本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及水稻抗褐飛虱基因Bph31(t)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：褐飛虱是水稻生產(chǎn)上的一種重要害蟲，不僅直接危害水稻，還在取食過程中傳播其他病害和病毒，嚴(yán)重威脅我國(guó)水稻的安全生產(chǎn)。發(fā)掘和鑒定新的抗蟲基因，選育抗蟲品種是最經(jīng)濟(jì)有效的防治手段。自20世紀(jì)60年代，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家開始篩選和鑒定抗褐飛虱材料，在栽培稻和野生稻材料中已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一大批抗蟲資源，截至目前，根據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)共有36個(gè)褐飛虱抗性基因得到鑒定，其中21個(gè)為顯性基因，15個(gè)為隱性基因，其中，30個(gè)主效的抗蟲基因已被命名。僅有2個(gè)抗蟲基因Bph14和BPH29被成功克隆(邱永福等，2014；Duetal.,2009；JenaandKim,2010；Huangetal.,2013；Heetal.,2013；Wuetal.,2014；Wangetal.,2015)。一些已鑒定的抗蟲基因已廣泛應(yīng)用于抗褐飛虱的分子標(biāo)記輔助育種中，并取得了顯著的進(jìn)展。然而近年研究發(fā)現(xiàn)，僅具有某一個(gè)主效抗蟲基因的水稻品種在生產(chǎn)上極易喪失抗性，而一些具有微效基因的品種通過其對(duì)主效基因的修飾，在持久抗性方面起著重要作用。例如，水稻品種IR64在連續(xù)種植多年以后仍能保持對(duì)褐飛虱的抗性，后經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)它除了攜帶一個(gè)主效的抗性基因Bph1之外，還包含幾個(gè)與抗性相關(guān)的微效數(shù)量性狀座位(Quantitativetraitloci，QTL)(Cohenetal.,1997)。迄今為止，利用不同的水稻材料，研究者們已檢測(cè)到的褐飛虱抗性QTL分布于水稻所有的染色體(吳昌軍等，2005；Sunetal.,2007；Liuetal.,2009)。在前期研究中，我們利用小粒野生稻與栽培稻IR24雜交、回交，結(jié)合胚拯救和分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，構(gòu)建了一套小粒野生稻導(dǎo)入系，通過抗褐飛虱鑒定，篩選獲得了高抗褐飛虱且農(nóng)藝性狀穩(wěn)定的水稻品系K41(郭嗣斌等，2012)。為了挖掘K41中的抗性基因及其緊密連鎖的分子標(biāo)記，本發(fā)明分別以感蟲品種桂1025為母本，以抗蟲品系K41為父本雜交，得到的F1再自交，從而構(gòu)建了F2分離群體，每個(gè)F2單株通過自交獲得相應(yīng)的F2:3家系，300個(gè)F2單株采用單粒傳法，通過連續(xù)自交獲得重組自交系群體(RILs，F(xiàn)7)。用親本間有多態(tài)性的SSR標(biāo)記分析F2單株的基因型，同時(shí)結(jié)合相應(yīng)的F3家系的的平均抗蟲級(jí)別進(jìn)行QTL定位。結(jié)果表明在第4號(hào)染色體長(zhǎng)臂RM3917和RM471間存在一個(gè)主效的QTL位點(diǎn)，LOD值為22.5，抗性貢獻(xiàn)率為34.3％，暫名為Bph31(t)。為了尋找與Bph31(t)連鎖更緊密的標(biāo)記，用RM3917和RM471篩選了5000個(gè)F3單株。進(jìn)一步利用這些多態(tài)性引物檢測(cè)篩選獲得了61個(gè)重組單株的基因型，結(jié)合其抗性鑒定結(jié)果，最后將Bph31(t)定位于MG81和RM471之間，并與標(biāo)記MG96緊密連鎖，參考日本晴基因組序列可知，MG81和MG96之間的物理距離約135kb。在將該抗性基因雜交轉(zhuǎn)育到其它材料后，利用分子標(biāo)記MG96檢測(cè)抗性基因存在的準(zhǔn)確率均達(dá)到97％以上，因此，利用兩者之間的分子標(biāo)記MG96來鑒定Bph31(t)的存在具有非常高的效率，這樣也大大提高了抗褐飛虱水稻品種的育種進(jìn)度。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：鑒于上述內(nèi)容，利用高抗褐飛虱的品種K41與髙感褐飛虱的品種桂1025雜交獲得的F2:3家系群體及重組自交系群體，通過抗性鑒定和遺傳分析，精細(xì)定位了水稻第4號(hào)染色體上的一個(gè)水稻抗褐飛虱基因Bph31(t)，獲得與之緊密連鎖的基于PCR擴(kuò)增的實(shí)用經(jīng)濟(jì)型分子標(biāo)記。該標(biāo)記可以預(yù)測(cè)水稻材料是否對(duì)褐飛虱具有抗性，提高抗褐飛虱水稻品種的選擇效率。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種水稻抗褐飛虱基因Bph31(t)的分子標(biāo)記，其由下述之一的引物對(duì)經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得：(1)標(biāo)記引物MG81正向引物序列：GGCAAACTCTTCTGATATGCTCTCC，反向引物序列：GCGCCAGAGATTGTGTGATCC；(2)標(biāo)記引物MG96正向引物序列：ACAATTCATCCTATGCTTCTAGGC，反向引物序列：TCTATGCACGACGCCACGGAAGGTCCTAGCCA；(3)標(biāo)記引物RM471正向引物序列：AGAAATGGATCGGACTGAACATGC，反向引物序列：AGACACTCGGACGCACAAGC；其中，所述標(biāo)記引物(1)-(3)的擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為140bp、184bp以及198bp。在本發(fā)明中，作為進(jìn)一步說明，其所述標(biāo)記引物(1)-(3)之一擴(kuò)增待檢水稻基因組DNA，如果用引物MG81能夠擴(kuò)增出140bp的擴(kuò)增片段，或者用引物MG96能夠擴(kuò)增出184bp的擴(kuò)增片段，或者用引物RM471能夠擴(kuò)增出198bp的擴(kuò)增片段，則標(biāo)志著該待檢水稻存在水稻抗褐飛虱基因Bph31(t)，該基因位于水稻基因組第4號(hào)染色體18,200,000-19,000,000bp的區(qū)間內(nèi)。在本發(fā)明中，作為進(jìn)一步說明，所述基因Bph31(t)來自水稻抗蟲品種K41或者水稻抗蟲品種K41的衍生材料或者攜帶抗褐飛虱基因Bph31(t)的材料。要說明的是本發(fā)明中涉及的水稻抗褐飛虱基因Bph31(t)的受體材料包括稻屬所有材料，如栽培稻和野生稻。如上所述水稻抗褐飛虱基因Bph31(t)的分子標(biāo)記在選育抗褐飛虱水稻或篩選抗性基因資源中的應(yīng)用。在本發(fā)明中，作為進(jìn)一步說明，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系：采用10μL的反應(yīng)體系，模板DNA10ng，正向、反向引物各0.8μmol，10×PCR緩沖液1μL，dNTPs0.2mmol，TaqDNA聚合酶0.25U，用ddH2O補(bǔ)齊至10μL；PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃50s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具有以下有益效果：1.本發(fā)明的抗褐飛虱新基因與目前報(bào)道的位于水稻第4號(hào)染色體上的褐飛虱抗性基因都不同。目前已被定位于水稻第4號(hào)染色體上的褐飛虱抗性基因有10個(gè)。其中，Bph12、Bph15、Bph17、Bph20位于水稻第4號(hào)染色體短臂上，在標(biāo)記RM8213與RM5953之間；bph12、bph16、BPH27(t)、Bph6位于水稻第4號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，在標(biāo)記RM3643與RM5742之間；qBPH29(t)和BPH27分別位于標(biāo)記RM401與RM3917之間和標(biāo)記RM471與RM3643之間。而Bph31(t)位于標(biāo)記RM3917與RM471之間，與以上10個(gè)抗性基因都不同，是源于小粒野生稻基因滲入系K41的一個(gè)抗褐飛虱的新基因位點(diǎn)。2.通過本發(fā)明得到的新基因標(biāo)記的篩選，能夠獲得對(duì)褐飛虱抗性水平顯著提高水稻新品種。3.本發(fā)明能利用Bph31(t)緊密連鎖的分子標(biāo)記來檢測(cè)抗蟲品種K41及其衍生品種(系)中是否含有該基因，篩出抗褐飛虱的新材料。本發(fā)明的分子標(biāo)記可用于水稻抗褐飛虱分子標(biāo)記輔助選擇育種和聚合育種，在苗期育種群體的基因型選擇，有效的鑒別抗褐飛虱的個(gè)體，便于及時(shí)雜交選育，加快育種進(jìn)程。【附圖說明】圖1為水稻品系K41攜帶的抗褐飛虱基因Bph31(t)在第4號(hào)染色體長(zhǎng)臂上與分子標(biāo)記MG96的緊密連鎖關(guān)系分布圖；附圖標(biāo)記：A-Bph31(t)的初步定位；垂直線表示第4號(hào)染色體；水平短線表示染色體上的分子標(biāo)記；括號(hào)內(nèi)的數(shù)值表示標(biāo)記間的遺傳距離(cM)；B-Bph31(t)的精細(xì)定位；Bph31(t)定位于MG81和RM471之間135kb的區(qū)間，分子標(biāo)記MG96與抗性基因緊密連鎖。n表示篩選的F3重組單株總數(shù)；圖2為分子標(biāo)記MG96在不同水稻材料中擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)帶型；附圖標(biāo)記：1為Marker；2為K41；3為桂1025；4-35為K41和桂1025雜交育種后代單株；圖3為K41和桂1025雜交后代單株苗期褐飛虱抗性表現(xiàn)鑒定的結(jié)果圖；附圖標(biāo)記：6為抗蟲對(duì)照RH；7為感蟲對(duì)照TN1；1-5和8-12為K41和桂1025雜交后代單株?！揪唧w實(shí)施方式】本說明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。本說明書(包括任何附加權(quán)利要求、摘要)中公開的任一特征，除非特別敘述，均可被其他等效或具有類似目的的替代特征加以替換。即，除非特別敘述，每個(gè)特征只是一系列等效或類似特征中的一個(gè)例子而已。以下實(shí)施例中使用的試劑、試劑盒和儀器均可由市售獲得，實(shí)施例中使用的方法如果沒有作特別說明的，與常規(guī)使用的方法一致。實(shí)施例1：分子標(biāo)記的獲得(一)桂1025/K41F2家系群體和RILs的構(gòu)建及表型鑒定1、在前期研究中，利用小粒野生稻與栽培稻IR24雜交、回交，結(jié)合胚拯救和分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，構(gòu)建了一套小粒野生稻導(dǎo)入系，通過抗褐飛虱鑒定，篩選獲得了高抗褐飛虱且農(nóng)藝性狀穩(wěn)定的水稻品系K41。為了挖掘K41中的抗性基因及其緊密連鎖的分子標(biāo)記，本發(fā)明分別以感蟲品種桂1025為母本，以抗蟲品系K41為父本雜交，得到的F1再自交，從而構(gòu)建了F2分離群體，每個(gè)F2單株通過自交獲得相應(yīng)的F2:3家系，300個(gè)F2單株采用單粒傳法，通過連續(xù)自交獲得重組自交系群體(RILs，F(xiàn)7)。2、采用苗期接蟲處理，對(duì)親本、F2:3家系和RILs進(jìn)行抗蟲鑒定。為確保親本、F2:3家系和RILs中每個(gè)材料生長(zhǎng)一致，所有供試材料在播種前分別浸種催芽。每個(gè)材料各50粒種子播于一個(gè)長(zhǎng)45cm，寬35cm，高8cm，且盛有5cm厚營(yíng)養(yǎng)土的鐵質(zhì)托盤中。每個(gè)盤的每個(gè)材料播2個(gè)重復(fù)，其中隨機(jī)播種親本和TN1(感蟲對(duì)照)各2個(gè)重復(fù)。播種7天后間苗，淘汰病弱苗。待苗長(zhǎng)到兩葉一芯期時(shí)，按8頭/苗的比例接種2-3齡褐飛虱若蟲，最后罩上尼龍紗網(wǎng)。當(dāng)感蟲對(duì)照TN1全部死亡時(shí)，參照Qiu等(2012)的方法對(duì)每個(gè)單株進(jìn)行0、1、3、5、7或9級(jí)的抗性評(píng)價(jià)(表1)，對(duì)每份材料通過加權(quán)平均計(jì)算該材料的抗性級(jí)別，上述抗蟲鑒定重復(fù)兩次，取平均值作為該材料的抗性級(jí)別，并推測(cè)其基因型。表1水稻苗期抗褐飛虱鑒定的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)抗性級(jí)別受害程度(當(dāng)90％以上TN1死亡時(shí)考察)抗性水平0植株生長(zhǎng)健康，無葉片受害抗(R)11片葉黃抗(R)31至2片葉黃，或1片葉枯萎中抗(MR)52至3片葉黃，或2片葉枯萎中抗(MR)73至4片葉葉枯萎，但植株未死亡感(S)9整株死亡感(S)(二)桂1025/K41F2群體的分子標(biāo)記分析1、利用CTAB法(MurrayandThompsom,1980)提取親本及F2群體各單株的葉片基因組DNA。2、根據(jù)Gramene網(wǎng)站(http://www.gramene.org/)公布的SSR標(biāo)記按照較均勻的遺傳距離選擇一定數(shù)目的分子標(biāo)記。另外，基于該基因最后的定位區(qū)段，參考水稻品種日本晴相應(yīng)的基因組序列，利用SSR搜索工具SSRIT(http://www.gramene.org/db/marker/ssrtool)來尋找SSR基序，并根據(jù)其側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，為備選標(biāo)記。其中，SSIT設(shè)置參數(shù)為：最小基序長(zhǎng)度為3聚體，最小重復(fù)數(shù)為5，搜素所有的SSR基序。選擇所有大于15堿基(基序長(zhǎng)度×重復(fù)數(shù))的SSR基序，最后基于該基因最后定位區(qū)段，比較該區(qū)段在水稻品系9311及日本晴相應(yīng)的基因組序列，在兩者具有差異的區(qū)段設(shè)計(jì)STS標(biāo)記用于精細(xì)定位。表2多態(tài)性標(biāo)記引物對(duì)、擴(kuò)增產(chǎn)物大小及在第4號(hào)染色體上的位置3、DNA提取、PCR擴(kuò)增及凝膠電泳：參考Temnykh等(2000年)的DNA提取方法，對(duì)每個(gè)單株分別提取基因組DNA。PCR擴(kuò)增體系采用10μL的反應(yīng)體系，模板DNA10ng，正向、反向引物各0.8μmol，10×PCR緩沖液1μL，dNTPs0.2mmol，TaqDNA聚合酶0.25U，用ddH2O補(bǔ)齊至10μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃50s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物在6％聚丙烯酰胺變性凝膠和銀染顯色法進(jìn)行檢測(cè)，或采取本領(lǐng)域已知的常規(guī)檢測(cè)技術(shù)。4、根據(jù)F2單株的抗蟲級(jí)別，分別選擇15個(gè)極端抗蟲單株和15個(gè)極端感蟲單株的葉片基因組DNA混合構(gòu)建抗、感池。利用在親本間有多態(tài)性的引物分別篩選抗感DNA池，獲得有多態(tài)性的分子標(biāo)記，該類多態(tài)性標(biāo)記很可能與抗性基因是連鎖的。然后，選擇連鎖標(biāo)記所在染色體上在親本間有多態(tài)性引物篩選F2分離群體的各個(gè)單株，獲得群體基因型數(shù)據(jù)。根據(jù)連鎖交換規(guī)律，通過軟件JoinMap3.0，利用群體基因型數(shù)據(jù)構(gòu)建水稻部分遺傳圖譜，并獲得各分子標(biāo)記的遺傳距離。最后，結(jié)合F2群體各個(gè)單株的基因型數(shù)據(jù)和相應(yīng)的褐飛虱抗性鑒定的抗蟲級(jí)別，利用軟件NetWorkQTL3.0對(duì)目標(biāo)染色體進(jìn)行QTL位點(diǎn)掃描。(三)利用分子標(biāo)記篩選桂1025/K41和Lemont/K41的F3重組單株精細(xì)定位Bph31(t)根據(jù)QTL的定位結(jié)果，利用初步定位兩側(cè)的SSR標(biāo)記RM3917和RM471篩選F3單株，獲得在兩標(biāo)記間發(fā)生重組的單株。同時(shí)在初步定位區(qū)段內(nèi)篩選更多在親本間具有多態(tài)性的引物，結(jié)合重組單株的基因型和表型，考察標(biāo)記與抗蟲表型共分離的情況。(四)結(jié)果與分析苗期集團(tuán)法接蟲鑒定結(jié)果表明K41和桂1025的平均抗蟲級(jí)別分別為2.5和9.0，這表明K41高抗褐飛虱而桂1025高感褐飛虱。190個(gè)F2：3家系對(duì)褐飛虱的平均抗蟲級(jí)別的頻率分布呈連續(xù)分布，最小值為1.5，最大值為9.0。部分重組單株的基因型及表現(xiàn)型(見表3)。用親本間有多態(tài)性的SSR標(biāo)記分析F2單株的基因型，同時(shí)結(jié)合相應(yīng)的F3家系的的平均抗蟲級(jí)別進(jìn)行QTL定位。結(jié)果表明在第4號(hào)染色體長(zhǎng)臂RM3917和RM471間存在一個(gè)主效的QTL位點(diǎn)，LOD值為22.5，抗性貢獻(xiàn)率為34.3％。分子標(biāo)記RM3917和RM471在測(cè)序的粳稻品種日本晴基因組序列中的物理距離約0.7Mb，為了尋找與Bph31(t)連鎖更精密的分子標(biāo)記，本發(fā)明用RM3917和RM471篩選了5000個(gè)F3單株。同時(shí)在初步定位區(qū)段內(nèi)篩選更多在親本間具有多態(tài)性的引物。進(jìn)一步利用這些多態(tài)性引物檢測(cè)篩選獲得了61個(gè)重組單株的基因型，結(jié)合其抗性鑒定結(jié)果，最后將Bph31(t)定位于MG81和RM471之間，并與標(biāo)記MG96緊密連鎖(圖1，表3)，參考日本晴基因組序列可知，MG81和RM471之間的物理距離約135kb。在將該抗性基因雜交轉(zhuǎn)育到其它材料后，利用分子標(biāo)記MG96檢測(cè)抗性基因存在的準(zhǔn)確率均達(dá)到97％以上(圖2)，因此，利用兩者之間的分子標(biāo)記MG96來鑒定Bph31(t)的存在具有非常高的效率，這樣也大大提高了抗褐飛虱水稻品種的育種進(jìn)度。表3部分重組單株的基因型及表現(xiàn)型備注：A,K41純合基因型；B,桂1025純合基因型；H,雜合基因型；R,抗；MR,中抗；S感；通過分析重組單株基因型和抗蟲級(jí)別，最終將Bph31(t)基因定位于MG81和RM471之間。實(shí)施例2：分子標(biāo)記的驗(yàn)證(一)材料與方法陰性品種：30份，感蟲品系桂1025、Lemont、TN1均為本實(shí)驗(yàn)室保存的常規(guī)水稻材料，桂1025/K41雜交組合后代中感蟲家系27份。陽性品種：30份，抗蟲品系K41、桂1025/K41雜交組合后代中抗蟲家系29份。分子標(biāo)記引物：MG81、MG96和RM471。DNA提取方法和分子標(biāo)記的分析方法同實(shí)施例1。(二)結(jié)果用上述方法，分別對(duì)水稻品系K41、桂1025、Lemont、TN1等60份不同樣本的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，在陽性樣本中均能擴(kuò)增出相應(yīng)的140bp片段、184bp片段以及198bp片段，而在陰性樣本中均不能擴(kuò)增出這些片段。由此說明，本發(fā)明提供的分子標(biāo)記方法能夠準(zhǔn)確篩選出含有抗褐飛虱主效基因的樣本，從而顯著提高抗褐飛虱水稻材料的選擇效率。前述對(duì)本發(fā)明的具體示例性實(shí)施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進(jìn)行很多改變和變化。對(duì)示例性實(shí)施進(jìn)行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實(shí)際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實(shí)施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在有權(quán)利要求書及其等同形式所限定。<序列表><110>廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所<120>水稻抗褐飛虱基因Bph31(t)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用<160>6<170>Primer5.0<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<223>MG81（5ˊ端引物序列）<400>1GGCAAACTCTTCTGATATGCTCTCC25<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>MG81（3ˊ端引物序列）<400>2GCGCCAGAGATTGTGTGATCC21<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>MG96（5ˊ端引物序列）<400>3ACAATTCATCCTATGCTTCTAGGC24<210>4<211>32<212>DNA<213>人工序列<223>MG96（3ˊ端引物序列）<400>4TCTATGCACGACGCCACGGAAGGTCCTAGCCA32<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>RM471（5ˊ端引物序列）<400>5AGAAATGGATCGGACTGAACATGC24<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>RM471（3ˊ端引物序列）<400>6AGACACTCGGACGCACAAGC20當(dāng)前第1頁1 2 3