本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種用于大腸癌紡錘體組裝檢驗點靶點基因檢測的試劑體系和試劑盒以及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：大腸癌是在直腸和乙狀結(jié)腸交界處發(fā)生的消化道惡性腫瘤，是世界范圍內(nèi)最為普遍的惡性腫瘤之一，尤其是大部分只能在晚期才得到確診。一直以來大腸癌是一個巨大的公共健康問題，每年在世界范圍內(nèi)有超過130萬人的新確診案例，以40-50歲年齡組發(fā)病最高。同時，大腸癌也是既乳腺癌之后第二大女性常見癌癥和第三男性高風(fēng)險癌癥，每年約有70萬人因大腸癌不幸離世。大腸癌的主要早期表現(xiàn)為消化不良、腹脹、便前腹痛、便血等癥狀，由于腫瘤潰爛感染還會導(dǎo)致貧血、乏力、消瘦等中毒癥狀，如不及時治療會出現(xiàn)黃疸、腹腔積液、水腫等惡性癥狀。但目前針對晚期大腸癌的治療依舊停留在手術(shù)切除和術(shù)后輔助化療階段，其副作用和抗性成為最大的缺點。在大部分晚期大腸癌患者中，約有90％是與體細(xì)胞染色體異常有關(guān)。因此尋找新的腫瘤靶點和對應(yīng)的治療方案迫在眉睫。最近，紡錘體組裝檢驗點(SAC)的一項監(jiān)控機(jī)制備受矚目，其中對所有染色體進(jìn)行分裂末期抑制直至退回至分裂中期這一功能可令SAC成為抗擊腫瘤的新靶點。正常人的糞便每天大約可排泄近1010個大腸上皮細(xì)胞，對脫落到糞便里的黏膜細(xì)胞進(jìn)行檢測是大腸癌的一種理想篩查手段。大腸癌患者中普遍存在SAC基因表達(dá)異常。在有絲分裂中，一旦染色體沒有和紡錘微管有效結(jié)合，SAC就會終止有絲分裂末期，進(jìn)而防止發(fā)生更大的錯誤。大腸癌患者中都不同程度的出現(xiàn)SAC活性降低，這極容易導(dǎo)致染色體錯配和染色體異常，進(jìn)而引發(fā)體細(xì)胞癌變。因此染色體不穩(wěn)定是大腸癌發(fā)生的重要誘因之一，而導(dǎo)致SAC活性異常的根本是調(diào)控其活性的基因發(fā)生表達(dá)異常。調(diào)控SAC活性的核心異常表達(dá)基因包括：BubR1：位于17號染色體，在調(diào)控SAC的基因中其過度表達(dá)已經(jīng)得到證實，其在大腸癌細(xì)胞中會中斷SAC的維持染色體穩(wěn)定的功能，因此BubR1是由潰瘍性腸炎至癌變的重要的靶點之一。Mad1：位于7號染色體，其過表達(dá)會通過引發(fā)非整倍體和染色體不穩(wěn)定導(dǎo)致SAC功能性削弱，并與Ⅱ期和Ⅲ期大腸癌緊密相關(guān)。Mad2：位于10號染色體，是SAC活性的關(guān)鍵基因，Mad2還與BubR1共表達(dá)，并與腫瘤抑制因子APC的生殖系突變有關(guān)。Mad2的過表達(dá)參與腸道細(xì)胞癌變并且預(yù)后差。AURKB：位于17號染色體，靶點是調(diào)控有絲分裂在細(xì)胞質(zhì)中正常進(jìn)行的蘇氨酸激酶。AURKB的過度表達(dá)會增加大腸癌中染色體不穩(wěn)定的情況出現(xiàn)，因此AURKB可以作為診斷大腸癌和晚期大腸癌的分子靶點。PlK1：位于16號染色體，是一個調(diào)控有絲分裂進(jìn)程的絲氨酸激酶，在中心體成熟、紡錘體組裝和動力微管結(jié)合上有重要作用。PLK1的表達(dá)可以提高SAC組分和著絲粒的結(jié)合，強(qiáng)化紡錘體組裝檢驗點的活性。同樣在大腸癌樣本中，PlK1也出現(xiàn)過表達(dá)。PlK1的過表達(dá)會誘導(dǎo)腫瘤惡化并對腫瘤病人的預(yù)后有不利影響。尤其在已經(jīng)手術(shù)切除病灶的大腸癌患者中，PlK1的過度表達(dá)常常會在放療后依舊致使大腸癌高風(fēng)險復(fù)發(fā)。Cdc20：位于1號染色體，是SAC的關(guān)鍵靶點，在大腸癌樣本中發(fā)現(xiàn)其有過度表達(dá)現(xiàn)象。其過表達(dá)與不理想預(yù)后和晚期臨床階段有關(guān)。此外，TP53是人類大腸癌中最易突變的基因，而BubR1、Mad2、AURKB、PlK1和Cdc20都與TP53的表達(dá)有關(guān)。因此，SAC相關(guān)組分的表達(dá)異常是大腸癌最新的重要診斷分子靶點。但目前針對大腸癌的基因檢測僅限于尋找發(fā)生突變的易感基因和腸道菌群的DNA檢測，本專利針對調(diào)控癌細(xì)胞有絲分裂的紡錘體組裝檢驗點相關(guān)的6個靶點的過表達(dá)檢測將為大腸癌早期診斷和病程發(fā)展提供全新的方向和重要參考，填補(bǔ)了SAC相關(guān)基因的大腸癌檢測空白，也為大腸癌SAC靶點的抑制療法提供了理論基礎(chǔ)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明解決的技術(shù)問題是：現(xiàn)有的大腸癌基因檢測僅限于尋找發(fā)生突變的易感基因和腸道菌群的DNA檢測，普遍存在靈敏度低、準(zhǔn)確率不高，還費(fèi)時費(fèi)力的缺點，其應(yīng)用受到一定限制。為了解決上述的問題，本發(fā)明提供了一種用于大腸癌紡錘體組裝檢驗點靶點基因檢測的試劑體系和試劑盒以及其應(yīng)用。具體來說，針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：一方面，本發(fā)明提供了一種大腸癌紡錘體組裝檢驗點用試劑體系，所述試劑體系包括用于BubR1基因檢測的試劑，用于Mad1基因檢測的試劑，用于Mad2基因檢測的試劑，用于AURKB基因檢測的試劑，用于PlK1基因檢測的試劑和用于Cdc20基因檢測的試劑。優(yōu)選地，所述用于BubR1基因檢測的試劑包括用于BubR1檢測的DNA探針，其序列如SEQIDNO.7所示；所述用于Mad1基因檢測的試劑包括用于Mad1檢測的DNA探針，其序列如SEQIDNO.8所示；所述用于Mad2基因檢測的試劑包括用于Mad2檢測的DNA探針，其序列如SEQIDNO.9所示；所述用于AURKB基因檢測的試劑包括用于AURKB檢測的DNA探針，其序列如SEQIDNO.10所示；所述用于PlK1基因檢測的試劑包括用于PlK1檢測的DNA探針，其序列如SEQIDNO.11所示；所述用于Cdc20基因檢測的試劑包括用于Cdc20檢測的DNA探針，其序列如SEQIDNO.12所示。優(yōu)選地，所述用于BubR1基因檢測的試劑包括擴(kuò)增引物序列SEQIDNO.1a和SEQIDNO.1b；所述用于Mad1基因檢測的試劑包括擴(kuò)增引物序列SEQIDNO.2a和SEQIDNO.2b；所述用于Mad2基因檢測的試劑包括擴(kuò)增引物序列SEQIDNO.3a和SEQIDNO.3b；所述用于AURKB基因檢測的試劑包括擴(kuò)增引物序列SEQIDNO.4a和SEQIDNO.4b；所述用于PlK1基因檢測的試劑包括擴(kuò)增引物序列SEQIDNO.5a和SEQIDNO.5b；所述用于Cdc20基因檢測的試劑包括擴(kuò)增引物序列SEQIDNO.6a和SEQIDNO.6b。另一方面，本發(fā)明提供了一種用于大腸癌紡錘體組裝檢驗點靶點基因檢測的試劑盒，所述試劑盒包括用于BubR1基因檢測的試劑，用于Mad1基因檢測的試劑，用于Mad2基因檢測的試劑，用于AURKB基因檢測的試劑，用于PlK1基因檢測的試劑和用于Cdc20基因檢測的試劑。優(yōu)選地，所述用于BubR1基因檢測的試劑包括用于BubR1檢測的DNA探針，其序列如SEQIDNO.7所示；所述用于Mad1基因檢測的試劑包括用于Mad1檢測的DNA探針，其序列如SEQIDNO.8所示；所述用于Mad2基因檢測的試劑包括用于Mad2檢測的DNA探針，其序列如SEQIDNO.9所示；所述用于AURKB基因檢測的試劑包括用于AURKB檢測的DNA探針，其序列如SEQIDNO.10所示；所述用于PlK1基因檢測的試劑包括用于PlK1檢測的DNA探針，其序列如SEQIDNO.11所示；所述用于Cdc20基因檢測的試劑包括用于Cdc20檢測的DNA探針，其序列如SEQIDNO.12所示。優(yōu)選地，用于BubR1基因的擴(kuò)增引物序列為SEQIDNO.1a和SEQIDNO.1b；用于Mad1基因的擴(kuò)增引物序列為SEQIDNO.2a和SEQIDNO.2b；用于Mad2基因的擴(kuò)增引物序列為SEQIDNO.3a和SEQIDNO.3b；用于AURKB基因的擴(kuò)增引物序列為SEQIDNO.4a和SEQIDNO.4b；用于PlK1基因的擴(kuò)增引物序列為SEQIDNO.5a和SEQIDNO.5b；用于Cdc20基因的擴(kuò)增引物序列為SEQIDNO.6a和SEQIDNO.6b。優(yōu)選地，所述試劑盒中的試劑包括樣品DNA提取組件、PCR擴(kuò)增組件、PCR產(chǎn)物純化組件和DNA測序反應(yīng)組件。優(yōu)選地，所述PCR產(chǎn)物純化組件包括ddH2O、SAP酶和ExoI酶。優(yōu)選地，所述試劑盒中DNA測序反應(yīng)組件包括ddH2O、EDTA溶液、乙醇溶液、去離子甲酰胺溶液和BigDyemix試劑。優(yōu)選地，所述試劑盒中的樣品DNA提取組件包括糞便裂解液、硅膠膜結(jié)合液、硅膠膜洗滌液和蛋白沉淀液。優(yōu)選地，所述糞便裂解液包括：30-100mmol/LTris-Cl、3-10mmol/LEDTA、0.6-5mmol/LNaCl和0.1-1.0％(W/V)十二烷基硫酸鈉。優(yōu)選地，所述硅膠膜結(jié)合液包括3-10mol/L鹽酸胍。優(yōu)選地，所述硅膠膜洗滌液包括：1-5mmol/LTris-Cl、0.5-2mmol/LEDTA、1-5mmol/LNaCl和體積含量為30-50％的乙醇。優(yōu)選地，所述蛋白沉淀液包括：0.5-2mol/L乙酸鉀和體積含量為5-20％冰乙酸。在又一方面，本發(fā)明提供了用于BubR1基因檢測的試劑，用于Mad1基因檢測的試劑，用于Mad2基因檢測的試劑，用于AURKB基因檢測的試劑，用于PlK1基因檢測的試劑和用于Cdc20基因檢測的試劑在制備檢測大腸癌紡錘體組裝檢驗點的試劑體系和試劑盒中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述試劑包括PCR擴(kuò)增用試劑、限制性內(nèi)切酶酶切用試劑、PCR產(chǎn)物純化用試劑。優(yōu)選地，所述試劑的作用對象為糞便。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的效果和益處在于：本發(fā)明填補(bǔ)了紡錘體組裝檢驗點相關(guān)基因的大腸癌檢測空白，可同時檢測6種相關(guān)基因，檢測結(jié)果全面可靠，而且快速、高效、準(zhǔn)確、便捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)，誤診率低。本發(fā)明提供的檢測方法為大腸癌的早期診斷和病程發(fā)展提供全新的方向和重要參考。附圖說明圖1為本發(fā)明試劑盒的上層部分，用于獲取糞便樣本的DNA保存液，其中，1為糞便裂解液，2為硅膠膜結(jié)合液，3為硅膠膜洗滌液，4為蛋白沉淀液。圖2為本發(fā)明試劑盒的下層部分，包含各基因檢測用試劑，5為BubR1檢測用試劑，6為Mad1檢測用試劑，7為Mad2檢測用試劑，8為PlK1檢測用試劑，9為AURKB檢測用試劑，10為Cdc20檢測用試劑。每組5個PE管中分別含有相應(yīng)基因?qū)?yīng)的DNA擴(kuò)增引物、PCR反應(yīng)組件、TaqDNA聚合酶、PCR產(chǎn)物純化組件和DNA探針測序反應(yīng)組件。圖3為試劑盒的外包裝盒。具體實施方式如上所述，本發(fā)明的目的在于：提供一種大腸癌紡錘體組裝檢驗點檢測用的試劑體系、試劑盒和應(yīng)用。本發(fā)明的基本原理是通過糞便裂解液、硅膠膜結(jié)合液、硅膠膜洗滌液、蛋白沉淀液等試劑的處理這一低成本、低風(fēng)險和高采集率的細(xì)胞樣本方法，獲得在糞便中數(shù)量充足的脫落大腸上皮黏膜細(xì)胞，之后利用靶多核苷酸的特異性引物和靶多核苷酸的特異性探針，在耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、高質(zhì)量脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及PCR反應(yīng)緩沖液中，一次性對有絲分裂過程末期紡錘體組裝檢驗點相關(guān)六個基因的表達(dá)狀態(tài)進(jìn)行檢測，確定其是否過表達(dá)，達(dá)到在早期及時對大腸癌的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)行精準(zhǔn)診斷的目的。本發(fā)明提供了一種大腸癌紡錘體組裝檢驗點檢測用的試劑體系和試劑盒，所述試劑包括用于BubR1基因檢測的試劑，用于Mad1基因檢測的試劑，用于Mad2基因檢測的試劑，用于AURKB基因檢測的試劑，用于PlK1基因檢測的試劑和用于Cdc20基因檢測的試劑。所述試劑盒中的試劑分裝到管中，供單人次檢測用，保存溫度為-20℃。在優(yōu)選實施方式中，用于BubR1基因檢測的試劑包括擴(kuò)增引物序列SEQIDNO.1a和SEQIDNO.1b，以及用于BubR1檢測的DNA探針SEQIDNO.7；用于Mad1基因檢測的試劑包括擴(kuò)增引物序列SEQIDNO.2a和SEQIDNO.2b，以及用于Mad1檢測的DNA探針SEQIDNO.8；用于Mad2基因檢測的試劑包括擴(kuò)增引物序列SEQIDNO.3a和SEQIDNO.3b，以及用于Mad2檢測的DNA探針SEQIDNO.9；用于AURKB基因檢測的試劑包括擴(kuò)增引物序列SEQIDNO.4a和SEQIDNO.4，以及用于AURKB檢測的DNA探針SEQIDNO.10；用于PlK1基因檢測的試劑包括擴(kuò)增引物序列SEQIDNO.5a和SEQIDNO.5b，以及用于PlK1檢測的DNA探針SEQIDNO.11；用于Cdc20基因檢測的試劑包括擴(kuò)增引物序列SEQIDNO.6a和SEQIDNO.6b，以及用于Cdc20檢測的DNA探針SEQIDNO.12。本發(fā)明利用糞便裂解液、硅膠膜結(jié)合液、硅膠膜洗滌液以及蛋白沉淀液處理糞便樣本，獲取糞便樣本DNA保存液。然后，利用引物擴(kuò)增BubR1、Mad1、Mad2、AURKB、PlK1和Cdc20六個基因片段，通過試劑盒中的PCR產(chǎn)物純化組件進(jìn)行反應(yīng)、純化；在檢測用的DNA探針的作用下，擴(kuò)增PCR純化產(chǎn)物，擴(kuò)增結(jié)束后，處理PCR產(chǎn)物并放入DNA測序儀中進(jìn)行測序。以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。其中，實施例中所用的試劑和儀器信息如下：PCR儀，廠家：ABI，型號：ABI-2720PCR，美國；DNA測序儀，廠家：Illumina，型號：HiSeqXTen；dNTPs，廠家：TAKARA，型號：dNTPMixture4030，日本；TaqDNA聚合酶，廠家：TAKARA，型號：ExTaqDRR001A，日本；ExoI酶，廠家：TAKARA，日本；SAP酶，廠家：賽默飛世爾科技有限公司，型號：EF0511；EDTA，廠家：麗水博瑞特化工有限公司，型號：60-00-4；去離子甲酰胺，廠家：上海酶聯(lián)生物科技有限公司，型號：75-12-7RT；Tris-CL緩沖液，牛血清蛋白，廠家：南京奧多福尼生物科技有限公司，型號：9048-46-8，25g。蛋白酶K，廠家：上海翊圣生物科技有限公司型號：10401ES60,100mg；鹽酸胍，廠家：煙臺三鼎化工有限公司，型號：50-01-1；如圖1所示，試劑盒上層部分設(shè)有用于獲取糞便樣本的DNA保存液，其中，所用試劑的各組分比例不同，但均能獲取糞便樣本DNA。以下通過具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明試劑體系和試劑盒的制備和應(yīng)用。實施例一獲取糞便樣本DNA保存液的步驟包括：1.采集暴露小于24小時受試者的糞便樣本，用無菌刀片挑取170-180mg的樣本于冰上。2.在樣本中加入3.0ml的糞便裂解液，充分裂解后離心分離，取上清液加入250mg牛血清蛋白，離心得到上清液，在上清液中加入30μl的蛋白酶K置于60℃條件下消化反應(yīng)2h，得到消化液。糞便裂解液的組成為：30mmol/LTris-Cl、3mmol/LEDTA、0.6mmol/LNaCl和0.1％(W/V)十二烷基硫酸鈉。3.將上述所得到的消化液冷卻至室溫，加入300μl蛋白沉淀液，沉淀蛋白，充分混勻后經(jīng)離心分離去除蛋白雜質(zhì)，得到上清液即DNA抽提液。蛋白沉淀液由0.5mol/L乙酸鉀和體積含量為5％的冰乙酸配制而成。4.向已經(jīng)去除蛋白雜質(zhì)的DNA抽提液中加入硅膠膜結(jié)合液(3mmol/L鹽酸胍)，充分結(jié)合DNA，DNA抽提液與硅膠膜結(jié)合液的體積比為1:2.5，然后經(jīng)硅膠膜吸附，離心分離，得到沉淀物，在沉淀物中加入800-1000μl硅膠膜洗滌液洗滌，重復(fù)洗滌兩次，然后離心分離脫去硅膠膜中殘存的硅膠膜洗滌液后，加入80μlTE緩沖液溶解洗脫DNA，離心分離得到離心后的上清液，該上清液為含長度大于20kb的樣本DNA保存液。硅膠膜洗滌液的組成為：1mmol/LTris-Cl、0.5mmol/LEDTA、1mmol/LNaCl和體積含量為30％的乙醇。實施例二獲取糞便樣本DNA保存液的步驟包括：1.采集暴露小于24小時的糞便樣本，用無菌刀片挑取200-220mg的樣本于冰上。2.在樣本中加入0.5ml的糞便裂解液，充分裂解后離心分離，取上清液加入250mg牛血清蛋白，離心得到上清液，在上清液中加入30μl的蛋白酶K置于60℃條件下消化反應(yīng)2h，得到消化液。糞便裂解液的組成為：100mmol/LTris-Cl、10mmol/LEDTA、5mmol/LNaCl和1.0％(W/V)十二烷基硫酸鈉。3.將上述所得到的消化液冷卻至室溫，加入300μl蛋白沉淀液，沉淀蛋白，充分混勻后經(jīng)離心分離去除蛋白雜質(zhì)，得到上清液即DNA抽提液。蛋白沉淀液由2mol/L乙酸鉀和體積含量為20％的冰乙酸配制而成。4.向已經(jīng)去除蛋白雜質(zhì)的DNA抽提液中加入硅膠膜結(jié)合液(10mmol/L的鹽酸胍)，充分結(jié)合DNA，DNA抽提液與硅膠膜結(jié)合液的體積比為1:3.0，然后經(jīng)硅膠膜吸附，離心分離，得到沉淀物，在沉淀物中加入800μl硅膠膜洗滌液洗滌，重復(fù)洗滌兩次，然后離心分離脫去硅膠膜中殘存的硅膠膜洗滌液后，加入100μlTE緩沖液溶解洗脫DNA，離心分離得到離心后的上清液，該上清液為含長度大于20kb的樣本DNA保存液。硅膠膜洗滌液的組成為：5mmol/LTris-Cl、2mmol/LEDTA、5mmol/LNaCl和體積含量為50％的乙醇。實施例三制備得到的試劑盒如附圖1-3所示，除外包裝盒外，主要包括上層和下層兩個部分。上層部分用于獲取糞便樣本的DNA保存液，其中，1裝有糞便裂解液，2裝有硅膠膜結(jié)合液，3裝有硅膠膜洗滌液，4裝有蛋白沉淀液。下層部分包含各基因檢測用試劑，其中，5為BubR1檢測用試劑，6為Mad1檢測用試劑，7為Mad2檢測用試劑，8為PlK1檢測用試劑，9為AURKB檢測用試劑，10為Cdc20檢測用試劑。每組5個PE管中分別含有六種基因?qū)?yīng)DNA擴(kuò)增引物、PCR反應(yīng)組件、TaqDNA聚合酶、PCR產(chǎn)物純化組件和DNA探針測序反應(yīng)組件。利用試劑盒檢測出樣品各基因的DNA序列后，在NCBI庫中查找各基因正常表達(dá)的DNA序列，通過序列比對，確定樣品中基因表達(dá)是否正常，從而判斷樣品提供者是否患有大腸癌。實施例四以下通過具體實施例說明大腸癌紡錘體組裝檢驗點(SAC)6種靶點基因檢測用的試劑及試劑盒的制備方法。其主要包括如下：(1)獲取糞便樣本DNA保存液1.采集暴露小于24小時的大腸癌患者糞便樣本，用無菌刀片挑取180-200mg的樣本于冰上。2.在樣本中加入1.5ml的糞便裂解液，充分裂解后離心分離，取上清液加入250mg牛血清蛋白，離心得到上清液，在上清液中加入30μl的蛋白酶K置于60℃條件下消化反應(yīng)2h，得到消化液。糞便裂解液的組成為：50mmol/LTris-Cl、5mmol/LEDTA、1mmol/LNaCl和0.1％(W/V)十二烷基硫酸鈉。3.將上述所得到的消化液冷卻至室溫，加入300μl蛋白沉淀液，沉淀蛋白，充分混勻后經(jīng)離心分離去除蛋白雜質(zhì)，得到上清液即DNA抽提液。蛋白沉淀液由2mol/L乙酸鉀和體積含量為11.5％的冰乙酸配制而成。4.向已經(jīng)去除蛋白雜質(zhì)的DNA抽提液中加入硅膠膜結(jié)合液(3mol/L鹽酸胍)，充分結(jié)合DNA，DNA抽提液與硅膠膜結(jié)合液的體積比為1:1.5，然后經(jīng)硅膠膜吸附，離心分離，得到沉淀物，在沉淀物中加入800μl硅膠膜洗滌液洗滌，重復(fù)洗滌兩次，然后離心分離脫去硅膠膜中殘存的硅膠膜洗滌液后，加入100μlTE緩沖液溶解洗脫DNA，離心分離得到離心后的上清液，該上清液為含長度大于20kb的樣本DNA保存液。硅膠膜洗滌液的組成為2mmol/LTris-Cl、1mmol/LEDTA、5mmol/LNaCl和體積含量為50％的乙醇。(2)靶點基因擴(kuò)增利用表1中的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增BubR1、Mad1、Mad2、AURKB、PlK1和Cdc20六個基因。表1PCR反應(yīng)體系組成體積(μl)基因組DNA1(30μg/ml)10×TaqBuffer2.5dNTP0.3(30mM,each)TaqDNA聚合酶0.25(6U/μl)上游引物0.25(25μM)下游引物0.25(25μM)ddH2O15.45μl總體積20μlPCR反應(yīng)參數(shù)為：其中，用于BubR1、Mad1、Mad2、AURKB、PlK1和Cdc20基因擴(kuò)增的引物序列如下：BubR1上游引物，SEQIDNO.1a:TGGCTGTAGTGTTGAATA下游引物，SEQIDNO.1b:CCTACTGGTTCTACCTTCMad1上游引物，SEQIDNO.2a:TCAGGTTGTTAAGTCCAG下游引物，SEQIDNO.2b:CTCGTTTCCATATTCTCTTCMad2上游引物，SEQIDNO.3a:AGGGATAATGAATTTTCTGTAA下游引物，SEQIDNO.3b:CGAGTAAAGGTTTCAGATGAURKB上游引物，SEQIDNO.4a:GGGTTTAGGGATGAGAAG下游引物，SEQIDNO.4b:GCACTTACGTTAAGATGTCPlK1上游引物，SEQIDNO.5a:CTCAGGTGTGGAGTAGGA下游引物，SEQIDNO.5b:CATGGTAAGGTCAGTCTTTCCdc20上游引物，SEQIDNO.6a:AGGGAGGTGTTGATTTTC下游引物，SEQIDNO.6b:GCTGTAGAGTACTTTCAGTC利用以上引物擴(kuò)增的BubR1基因序列在NCBI中的序列號為NG_016338.1；利用以上引物擴(kuò)增的Mad1基因序列在NCBI中的序列號為NG_011518.1；利用以上引物擴(kuò)增的Mad2基因序列在NCBI中的序列號為NC_000004.12；利用以上引物擴(kuò)增的AURKB基因序列在NCBI中的序列號為NC_000017.11；利用以上引物擴(kuò)增的PlK1基因序列在NCBI中的序列號為NC_000016.10；利用以上引物擴(kuò)增的Cdc20基因序列在NCBI中的序列號為NC_000001.11。(3)PCR產(chǎn)物純化使用檢測試劑盒中的PCR產(chǎn)物純化組件對(2)中擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，反應(yīng)體系如表2：表2PCR產(chǎn)物純化體系組分體積(μl)PCR產(chǎn)物20SAP酶0.75(1U/μl)ExoI酶0.375(10U/μl)ddH2O3.875Totalvolume25在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為37℃、15min，72℃、20min。(4)檢測反應(yīng)設(shè)計特異性DNA探針，檢測(3)純化得到的PCR產(chǎn)物，并放入測序儀進(jìn)行測序。反應(yīng)體系見表3。表3檢測反應(yīng)體系組分體積(μl)PCR純化產(chǎn)物1(200ng/μl)DNA測序探針1(3pmol/μl)ddH2O2Totalvolume5利用檢測反應(yīng)體系在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為：反應(yīng)結(jié)束后，加入1μl濃度為125mM的EDTA溶液和濃度為100％的乙醇溶液15μl，于室溫下沉淀15min；在4℃、3600rpm/min的轉(zhuǎn)速離心30min，輕輕倒去上清液；加入70％乙醇溶液30μl，3600rpm/min離心15min，輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入去離子甲酰胺溶液8μl，放入測序儀中。設(shè)計的DNA探針序列如下：用于BubR1檢測的DNA探針序列SEQIDNO.7：TCAACCACTTATCATCATCTCCACTGT用于Mad1檢測的DNA探針序列SEQIDNO.8：TCTCCTCCTCCCGTCTCTGC用于Mad2檢測的DNA探針序列SEQIDNO.9：TCGTAAGCCGTAGTTGACGTAA用于AURKB檢測的DNA探針序列SEQIDNO.10：CCACTGCTATTCTCCATCACCTTCT用于PlK1檢測的DNA探針序列SEQIDNO.11：CTGTCCTTCAATCCGTGGTTCCAATGC用于Cdc20檢測的DNA探針序列SEQIDNO.12：ACTCCGTTGCCACAGGTTATCAGAADNA測序儀測得的序列結(jié)果如下：測得的BubR1基因序列如SEQIDNO.13所示：TGGCTGTAGTGTTGAATACACTAAAGGCAGCAAAGGATGGAAGCAAGGGACACCAGTTAAGAGATTATTGAAATAATTCAGCTCAAAAGTGAGTTGAGCCAGGTGGAAAACAGTGGAGATGATGATAAGTGGTTGATTTCTGTATATATTTTGAAGGGAGAACCAGTAGG測得的Mad1基因序列如SEQIDNO.14所示：CTCGTTTCCATATTCTCTTCCTCTCCTCCTCCCGTCTTTGCCCAGCCCCTGGCTTCCCTCTAAAAAGATGCTGTTCCTAAGGGTCTGCAATGAATTTTCCTTCTTTCAGAGAAAGACTTCCAAGTTGTGTGCCCCGGGAATGAAATGGAATAAGAGAACGAGGTGGAGTAGGGCAAGAGTCCCTGGACTTAACAACCTGA測得的Mad2基因序列如SEQIDNO.15所示：CGAGTAAAGGTTTCAGATGGATATATGCCACGCTGATATAAAATGCTGTTGATGACGAATGCTGCAAGCAAAAGAAATGTTACAGAAAATTCATTATCCCT測得的AURKB基因序列如SEQIDNO.16所示：GCACTTACGTTAAGATGTCGGGTGTCCCACTGCTATTCTCCATCACCTTCTGGCCAAGGGCAGCTAAGGAGAGAACAGGTAGGTTGAATGCGAACAGGGATGACCTTCTCATCCCTAAACCC測得的PlK1基因序列如SEQIDNO.17所示：CTCAGGTGTGGAGTAGGACAGGCCTCTGTCCTTCAATCCGTGGTTCCAATGCCCATCTGCTTCTCGGCCCTTCCAGGAAAGACTGACCTTACCATG測得的Cdc20基因序列如SEQIDNO.18所示：AGGGAGGTGTTGATTTTCCCAGCGTCTAGACTCACTCCGTTACCACAGGTTATCAGAACAGACTGAAAGTACTCTACAGC(5)序列比對BubR1基因正常表達(dá)的堿基序列如SEQIDNO.19所示：TGGCTGTAGTGTTGAATACACTAAAGGCAGCAAAGGATGGAAGCAAGGGACACCAGTTAAGAGGTTATTGAAATAATTCAGCTCAAAAGTGAGTTGAGCCAGGTGGAAAACAGTGGAGATGATGATAAGTGGTTGATTTCTGTATATATTTTGAAGGTAGAACCAGTAGGMad1基因正常表達(dá)的堿基序列如SEQIDNO.20所示：CTCGTTTCCATATTCTCTTCCTCTCCTCCTCCCGTCTCTGCCCAGCCCCTGGCTTCCCTCTAAGAAGATGCTGTTCCTAAGGGTCTGCAATGAATTTTCCTTCTTTCAGAGAAAGACTTCCAAGTTGTGTGCCCCGGGAATGAAATGGAATAAGAGAACGAGGTGGAGTAGGGCAAGAGTCCCTGGACTTAACAACCTGAMad2基因正常表達(dá)的堿基序列如SEQIDNO.21所示：CGAGTAAAGGTTTCAGATGGATATATGCCACGCTGATATAAAATGCTGTTGATGCCGAATGCTGCAAGCAAAAGAAATGTTACAGAAAATTCATTATCCCTAURKB基因正常表達(dá)的堿基序列如SEQIDNO.22所示：GCACTTACGTTAAGATGTCGGGTGTCCCACTGCTATTCTCCATCACCTTCTGGCCAGGGGCAGCTAAGGAGAGAACAGGTAGGTTGAATGCGAACAGGGATGACCTTCTCATCCCTAAACCCPlK1基因正常表達(dá)的堿基序列如SEQIDNO.23所示：CTCAGGTGTGGAGTAGGACAGGCCTCTGTCCTTCAATCCGTGGTTCCAATGCCCATCTGCTTCTCGGCCCTGCCAGGAAAGACTGACCTTACCATGCdc20基因正常表達(dá)的堿基序列如SEQIDNO.24所示：AGGGAGGTGTTGATTTTCCCAGCGTCTAGACTCACTCCGTTGCCACAGGTTATCAGAACAGACTGAAAGTACTCTACAGC將測序儀測得的樣本基因序列和正常表達(dá)的基因序列比對，結(jié)果可以看到，樣本BubR1基因序列與正常表達(dá)的BubR1基因序列的區(qū)別在于樣本基因第64位堿基由G突變成A，第158位堿基由T突變成G；樣本Mad1基因序列與正常表達(dá)的Mad1基因序列的區(qū)別在于樣本第38位堿基由C突變成T，第64位堿基由G突變成A；樣本Mad2基因序列與正常表達(dá)的Mad2基因序列的區(qū)別在于樣本第55位堿基由C突變成A；樣本AURKB基因序列與正常表達(dá)的AURKB基因序列的區(qū)別在于樣本第57位堿基由G突變成A；樣本PlK1基因序列與正常表達(dá)的PlK1基因序列的區(qū)別在于樣本第72位堿基由G突變成T；樣本Cdc20基因序列與正常表達(dá)的Cdc20基因序列的區(qū)別在于樣本第42位堿基由G突變成A。樣本基因組中與紡錘體組裝檢驗點相關(guān)的6種基因表達(dá)均存在異常，說明樣本供體很可能為大腸癌患者或潛伏者，而所取糞便樣本確實來自大腸癌患者，驗證了本發(fā)明試劑盒檢測的準(zhǔn)確度。實施例五本實施例中的糞便樣本來自10名受試者，其中5名為大腸癌患者，5名為健康受試者。對糞便樣本編號1-10，試驗者并不清楚糞便樣本的來源，對每個糞便樣本使用3種方法檢測：方法1：檢測1種SAC相關(guān)基因；方法2：檢測3種SAC相關(guān)基因；方法3：采用本發(fā)明試劑盒來同時檢測6種SAC相關(guān)基因。通過檢測結(jié)果判斷糞便樣本提供者是否為大腸癌患者，檢測結(jié)果見表4。其中，“+”表示基因正常表達(dá)；“-”表示基因異常表達(dá)；“/”表示沒有檢測。若各基因表達(dá)均異常，則大腸癌檢測結(jié)果為陽性；若大腸癌各基因表達(dá)均正常，則大腸癌檢測結(jié)果為陰性；若各基因檢測結(jié)果為大部分正常/異常，小部分異常/正常，則大腸癌檢測結(jié)果可能出現(xiàn)弱陰性或弱陽性。表4受試者的基因檢測結(jié)果從表4的結(jié)果可以看到，編號1、5和7的糞便樣本在僅檢測其中一種SAC相關(guān)基因的時候，出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，編號8的糞便樣本在僅檢測其中一種SAC相關(guān)基因的時候，出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，說明僅檢測一種SAC相關(guān)基因的表達(dá)情況，準(zhǔn)確率低，并不足以判斷糞便的供體是否為大腸癌患者或為大腸癌潛伏期患者。當(dāng)檢測編號5和8的糞便樣本中的3種基因時，編號5的BubR1基因檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，編號8的Mad1基因檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，分別得出弱陽性和弱陰性的結(jié)果；而使用本發(fā)明的試劑盒，同時檢測6種SAC相關(guān)基因得到的結(jié)果為編號1、3、5、6和7呈陽性，推斷其糞便樣本來自大腸癌患者；編號2、4、8、9和10呈陰性，推斷其糞便樣本來自健康的受試者。糞便樣本搜集人員告知，編號為1、3、5、6和7的糞便樣本來自大腸癌患者，其糞便檢測結(jié)果理論上為陽性；編號2、4、8、9和10的糞便樣本來自健康的受試者，其糞便檢測結(jié)果理論上為陰性。綜上所述，本試劑盒檢測得到的結(jié)果與糞便的實際來源相符，說明本發(fā)明的試劑盒檢測結(jié)果準(zhǔn)確，而且同時檢測6種基因，非常便捷。以上所述僅為本發(fā)明較佳實施例，并不用于局限本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的修改、等同替換和改進(jìn)等，均需要包含在發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>劉鵬飛<120>大腸癌紡錘體組裝檢驗點檢測用試劑體系和試劑盒及應(yīng)用<130>OICN160078<160>30<170>PatentInversion3.5<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1tggctgtagtgttgaata18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>2cctactggttctaccttc18<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>3tcaggttgttaagtccag18<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4ctcgtttccatattctcttc20<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>5agggataatgaattttctgtaa22<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>6cgagtaaaggtttcagatg19<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>7gggtttagggatgagaag18<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>8gcacttacgttaagatgtc19<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>9ctcaggtgtggagtagga18<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>10catggtaaggtcagtctttc20<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>11agggaggtgttgattttc18<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>12gctgtagagtactttcagtc20<210>13<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>13tcaaccacttatcatcatctccactgt27<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>14tctcctcctcccgtctctgc20<210>15<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>15tcgtaagccgtagttgacgtaa22<210>16<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>16ccactgctattctccatcaccttct25<210>17<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>17ctgtccttcaatccgtggttccaatgc27<210>18<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>18actccgttgccacaggttatcagaa25<210>19<211>170<212>DNA<213>測序儀測得的BubR1序列<400>19tggctgtagtgttgaatacactaaaggcagcaaaggatggaagcaagggacaccagttaa60gagattattgaaataattcagctcaaaagtgagttgagccaggtggaaaacagtggagat120gatgataagtggttgatttctgtatatattttgaagggagaaccagtagg170<210>20<211>200<212>DNA<213>測序儀測得的Mad1序列<400>20ctcgtttccatattctcttcctctcctcctcccgtctttgcccagcccctggcttccctc60taaaaagatgctgttcctaagggtctgcaatgaattttccttctttcagagaaagacttc120caagttgtgtgccccgggaatgaaatggaataagagaacgaggtggagtagggcaagagt180ccctggacttaacaacctga200<210>21<211>101<212>DNA<213>測序儀測得的Mad2序列<400>21cgagtaaaggtttcagatggatatatgccacgctgatataaaatgctgttgatgacgaat60gctgcaagcaaaagaaatgttacagaaaattcattatccct101<210>22<211>122<212>DNA<213>測序儀測得的AURKB序列<400>22gcacttacgttaagatgtcgggtgtcccactgctattctccatcaccttctggccaaggg60cagctaaggagagaacaggtaggttgaatgcgaacagggatgaccttctcatccctaaac120cc122<210>23<211>96<212>DNA<213>測序儀測得的Plk1序列<400>23ctcaggtgtggagtaggacaggcctctgtccttcaatccgtggttccaatgcccatctgc60ttctcggcccttccaggaaagactgaccttaccatg96<210>24<211>80<212>DNA<213>測序儀測得的Cdc20序列<400>24agggaggtgttgattttcccagcgtctagactcactccgttaccacaggttatcagaaca60gactgaaagtactctacagc80<210>25<211>170<212>DNA<213>BubR1正常表達(dá)序列<400>25tggctgtagtgttgaatacactaaaggcagcaaaggatggaagcaagggacaccagttaa60gaggttattgaaataattcagctcaaaagtgagttgagccaggtggaaaacagtggagat120gatgataagtggttgatttctgtatatattttgaaggtagaaccagtagg170<210>26<211>200<212>DNA<213>Mad1正常表達(dá)的序列<400>26ctcgtttccatattctcttcctctcctcctcccgtctctgcccagcccctggcttccctc60taagaagatgctgttcctaagggtctgcaatgaattttccttctttcagagaaagacttc120caagttgtgtgccccgggaatgaaatggaataagagaacgaggtggagtagggcaagagt180ccctggacttaacaacctga200<210>27<211>101<212>DNA<213>Mad2正常表達(dá)的序列<400>27cgagtaaaggtttcagatggatatatgccacgctgatataaaatgctgttgatgccgaat60gctgcaagcaaaagaaatgttacagaaaattcattatccct101<210>28<211>122<212>DNA<213>AURKB正常表達(dá)的序列<400>28gcacttacgttaagatgtcgggtgtcccactgctattctccatcaccttctggccagggg60cagctaaggagagaacaggtaggttgaatgcgaacagggatgaccttctcatccctaaac120cc122<210>29<211>96<212>DNA<213>Plk正常表達(dá)的序列<400>29ctcaggtgtggagtaggacaggcctctgtccttcaatccgtggttccaatgcccatctgc60ttctcggccctgccaggaaagactgaccttaccatg96<210>30<211>80<212>DNA<213>Cdc20正常表達(dá)的序列<400>30agggaggtgttgattttcccagcgtctagactcactccgttgccacaggttatcagaaca60gactgaaagtactctacagc80當(dāng)前第1頁1 2 3