDK4基因核苷酸序列的改變，進(jìn)而導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物增加，這將有助于惡性腫瘤的精確診斷。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一組用于癌癥診斷的CDK4基因外顯子基因群及其引用，以及一種基于所述CDK4基因外顯子基因群的癌癥診斷試劑盒。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一組用于癌癥診斷的CDK4基因外顯子基因群，由以下基因序列組成：

SEQ ID No.1所示的Exon 1片段：

ccccatacacccgagctcggtccggagcagctggacgcagagggcccgaccatagacacaggccgcaagctagagaggccccctcacccccaccctcaccatgtgaccagctgccaaagag

SEQ ID No.2所示的Exon 2片段：

gagccagtggctgaaattggtgtcggtgcctatgggacagtgtacaaggcccgtgatccccacagtggccactttgtggc

cctcaagagtgtgagagtccccaatggaggaggaggtggaggaggccttcccatcagcacagttcg

SEQ ID No.3所示的Exon 3片段：

gatcgtttcggctggcaagcctggtgggggtgccttgtccagatatgtccttaggtcctggtctacatgctcaaacaccagggttaccttgatctcccggtcagtt

SEQ ID No.4所示的Exon 4片段：

agcttgactgttccaccacttgtcaccagaatgttctctggcttcagatctcggtgaacgatgcaattggcatgaaggaa

atctaggcctcttagaaactggcg

SEQ ID No.5所示的Exon 5片段：

tcgacgaaacatctctgcaaagatacagccaacactccacatgtccacaggtgttgcatatgtggactgcagaagaacttcgggagctcggtaccagagtgta

SEQ ID No.6所示的Exon 6-7片段：

tcccgactcctccatctcaggtaccaccgactgcactgggcggggccctctggggggaaaggctccacggggcagggatacatctcgaggccagtcatcctctggaggcagcccaatcaggctgtgggggacaggagaactctggtcaggagggtcctccagttcccatccccatgggcagagccagttgccatcctgggttcagcagaaagaggactcagaatagaaaatctttttctc

ccatgttggtcacttactcaaagattttgcccaactggtcggcttcagagtttccac

SEQ ID No.7所示的Exon 8片段：

tccaaatcgcacaatggcaaagccaaacagaggaagaaacattaaaaaaaaaaaaaagaccattatttctttgttttgtt

tttcctgtataaaaaaggaccccaaatataaaggtagggaaagggacaagagggaa

Exon 1完整序列如下：

Exon 2完整序列如下：

Exon 3完整序列如下：

Exon 4完整序列如下：

Exon 5完整序列如下：

Exon 6完整序列如下：

gcctct cttctgtgga aactctgaag ccgaccagtt gggcaaaatc tttga

Exon 7完整序列如下：

Exon 8完整序列如下：

本發(fā)明還涉及所述的CDK4基因外顯子基因群在制備癌癥診斷試劑盒中的應(yīng)用。

具體的，所述應(yīng)用為：以所述CDK4基因外顯子基因群為基因診斷標(biāo)記物，設(shè)計(jì)相應(yīng)擴(kuò)增引物，添加相應(yīng)PCR擴(kuò)增試劑組成癌癥診斷試劑盒。

本發(fā)明還涉及基于所述CDK4基因外顯子基因群的癌癥診斷試劑盒，主要包括PCR特異性擴(kuò)增引物和PCR反應(yīng)試劑，其特征在于所述PCR特異性擴(kuò)增引物序列如下：

Exon 1：

上游引物：5’-CTCTTTGGCAGCTGGTCAC-3’；

下游引物：5’-CCCCATACACCCGAGCTC-3’；

Exon 2：

上游引物：5’-AGTGGCTGAAATTGGTGTCG-3’；

下游引物：5’-CGAACTGTGCTGATGGGAAG-3’；

Exon 3：

上游引物：5’-AACTGACCGGGAGATCAAGG-3’；

下游引物：5’-GATCGTTTCGGCTGGCAAG-3’；

Exon 4：

上游引物：5’-CGCCAGTTTCTAAGAGGCCT-3’；

下游引物：5’-AGCTTGACTGTTCCACCACT-3’；

Exon 5：

上游引物：5’-TACACTCTGGTACCGAGCTC-3’；

下游引物：5’-TCGACGAAACATCTCTGCAA-3’；

Exon 6-7：

上游引物：5’-GTGGAAACTCTGAAGCCGAC-3’；

下游引物：5’-TCCCGACTCCTCCATCTCA-3’；

Exon 8：

上游引物：5’-TTCCCTCTTGTCCCTTTCCC-3’；

下游引物：5’-TCCAAATCGCACAATGGCAA-3’。

所述試劑盒通過檢測(cè)CDK4基因外顯子擴(kuò)增及該基因表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平進(jìn)行診斷，所述試劑盒主要包括：檢測(cè)CDK4基因不同外顯子擴(kuò)增的特異性引物(RT-PCR診斷試劑盒或熒光定量PCR診斷試劑盒)，以及檢測(cè)用試劑(相應(yīng)PCR反應(yīng)所需要的試劑)。所述癌癥診斷包含判斷受試者是否已患癌癥，也包含判斷受試者是否存在患有癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。

所述試劑盒可包括擴(kuò)增內(nèi)源對(duì)照基因GAPDH的特異性引物：

上游引物：5’-AACGTGTCAGTGGTGGACCTG-3’；

下游引物：5’-AGTGGGTGTCGCTGTTGAAGT-3’。

所述試劑盒還可包括CDK4基因外顯子基因群標(biāo)準(zhǔn)品：

SEQ ID No.1所示的Exon 1片段；

SEQ ID No.2所示的Exon 2片段；

SEQ ID No.3所示的Exon 3片段；

SEQ ID No.4所示的Exon 4片段；

SEQ ID No.5所示的Exon 5片段；

SEQ ID No.6所示的Exon 6-7片段；

SEQ ID No.7所示的Exon 8片段。

以CDK4基因外顯子基因群標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照，可對(duì)待測(cè)樣本中CDK4外顯子擴(kuò)增進(jìn)行定量檢測(cè)。所述癌癥優(yōu)選為腸癌或乳腺癌。

所述基因檢測(cè)試劑盒PCR反應(yīng)試劑為常規(guī)PCR反應(yīng)所需試劑，包括dNTP、Mg²⁺、Taq酶(熱啟動(dòng)酶)、PCR緩沖液、SYBR GreenⅡ等。

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了CDK4基因外顯子不同程度的擴(kuò)增與癌癥密切相關(guān)，通過檢測(cè)受試者組織中CDK4的基因外顯子的擴(kuò)增程度，可以判斷受試者是否已患有癌癥或是否存在患有癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，從而給臨床醫(yī)師提供預(yù)防或治療方案。

本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種癌癥新的分子診斷指標(biāo)CDK4基因外顯子擴(kuò)增，提供了其在制備癌癥診斷試劑盒中的應(yīng)用，以及一種癌癥診斷試劑盒，與傳統(tǒng)的檢測(cè)手段相比，分子標(biāo)志物的診斷更及時(shí)、更特異，從而提高癌癥患者的5年生存率，降低死亡率，應(yīng)用前景廣闊。

(四)附圖說明

圖1為乳腺癌和腸癌腫瘤標(biāo)本中CDK4基因Exon 2的擴(kuò)增曲線的代表圖；

圖2為CDK4基因Exon 1-8在5對(duì)乳腺癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁正常乳腺組織中的擴(kuò)增情況(**P<0.01)。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1：熒光定量PCR法檢測(cè)CDK4基因Exon 2在不同癌組織(腸癌和乳腺癌)和對(duì)應(yīng)的癌旁(腸及乳腺)正常組織的擴(kuò)增情況

1、分別收集1對(duì)腸癌和乳腺癌癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁腸及乳腺正常組織的樣本，所有組織標(biāo)本均由廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院標(biāo)本庫(kù)提供，每例患者標(biāo)本均有明確的診斷記錄，并通過倫理委員會(huì)的同意，收集標(biāo)本后凍存于液氮。

2、DNA樣品的制備

(1)樣品的前處理：從液氮罐中取出樣本，將30mg樣本放入2ml的無菌EP管中，加入600μL DNA提取液和20mg/ml蛋白酶K，用消毒的剪刀充分剪碎后65℃溫育1小時(shí)。

(2)12000rpm離心4min，取上清，加入新的1.5ml EP管。

(3)加入600μL酚氯仿后劇烈顛倒混勻30s，12000rpm離心4min，取上層含有DNA的水相，加入新的1.5ml EP管。

(4)加入700μL的異丙醇和150μL 3M的乙酸鈉，劇烈顛倒混勻30s，12000rpm離心4min。棄上清，可觀察到管底有白色DNA沉淀。

(5)洗滌：加入1mL 75％乙醇(滅菌雙蒸水配制)，12000rpm離1min，棄上清后重復(fù)該步驟。

(6)干燥：吸干管中的乙醇，室溫下干燥DNA沉淀2～3min。

(7)溶解：加入50μL滅菌雙蒸水溶解DNA沉淀。

(8)測(cè)定濃度：用Nanodrop 2000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA樣品的濃度。

3、熒光定量PCR檢測(cè)：

(1)在八連管中，每管配制熒光定量PCR反應(yīng)液，總體積20μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL，CDK4Exon 2上游引物0.8μL，CDK4Exon2下游引物0.8μL，ROX DyeⅡ0.4μL，DNA模板2μL，RNase Free dH₂O6μL。

(2)封蓋后放入PCR檢測(cè)儀(ABI ViiA7)中，程序設(shè)定為：50℃2min，95℃10min，接著40個(gè)循環(huán)：95℃15s，58℃60s。

4、結(jié)果：熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖顯示，與對(duì)應(yīng)的遠(yuǎn)處正常組織相比，CDK4基因Exon 2在腸癌和乳腺癌癌組織中出現(xiàn)不同程度的擴(kuò)增(圖1)。

實(shí)施例2：熒光定量PCR法檢測(cè)CDK4基因Exon 1-8在5對(duì)乳腺癌癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織的擴(kuò)增情況

1、收集5對(duì)乳腺癌癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁正常組織的樣本，所有組織標(biāo)本均由廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院標(biāo)本庫(kù)提供，每例患者標(biāo)本均有明確的診斷記錄，并通過倫理委員會(huì)的同意，收集標(biāo)本后凍存于液氮。

2.DNA提取和熒光定量PCR方法同實(shí)施例1。

3、數(shù)據(jù)分析：實(shí)驗(yàn)均按照重復(fù)3次完成，采用相對(duì)定量2^-△△Ct(△△Ct＝(癌組織CDK4Exon1-8Ct值-癌組織Exon1-8GAPDH Ct值)-(正常組織CDK4Exon1-8Ct值-正常組織Exon1-8GAPDH Ct值))的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GAPDH作為內(nèi)參基因，數(shù)據(jù)利用GraphPad 5.0軟件進(jìn)行分析，所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果均以P<0.05認(rèn)為存在顯著差異。

4.結(jié)果：與正常乳腺組織相比，癌組織CDK4基因Exon 1-7發(fā)生不同程度的顯著的擴(kuò)增，Exon 8的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

上述實(shí)施例的介紹僅用來理解本發(fā)明的方法及其核心內(nèi)容。特別需要指出，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行改進(jìn)和修飾，但這些改進(jìn)和修飾也將屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院

廈門稀土材料研究所

<120> 用于癌癥診斷的CDK4基因外顯子基因群及診斷試劑盒

<130>

<160> 21

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 120

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

gtgctgcgaa gtggaaacca tccgccgcgc gtaccccgat gccaacctcc tcaacgaccg 60

ggtgctgcgg gccatgctga aggcggagga gacctgcgcg ccctcggtgt cctacttcaa 120

<210> 2

<211> 146

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

gagccagtgg ctgaaattgg tgtcggtgcc tatgggacag tgtacaaggc ccgtgatccc 60

cacagtggcc actttgtggc cctcaagagt gtgagagtcc ccaatggagg aggaggtgga 120

ggaggccttc ccatcagcac agttcg 146

<210> 3

<211> 106

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

gatcgtttcg gctggcaagc ctggtggggg tgccttgtcc agatatgtcc ttaggtcctg 60

gtctacatgc tcaaacacca gggttacctt gatctcccgg tcagtt 106

<210> 4

<211> 104

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

agcttgactg ttccaccact tgtcaccaga atgttctctg gcttcagatc tcggtgaacg 60

atgcaattgg catgaaggaa atctaggcct cttagaaact ggcg 104

<210> 5

<211> 103

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 5

tcgacgaaac atctctgcaa agatacagcc aacactccac atgtccacag gtgttgcata 60

tgtggactgc agaagaactt cgggagctcg gtaccagagt gta 103

<210> 6

<211> 297

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 6

tcccgactcc tccatctcag gtaccaccga ctgcactggg cggggccctc tggggggaaa 60

ggctccacgg ggcagggata catctcgagg ccagtcatcc tctggaggca gcccaatcag 120

gctgtggggg acaggagaac tctggtcagg agggtcctcc agttcccatc cccatgggca 180

gagccagttg ccatcctggg ttcagcagaa agaggactca gaatagaaaa tctttttctc 240

ccatgttggt cacttactca aagattttgc ccaactggtc ggcttcagag tttccac 297

<210> 7

<211> 136

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 7

tccaaatcgc acaatggcaa agccaaacag aggaagaaac attaaaaaaa aaaaaaagac 60

cattatttct ttgttttgtt tttcctgtat aaaaaaggac cccaaatata aaggtaggga 120

aagggacaag agggaa 136

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 8

ctctttggca gctggtcac 19

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 9

ccccatacac ccgagctc 18

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 10

agtggctgaa attggtgtcg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 11

cgaactgtgc tgatgggaag 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 12

aactgaccgg gagatcaagg 20

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 13

gatcgtttcg gctggcaag 19

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 14

cgccagtttc taagaggcct 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 15

agcttgactg ttccaccact 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 16

tacactctgg taccgagctc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 17

tcgacgaaac atctctgcaa 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 18

gtggaaactc tgaagccgac 20

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 19

tcccgactcc tccatctca 19

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 20

ttccctcttg tccctttccc 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 21

tccaaatcgc acaatggcaa 20