本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種針對小麥γ-醇溶蛋白啟動子區(qū)域是否被甲基化的檢測方法。

背景技術(shù)：

小麥籽粒主要由蛋白、核酸、脂類、糖類、水分等類型物質(zhì)組成。小麥種子中儲藏蛋白所占比例大，主要包括谷蛋白和醇溶蛋白兩類，它們決定了小麥獨特的加工品質(zhì)。小麥面粉在加水揉和時可形成有彈性且能粘合的面團，其獨有的粘合性是因其含有不溶于水的蛋白質(zhì)，即麥谷蛋白和麥醇溶蛋白。一般而言，醇溶蛋白占小麥種子儲藏蛋白總量的40~50%，是人類主要攝取蛋白營養(yǎng)的來源之一。

已有研究認(rèn)為，小麥?zhǔn)侵饕氖澄镞^敏原之一，因而小麥籽粒中蛋白質(zhì)的含量和質(zhì)量直接影響人的生活品質(zhì)和健康。例如，小麥醇溶蛋白是乳糜瀉的主要致病抗原，它主要以多肽單鏈的形式存在，富含谷氨酰胺和脯氨酸，根據(jù)醇溶蛋白在A-PAGE （pH=3.1）電泳遷移率的不同，可將其分為α（最快）、β、γ和ω（最慢）四種類型，這些蛋白的毒性被認(rèn)為對粘膜損害較大。因此，對醇溶蛋白的克隆和功能解析也日漸成為當(dāng)今小麥基因組研究的主要任務(wù)之一，尤其對小麥中特定醇溶蛋白（如γ-醇溶蛋白TaWG04）的克隆、分析，可為特定過敏人群的健康提供基礎(chǔ)性的研究保障。

就基因序列（如啟動子序列）而言，當(dāng)其被特定改造或化學(xué)修飾后，通常即意味著表達(dá)活性的喪失。作為化學(xué)修飾中的一種，DNA甲基化屬于一種經(jīng)典的表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象，也是一種較為常見、研究的較為深入的一種基因修飾方式。DNA甲基化過程為：在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，甲基基團轉(zhuǎn)移到胞嘧啶堿基（C）上。DNA甲基化修飾后，DNA 序列并不發(fā)生改變，但基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)通常會受到明顯影響，甚至可能引起基因的沉默。

就γ-醇溶蛋白TaWG04的研究而言，現(xiàn)有研究已對其基因序列、基因表達(dá)模式有了基礎(chǔ)性的研究。但在進一步研究中發(fā)現(xiàn)，不同品種之間該基因的表達(dá)量存在著一定的差異，而對造成這一差異的原因：例如是由于基因序列差異、還是啟動該基因表達(dá)的啟動子的差異，則需進一步研究。就啟動子研究而言，則需對是由于啟動子序列差別，還是化學(xué)修飾原因進行進一步甄別。而基于這些研究，則可對特定蛋白的表達(dá)進行基因調(diào)節(jié)，從而較為徹底解決過敏原蛋白問題，因而具有十分重要的應(yīng)用意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種針對γ-醇溶蛋白TaWG04的啟動子pTaWG04的堿基是否發(fā)生甲基化的檢測方法，從而便于判定γ-醇溶蛋白TaWG04能否得到有效表達(dá)，進而為小麥品質(zhì)改良奠定應(yīng)用基礎(chǔ)。

本申請所采取的技術(shù)方案詳述如下。

一種小麥γ-醇溶蛋白啟動子區(qū)域甲基化的檢測方法，所述小麥γ-醇溶蛋白為γ-醇溶蛋白TaWG04，所述啟動子為啟動γ-醇溶蛋白TaWG04進行翻譯表達(dá)的啟動子pTaWG04，其堿基序列如SEQ ID NO.1所示；具體檢測步驟如下：

（1）提取小麥樣品的DNA，并用重亞硫酸鹽處理DNA提取物；

（2）利用在線甲基化引物設(shè)計軟件進行特異性引物的設(shè)計，（http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi）引物序列如下：

正向引物F：5’-ATTTTTTGAGGAATTTTATATTTGGTT-3’，

反向引物R：5’-ATCCRTTTCAATTAAATCTTCCA-3’；

（3）以步驟（1）中處理后DNA為模板，利用步驟（2）中所設(shè)計的引物序列，進行甲基化特異PCR（MSP）反應(yīng)；10μL的 PCR檢測反應(yīng)體系設(shè)計如下：

25mM Mgcl₂，1μL；

10×Maxima Hot Start Taq buffer，1μL；

Maxima Hot start Taq DNA Polymerase，0.1μL；

2.5mM dNTP mix，1μL；

正向引物F，0.2μL；

反向引物R，0.2μL；

步驟（1）中處理后的DNA模板，1μL；

ddH₂O，5.5μL；

PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4min；95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延長1min，30個循環(huán)；72℃后延伸10min；

（4）回收步驟（3）中PCR擴增產(chǎn)物，利用TA克隆技術(shù)，將所回收的PCR擴增片段克隆到pMD18-T載體上，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、驗證后，挑選陽性克隆質(zhì)粒進行測序；

將測序結(jié)果與確定的未甲基化序列進行比對，最終判定啟動子pTaWG04區(qū)域堿基序列的甲基化情況，判定方法為：

經(jīng)甲基化特異PCR反應(yīng)后，DNA序列中非甲基化的胞嘧啶（C）會完全轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U），而如果含有甲基化堿基，則甲基化的5-甲基胞嘧啶會保持不變。

所述確定的未甲基化序列，為小麥品種中γ-醇溶蛋白TaWG04正常表達(dá)所對應(yīng)的的啟動子pTaWG04的序列。

所述γ-醇溶蛋白TaWG04正常表達(dá)所對應(yīng)的的啟動子pTaWG04的序列，所對應(yīng)小麥品種具體例如為鄭麥004。

所述pTaWG04啟動子，發(fā)生甲基化的小麥品種，具體例如為鄭麥366、西農(nóng)979、新麥26、鄭麥9023或濟麥20。

甲基化修飾的pTaWG04啟動子在小麥品種改良中的應(yīng)用，pTaWG04啟動子的-749bp處胞嘧啶（C）和-729bp處胞嘧啶（C）發(fā)生甲基化修飾時，抑制γ-醇溶蛋白TaWG04的表達(dá)；

所述甲基化修飾的pTaWG04啟動子，其對應(yīng)小麥品種來源，具體例如為鄭麥366、西農(nóng)979、新麥26、鄭麥9023或濟麥20。

基于上述甲基化檢測方法，檢測結(jié)果表明，小麥品種鄭麥366中醇溶蛋白TaWG04的啟動子pTaWG04上游的區(qū)段TTGCACACGGTGTATCAAATACAATGACGCA（-756bp ~-726bp）中的-749bp的胞嘧啶（C）和-729bp的胞嘧啶（C）被甲基化修飾，而甲基化修飾后，抑制了醇溶蛋白TaWG04的表達(dá)；進一步實驗表明，針對相應(yīng)甲基化堿基去甲基化后，醇溶蛋白TaWG04基因的表達(dá)得到了增強。

在前期研究中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)γ-醇溶蛋白TaWG04的基因組DNA序列在鄭麥366和鄭麥004中無差異。然而，該基因表達(dá)水平在兩個品種中具有明顯差異，該基因的表達(dá)在鄭麥366明顯受到抑制，結(jié)合其他研究情況，發(fā)明人推測γ-醇溶蛋白TaWG04的啟動子pTaWG04區(qū)域部分堿基序列可能存在甲基化現(xiàn)象。

針對基因的甲基化檢測方法中，甲基化特異PCR（Methylation-Specific PCR，MSP）是一種快速檢測基因是否甲基化的方法，其技術(shù)原理是將DNA序列中未甲基化的胞嘧啶（C）完全轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U），而尿嘧啶（U）在DNA復(fù)制過程中轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶（T），而甲基化的5-甲基胞嘧啶保持不變，從而對相關(guān)基因是否被甲基化修飾做出判定。由于該方法可以進行微量分析和同源基因分析，因而在相關(guān)基因分析中具有一定的應(yīng)用前景。但就本申請而言，由于前期僅是推測啟動子部分堿基序列可能存在甲基化現(xiàn)象，但是否真實存在甲基化以及是否僅是由于啟動子部分甲基化造成的基因表達(dá)差異，則是未知的，也因此，在面臨未知序列時，僅僅依賴于甲基化特異PCR對部分堿基進行檢測判定時，是存在較大不確定性的。

總之，本申請所提供的甲基化檢測方法特異性針對小麥γ-醇溶蛋白啟動子區(qū)域進行檢測，具有檢測周期短、特異性高、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點；其直接應(yīng)用效果是可對啟動子是否存在甲基化進行判定，依據(jù)此結(jié)果，進而可有效識別γ-醇溶蛋白TaWG04在小麥品種中分布情況（或者說可判定γ-醇溶蛋白TaWG04是否得到有效表達(dá)），從而為小麥品質(zhì)改良奠定理論依據(jù)和應(yīng)用基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為鄭麥366和鄭麥004中TaWG04基因的定量PCR結(jié)果；結(jié)果表明，TaWGG04基因在鄭麥366中表達(dá)量較低，該基因的表達(dá)可能受到抑制，圖中“**”表示TaWG04基因在兩個材料中的表達(dá)量具有顯著性差異；

圖2為鄭麥366和鄭麥004甲基化特異性PCR檢測后，TaWG04基因啟動子上游-726bp到-756bp的序列對比圖；從序列對比中可以看出，在鄭麥004中，-749bp和-729bp位置處C轉(zhuǎn)化為T，而在鄭麥366中， -749bp和-729bp位置處沒有發(fā)生轉(zhuǎn)化；其中Un-鄭麥366表示甲基化PCR檢測處理前核苷酸序列，T-鄭麥366-1~10表示10份鄭麥366樣品的甲基化PCR檢測結(jié)果，T-鄭麥004-1~10表示10份鄭麥004樣品的甲基化PCR檢測結(jié)果；

圖3為5種不同強筋品種小麥（鄭麥366、西農(nóng)979、新麥26、鄭麥9023、濟麥20）的TaWG04基因啟動子上游的甲基化特異PCR檢測結(jié)果，其中圖A為甲基化特異PCR（MSP）檢測后電泳圖，圖B為甲基化特異PCR（MSP）檢測后TaWG04基因啟動子上游的序列比對圖；圖B中Un-鄭麥366表示甲基化特異PCR檢測前的堿基序列，T-鄭麥366、T-西農(nóng)979、T-新麥26、T-鄭麥9023和T-濟麥20表示甲基化特異PCR檢測后的堿基序列；

圖4為利用去甲基化試劑處理5種不同強筋品種小麥（鄭麥366、西農(nóng)979、新麥26、鄭麥9023、濟麥20）后，定量PCR對TaWG04基因表達(dá)量的檢測結(jié)果；結(jié)果表明，經(jīng)去甲基化處理后，TaWG04基因的表達(dá)量明顯提高；其中“**”表示TaWG04基因在兩個材料中的表達(dá)量具有顯著性差異。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明技術(shù)方案進一步詳細(xì)的說明，在介紹具體實施例前，就下述實施例中涉及部分物料情況簡要介紹說明如下。

生物材料：

鄭麥366（強筋品種）、西農(nóng)979（強筋品種）、新麥26（強筋品種）、鄭麥9023（強筋品種）、濟麥20（強筋品種）、鄭麥004（弱筋品種），均由河南省農(nóng)科院提供，這些品種均屬于可公開獲得的商品化小麥品種；

大腸桿菌DH5α菌株，購自北京全式金公司；

實驗試劑：

DNA分子量標(biāo)記（DNA Marker）、PCR mix等為TaKaRa公司產(chǎn)品；

高保真酶Phusion、pMD18-T載體、cDNA第一條鏈合成試劑盒購自Fermentas公司；

質(zhì)粒小提試劑盒、膠回試劑盒、RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；

用于甲基化DNA樣品提取的試劑盒購自于QIAGEN公司 (DNEASY PLANT MiNi Kit)；

甲基化分析試劑盒購自于QIAGEN公司 (EpiTect Bisulfite Kit)。

實施例1

在前期研究基礎(chǔ)上，發(fā)明人已知γ-醇溶蛋白TaWG04基因的啟動子pTaWG04序列如SEQ ID NO.1所示，因此發(fā)明人初步認(rèn)為鄭麥366和鄭麥004的γ-醇溶蛋白TaWG04基因的啟動子pTaWG04的序列也是相同的。

雖然堿基序列相同，但進一步Real time PCR分析表明，TaWG04基因的表達(dá)量（即γ-醇溶蛋白TaWG04的含量）在鄭麥366和鄭麥004中有明顯差異。下面就Real time PCR分析實驗簡要介紹如下。

（1）首先提取RNA（RNA提取試劑盒），并反轉(zhuǎn)錄為cDNA（cDNA第一條鏈合成試劑盒），具體操作過程為：

分別取鄭麥366、鄭麥004授粉28天后種子，提取其RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA；

（2）以Actin作為內(nèi)參基因，設(shè)計特異性引物，以上述所制備cDNA為模板，進行Real time PCR分析；

所用定量引物設(shè)計為：

TaWG04-F：5’- TGCATGTCCCATCTGATTGC-3’，

TaWG04-R：5’-TTTCCATTGCTACATCGATGGT-3’；

Actin-F:：5’- GGCCCTTGCTCCTAGCAGTA-3’，

Actin-R：5’- CCGGGACCAGACTCATCGTA-3’；

Real time PCR的20μL反應(yīng)體系設(shè)計如下：

cDNA 模板，60ng/μL、8.4μL；

TaWG04-F，10μM、0.8μL；

TaWG04-R，10μM、0.8μL；

SYBR Green Real-time PCR Master Mix，10μL；

Real time PCR 擴增程序如下為：95℃、2min (1個循環(huán))；95℃、10s，60℃、10s，72℃、30s (40個循環(huán))；95℃、10s (1個循環(huán))；65℃至95 ℃ 5s。

最后，依照2^{?ΔΔ Ct}方法，利用Bio-Rad CFX Manager軟件分析Real-time PCR 的結(jié)果。根據(jù)表達(dá)量均值±SEM作圖。

結(jié)果如圖1B所示。從Real time PCR結(jié)果可以看出，γ-醇溶蛋白TaWG04基因在鄭麥366和鄭麥004的表達(dá)情況有十分明顯的差異。

需要說明的是，相關(guān)操作參考相應(yīng)試劑盒說明書進行操作即可，不再贅述。

實施例2

從上述實施例1可以看出，雖然γ-醇溶蛋白TaWG04基因的啟動子pTaWG04序列相同，但在不同品種中γ-醇溶蛋白TaWG04基因表達(dá)量差異較大。發(fā)明人初步判定這一差別是由于啟動子pTaWG04序列存在一定差異造成的，而由于已知其堿基序列是相同的，那么這種差別極有可能是其中一個品種中的啟動子中部分堿基序列被化學(xué)修飾所造成的。由于甲基化修飾是化學(xué)修飾中最為普通和常見的一種改變堿基活性的形式，因而發(fā)明人首先利用甲基化特異PCR技術(shù)對γ-醇溶蛋白TaWG04基因的啟動子pTaWG04的堿基序列是否存在甲基化現(xiàn)象進行了分析，具體檢測實驗過程簡要介紹如下。

（1）提取小麥樣品DNA，參考植物DNA提取試劑盒（QIAGEN公司，DNEASY PLANT MiNi Kit）的說明書，分別提取鄭麥366和鄭麥004的DNA，具體操作步驟如下：

（A）首先用液氮快速冷凍的方法研碎樣品（鄭麥004和鄭麥366種子），然后加入400 μL Buffer AP1與4 μL Rnase A（用前不可混勻），65℃條件下孵育15min，孵育過程中每2~3min顛倒一次（可根據(jù)需要適當(dāng)增長孵育時間，使RNA充分降解）；

（B）向步驟（A）的反應(yīng)液中加130 μL的Buffer P3，混勻，冰浴5min；然后17000g離心5min；

吸取上清至新的Qiagen shreader吸附柱(紫色)中，再17000g離心2min；

吸取收集液至新的EP管（2mL）中，加1.5mL Buffer AW1，吹打混勻；

再吸取上清650 μL至DNeasy吸附柱（白色）中，10000g離心1min，倒掉上清，重復(fù)直至溶液全部移完；

（C）放入新的2mL EP管中，加入500μL Buffer AW2，10000g、離心1min，倒掉上清；

再加入500μL Buffer AW2，17000g、離心2min；

將收集管放入新的1.5mL Ep管中，靜置5min（充分除掉乙醇，可在超凈工作臺中進行）；

（D）100μL Buffer AE溶解，室溫放置5min，10000g、離心1min（為提高DNA濃度可減少溶解液的量）；

重復(fù)此步驟（將液體重新吸入，再次離心提高樣品獲得量）。

（2）重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化DNA，以便進行甲基化分析，具體為：

利用QIAGEN公司的甲基化分析試劑盒（EpiTect Bisulfite Kit）對步驟（1）中所得DNA進行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化處理，具體處理步驟如下：

（A）開始前準(zhǔn)備工作：

Buffer BW中加入30mL 無水乙醇（用之前顛倒混勻），15~25℃保存?zhèn)溆茫?/p>

Buffer BD中加入27mL 無水乙醇（96%~100%），2~8℃保存?zhèn)溆茫ㄊ褂弥皳u勻，使用之后立即蓋上蓋子）；

加310uL Rnase-free 到Lyophilized Carrier RNA（310μg）中，配成1μg/μL濃度的溶液，渦旋均勻（Carrier RNA使DNA與Epitect膜結(jié)合更加緊密）；

將溶解Carrier RNA的溶液與Buffer BL以1:10的比例進行混勻；

實驗過程中，如果Buffer BL有析出物，可放置（<70℃）水浴中，柔和攪拌使其溶解；但使用前應(yīng)使各溶液保持同一室溫；

（B）重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化DNA，具體過程為：

a、將800μL Rnase-free water 加入到 Bisulfite Mix中，混勻大約5min直至Bisulfite Mix完全溶解（溶解過程中可加熱至60℃左右以促進溶解，溶解后千萬不要放置在冰上）；

b、配制140 μL重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化反應(yīng)液，具體為：

DNA solution(1ng~2ug)，10 μL；

Rnase-free water，10μL；

Bisulfite Mix，85μL；

DNA Protect Buffer，35μL；

混勻反應(yīng)液后，置于室溫（15~25℃）條件下以充分混勻；

需要說明的是，DNA Protect Buffer加入后，溶液會從綠變藍(lán)，此時表明混勻充分且PH值正確；

c、將上述混勻的反應(yīng)液置于進行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化DNA反應(yīng)，反應(yīng)大約5h（整個反應(yīng)過程不要超過6h）；具體反應(yīng)過程為：

變性，95℃、5min；保溫孵化，60℃、25min；變性，95℃、5min；保溫孵化，60℃、85min；變性，95℃、5min；保溫孵化，60℃、175min；保存，20℃、30min。

需要說明的是，重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化DNA后，轉(zhuǎn)變后DNA可以保存在PCR儀中，不會有性能損失。

（C）純化重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的DNA，具體為：

將步驟（B）中反應(yīng)完全的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到新的1.5mL離心管中(沉淀不影響后續(xù)實驗，但盡量不要沉淀)；加560μL Buffer BL（含有10μg/mL Carrier RNA），渦旋并瞬時離心；

吸全部混合液于吸附柱中，12000g離心1min，倒掉收集液；

向吸附柱中加入500μL Buffer BW，12000g離心1min，倒掉收集液；

向吸附柱中加入500μL Buffer BD，室溫（15~25℃）孵育15min，蓋好蓋子，12000g離心1min，倒掉收集液；

向吸附柱中加入500μL Buffer BW，12000g離心1min，倒掉收集液；重復(fù)此步驟一次；

將吸附柱放入新的2mL收集管中，12000g離心1min，去掉殘余液體；

將吸附柱放入新的1.5ml離心管中，56℃孵育5min，以便讓殘余液體蒸發(fā)；

向吸附柱的濾膜中加入20μL Buffer EB，15000g離心1min洗脫DNA，洗脫的DNA用于后續(xù)實驗或保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

（3）PCR擴增，轉(zhuǎn)化、篩選，并進行測序，以便對堿基是否發(fā)生了甲基化進行判定，具體過程為：

首先設(shè)計特異引物，以步驟（2）中洗脫的DNA為模板，進行PCR擴增，具體引物序列設(shè)計如下：

正向引物F：5’-ATTTTTTGAGGAATTTTATATTTGGTT-3’，

反向引物R：5’-ATCCGTTTCAATTAAATCTTCCA-3’；

10μL 的PCR擴增體系設(shè)計如下：

25mM Mgcl₂，1μL；

10×Maxima Hot Start Taq buffer，1μL；

Maxima Hot start Taq DNA Polymerase，0.1μL；

2.5mM dNTP mix，1μL；

正向引物F，0.2μL；

反向引物R，0.2μL；

步驟（2）中洗脫DNA（Template DNA），1μL；

ddH₂O，5.5μL；

PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4min；95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延長1min，30個循環(huán)；72℃后延伸10min。

對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳檢測（膠濃度為1.2%），目標(biāo)條帶約300bp，切取含有目標(biāo)條帶的膠塊于2mL離心管中，利用天根公司的膠回收試劑盒進行PCR產(chǎn)物的回收?；厥盏腜CR產(chǎn)物構(gòu)建到pMD18-T載體上（Fermentas公司），10μL連接體系如下：

pMD18-T Vector，1μL；

Solution I，5μL；

回收產(chǎn)物， 4μL；

16℃連接3小時

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中，涂布于固體LB篩選培養(yǎng)基（Amp抗性，濃度為100mg/mL），放于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14h。挑取單克隆并送生工生物工程（上海）進行片段測序。

測序結(jié)果表明：鄭麥366和鄭麥004的啟動子pTaWG04堿基序列完全相同（測序結(jié)果如序列表SEQ ID NO.1所示），其上游-726bp到-756bp處基因堿基序列具體為（如圖1A所示）：

鄭麥366（鄭麥004）： -756 TTGCACACGGTGTATCAAATACAATGACGCA -726。

但基于上述甲基化檢測結(jié)果表明：小麥品種鄭麥366中γ-醇溶蛋白TaWG04基因的啟動子pTaWG04上游的區(qū)段TTGCACACGGTGTATCAAATACAATGACGCA（-756bp ~-726bp）中可以看出，在-749、-735、-727、-729位置上C均未發(fā)生變化，表明在這四個位置上出現(xiàn)甲基化現(xiàn)象，但序列比對發(fā)現(xiàn)-749、-729在鄭麥004中沒有發(fā)生甲基化，（如圖2所示），而正是由于這一甲基化修飾的差異，抑制了γ-醇溶蛋白TaWG04在鄭麥366中的表達(dá)（如圖1所示）。

同鄭麥366一樣，發(fā)明人進一步對西農(nóng)979、新麥26、鄭麥9023和濟麥20中的啟動子pTaWG04進行了甲基化特異PCR和測序分析，結(jié)果如圖3所示。從圖3A中可以基本判定，這些品種的啟動子序列是相同的，但從圖3B的測序結(jié)果可以看出，這些品種中的啟動子的部分堿基同樣發(fā)生了甲基化修飾現(xiàn)象。

實施例3

在實施例2檢測結(jié)果基礎(chǔ)上，為進一步驗證堿基的甲基化修飾是唯一的影響γ-醇溶蛋白TaWG04表達(dá)的原因，因而有必要就甲基化堿基重新去甲基化，同時檢測去甲基化后γ-醇溶蛋白TaWG04的表達(dá)情況，如果檢測結(jié)果表明，去甲基化后，γ-醇溶蛋白TaWG04的表達(dá)量得到了明顯提高（或者說表達(dá)量得到了恢復(fù)），那么即可認(rèn)為啟動子pTaWG04中部分堿基的甲基化是影響γ-醇溶蛋白TaWG04表達(dá)的唯一原因。實際結(jié)果也證明了，啟動子pTaWG04中部分堿基的甲基化確實是唯一影響因素。下面就相關(guān)實驗過程簡要介紹如下。

（一）甲基化的啟動子pTaWG04中部分堿基的去甲基化

利用去甲基化試劑（5-Aza-2′-deoxycytidine ，Sigma公司）分別對鄭麥366、西農(nóng)979、新麥26、鄭麥9023和濟麥20進行處理，具體的去甲基化實驗過程為：

1、取12mg的5-Aza-2′-deoxycytidine（5-氮雜-2’-脫氧胞苷）試劑加入到50mL無菌水中溶解，配制成1mM 的溶液備用；

2、將12.1g 的Tris溶解到無菌水中，用Hcl調(diào)節(jié)pH到7.5，定容至100mL，配制成1M Tris-Hcl（pH 7.5）；

3、制備用于小麥種子樣品處理的去甲基化試劑緩沖液，其對照組與實驗組緩沖液的配置方案如下：

；

4、將小麥種子消毒滅菌后，用上述實驗試劑分別處理，發(fā)芽后，移入溫室種植，具體過程為：

首先，分別取不同品種的小麥種子，分別進行消毒滅菌，具體滅菌程序為：70%酒精浸泡1min，然后洗滌2-3次；30% H₂O₂浸泡5min，再洗滌3-5次；

其次，將種子晾干后，置于加有一層濾紙的培養(yǎng)皿上，加入2mL無菌水， 37℃培養(yǎng)16h；

然后，將培養(yǎng)后的種子分別置于加有一層濾紙的新培養(yǎng)皿上，標(biāo)注為A（對照組）和B（實驗組），向A（對照組）加入2mL A緩沖液，25℃、黑暗培養(yǎng)48h，向B（實驗組）加入2mL B緩沖液，25℃、黑暗培養(yǎng)48h；

最后，待種子發(fā)芽后移入溫室種植，培育條件如下：

光周期為16 小時光照和8 小時黑暗，光照強度500μmol/m²/s，苗期光照時溫度為20℃、黑暗時溫度為15℃，孕穗及灌漿期光照時溫度為30℃、黑暗時溫度為20℃。

（二）利用實時定量熒光PCR對γ-醇溶蛋白TaWG04的表達(dá)量進行檢測

分別采集上述去甲基化試劑處理后的鄭麥366、西農(nóng)979、新麥26、鄭麥9023和濟麥20小麥成熟種子，提取種子RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用實時定量熒光PCR（qPCR試劑盒，TOYOBO公司）技術(shù)對γ-醇溶蛋白TaWG04的表達(dá)量進行檢測，具體檢測過程如下。

（1）首先提取RNA（RNA提取試劑盒），并反轉(zhuǎn)錄為cDNA（cDNA第一條鏈合成試劑盒），具體操作過程為：

（2）以Actin作為內(nèi)參基因，設(shè)計特異性引物，以上述所制備cDNA為模板，進行Real time PCR分析；

所用定量引物設(shè)計為：

TaWG04-F：5’- TGCATGTCCCATCTGATTGC-3’，

TaWG04-R：5’-TTTCCATTGCTACATCGATGGT-3’；

Actin-F:：5’- GGCCCTTGCTCCTAGCAGTA-3’，

Actin-R：5’- CCGGGACCAGACTCATCGTA-3’；

Real time PCR的20μL反應(yīng)體系設(shè)計如下：

cDNA 模板，60ng/μL、8.4μL；

TaWG04-F，10μM、0.8μL；

TaWG04-R，10μM、0.8μL；

SYBR Green Real-time PCR Master Mix，10μL；

Real time PCR 擴增程序如下為：95℃、2min (1個循環(huán))；95℃、10s，60℃、10s，72℃、30s (40個循環(huán))；95℃、10s (1個循環(huán))；65℃至95 ℃ 5s。

最后，依照2^{?ΔΔ Ct}方法，利用Bio-Rad CFX Manager軟件分析Real-time PCR 的結(jié)果。根據(jù)表達(dá)量均值±SEM作圖。

結(jié)果如圖4所示。從Real time PCR結(jié)果可以看出，去甲基化試劑處理后的鄭麥366、西農(nóng)979、新麥26、鄭麥9023和濟麥20中γ-醇溶蛋白TaWG04的表達(dá)量明顯提高。

綜上所述，通過一系列的甲基化和去甲基化實驗，可以認(rèn)為，啟動子pTaWG04中部分堿基的甲基化是唯一影響γ-醇溶蛋白TaWG04表達(dá)量的影響因素。基于此特性，可為小麥品種改良奠定良好的理論基礎(chǔ)和應(yīng)用基礎(chǔ)。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所

<120> 一種小麥γ-醇溶蛋白啟動子區(qū)域甲基化的檢測方法

<130> none

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1571

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 1

tagatcccct gttgtaattt atcaaaaatt tatacacaag ctgcctttcc ataatttgaa 60

acattgtact ttctacttgc ctgcaggaag aactcttttg ttatggaccc ccttatctgg 120

cgaatagtcg ccaggagggg gtggcatttg cgaatgattc gctggcagtt ttagtttgag 180

ggatggaagt ttacatcagg gcgacatgac aatttctttt tgagaaggca aattgttgtt 240

ttaaataggc atcgtttgat cttgtctcgg aaccgaaact gccatcgaaa gagtttcgtt 300

tgccacctct ctcccagcaa acgattgcca attatgatta ccgtttgtta tatgcatgaa 360

ctgtgcgtct acagttggcg gcagcgaggt tgaggagacc ggtgtcatcg gcagcggctt 420

cagccggtgg aggcgtccta tggttgacgg ccgtgctcct tcctgctcga gaagagaagt 480

gagagggtgg tgagaggtga agagagcagg aggcggcagc ctggtgctgc tgcgggtcgt 540

agtaggagcc aaggcggcgg tgctgggtgg ctcgggctgt tatgcgggcg cgcgagcgac 600

accaagccct caacaaccgt gtccgtttca gttgggtctt ccatgttggg tacactggtg 660

gtgtccggct ctccgtctgc gtccattgtc cgttttggcg acccaaacgg acaaaaagcg 720

gacaaaaatt cgtgtccgtt tgagtcattg cgttgaagtt ggccttatgc tattccacag 780

tatactcaac gcactctaat tcacattgca tgctattaca tgcgtcattg tatttgatac 840

accgtgtgca atattttttt tctggtgaca atatatctac tatcgaacca agtataaagt 900

tcctcaaagg gtttaatatc atgttcatgg tgttcccgcg gaaatgcatg ggaatcatct 960

agtgtctatt aacaactata cgacattact aacattggca taaaaaaaag aattgatgag 1020

tcatgtatgc ttgttcatct taccatcata ttacacaaaa ctacgaagtt agttcagaaa 1080

gaaatagtct agaacaatct tcatattaat agtatgatct atcttaacaa cgccaagcaa 1140

gactataaac ttagttcccg acaagctatg ccaacctaga tgtgcctaac aacttgcaga 1200

acattacaaa cttagtttta gaaaggggtg taatatagat aagtgtttcg catgtaaaat 1260

gaatatgatg agtcattacg attatcaagc tttcctggca ctccatggat gtgtgctgca 1320

agaaagcaac tttggcgatc aatctgaaaa ttacacttgt aagtagcgcc accgaacaaa 1380

acataccaaa ggatcagttt gataagagta gaggaacttt acaagaaagc aaatgtgaag 1440

acgaaaagaa atcatttcat ggcagctata aatagccata cgccatgaag acccccttcc 1500

atcatccatc cttcagaaat ttggagcaca agcatccata ataaacaatc aagagtaacc 1560

acaaattcac c 1571