1.一種小麥γ-醇溶蛋白啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的檢測(cè)方法,其特征在于,所述小麥γ-醇溶蛋白為γ-醇溶蛋白TaWG04,所述啟動(dòng)子為啟動(dòng)γ-醇溶蛋白TaWG04進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)的啟動(dòng)子pTaWG04,pTaWG04啟動(dòng)子的堿基序列如SEQ ID NO.1所示;具體檢測(cè)步驟如下:
(1)提取小麥樣品的DNA,并用重亞硫酸鹽處理DNA提取物;
(2)設(shè)計(jì)特異性引物序列如下:
正向引物F:5’-ATTTTTTGAGGAATTTTATATTTGGTT-3’,
反向引物R:5’-ATCCGTTTCAATTAAATCTTCCA-3’;
(3)以步驟(1)中處理后DNA為模板,利用步驟(2)中所設(shè)計(jì)的引物序列,進(jìn)行甲基化特異PCR反應(yīng);
(4)回收步驟(3)中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,利用TA克隆技術(shù),將所回收的PCR擴(kuò)增片段克隆到pMD18-T載體上,經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、驗(yàn)證后,挑選陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序;
將測(cè)序結(jié)果與確定的未甲基化序列進(jìn)行比對(duì),最終判定啟動(dòng)子pTaWG04區(qū)域堿基序列的甲基化情況,判定方法為:
經(jīng)甲基化特異PCR反應(yīng)后,DNA序列中非甲基化的胞嘧啶會(huì)完全轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,而如果含有甲基化堿基,則甲基化的5-甲基胞嘧啶會(huì)保持不變;
所述確定的未甲基化序列,為小麥品種中γ-醇溶蛋白TaWG04正常表達(dá)所對(duì)應(yīng)的的啟動(dòng)子pTaWG04的序列。
2.如權(quán)利要求1所述小麥γ-醇溶蛋白啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的檢測(cè)方法,其特征在于,所述γ-醇溶蛋白TaWG04正常表達(dá)所對(duì)應(yīng)的啟動(dòng)子pTaWG04的序列,所對(duì)應(yīng)小麥品種具體為鄭麥004。
3.甲基化修飾的pTaWG04啟動(dòng)子在小麥品種改良中的應(yīng)用,其特征在于,pTaWG04啟動(dòng)子的-749bp處胞嘧啶和-729bp處胞嘧啶發(fā)生甲基化修飾時(shí),抑制γ-醇溶蛋白TaWG04的表達(dá)。
4.如權(quán)利要求3所述甲基化修飾的pTaWG04啟動(dòng)子在小麥品種改良中的應(yīng)用,其特征在于,所述甲基化修飾的pTaWG04啟動(dòng)子,其對(duì)應(yīng)小麥品種來源,具體為鄭麥366、西農(nóng)979、新麥26、鄭麥9023或濟(jì)麥20。