本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及CCDC168作為標記物在檢測胰腺癌試劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，在西方國家惡性腫瘤死亡率第四位,全球每年約250萬人死于胰腺癌。我國胰腺癌發(fā)病率逐年上升，近20年增長迅速。胰腺癌的治療主要為手術(shù)、化療和放療相結(jié)合的綜合治療，其五年生存率小于5％。由于胰腺的解剖學位置較深，腹部疼痛、體重減輕、黃疸等臨床特異性的癥狀不易被發(fā)現(xiàn)，多數(shù)患者確診時已發(fā)生癌癥轉(zhuǎn)移。胰腺癌發(fā)生肝轉(zhuǎn)移較早，早期診斷、根治性手術(shù)切除是胰腺癌患者獲得長期存活的唯一希望，但80％以上的患者就診時已經(jīng)失去了根治性切除的機會。因此，提高胰腺癌的早期診斷率，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，提高藥物的治療效果，成為改善胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。臨床上常用的胰腺癌腫瘤學標志物是CA19-9。CA19-9單獨作為診斷胰腺癌的指標尚不精確，敏感性較低，并且在其他消化道腫瘤及良性疾病中也有升高，因此對胰腺癌早期診斷的價值有限。另外，一些基因腫瘤標志物也用于臨床胰腺癌的早期診斷，但始終未能達到診斷的目的。目前應(yīng)用于臨床的胰腺癌的診斷和治療手段，尤其是對腫瘤的早期診斷、殘留病灶及復發(fā)的檢測方法仍然十分有限，是目前迫切需要解決的問題。DNA甲基化修飾是基因組表觀遺傳調(diào)控中主要的方式，人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與DNA甲基化的異常有關(guān)，基因啟動子區(qū)CpG島高甲基化可導致抑癌基因表達沉默進而導致腫瘤發(fā)生。DNA甲基化是指在甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下,以s-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到CG二核苷酸胞嘧啶的5號碳原子上,形成5甲基胞嘧啶。DNA甲基化異常是細胞癌變過程中早期、頻發(fā)事件，因此特異基因的甲基化可作為癌癥早期診斷的分子標志物、治療靶點和判斷預(yù)后手段。CCDC168又名C13orf40(Coiled-coildomaincontaining168，卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域168)是蛋白編碼基因，位于13號染色體上。有研究發(fā)現(xiàn)CCDC168蛋白在膀胱組織中的表達量高于癌旁正常組織。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一在于提供一種新的胰腺癌相關(guān)mRNACCDC168，以及其表達蛋白。本發(fā)明的目的之二在于提供CCDC168或其表達蛋白在制備檢測胰腺癌試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之三在于提供一種用于檢測胰腺癌組織中CCDC168基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的引物組。本發(fā)明的目的之四在于提供一種用于檢測胰腺癌組織中CCDC168基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的試劑盒。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種檢測胰腺癌的分子標記物，所述標記物為CCDC168或其表達蛋白。優(yōu)選地，所述的mRNACCDC168或其表達蛋白在胰腺癌組織中表達下調(diào)。優(yōu)選地，所述的CCDC168基因啟動子區(qū)在胰腺癌組織中處于甲基化狀態(tài)。進一步地，本發(fā)明提供了CCDC168或其表達蛋白在制備檢測胰腺癌試劑中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述檢測試劑包括用熒光定量PCR方法、基因芯片或免疫方法檢測CCDC168的表達水平；所述檢測試劑還包括用MS-PCR方法檢測CCDC168基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。優(yōu)選地，所述的熒光定量PCR方法包括特異擴增CCDC168的引物對；所述引物包括上游引物和下游引物，上游引物為SEQIDNO:1，下游引物為SEQIDNO:2。優(yōu)選的，所述基因芯片包括固相載體以及固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括特異性地對應(yīng)于CCDC168核苷酸的部分或全部序列。優(yōu)選的，所述免疫方法為ELISA和/或膠體金檢測方法。所述ELISA法為使用ELISA檢測試劑盒，所述的試劑盒包括：包括CCDC168克隆抗體的固相載體，酶標抗體，酶的底物，蛋白標準品，陰性對照品，稀釋液，洗滌液，酶反應(yīng)終止液等。所述膠體金法為使用檢測試劑盒，所述的抗體可采用市售的CCDC168單克隆抗體，也可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來獲得。例如，制備保留整個或部分靶蛋白質(zhì)的多肽或整合編碼它們的多核苷酸的哺乳動物細胞表達載體作為抗原。使用抗原免疫動物后，從經(jīng)過免疫的動物獲得免疫細胞并融合骨髓瘤細胞以獲得雜交瘤。然后從雜交瘤培養(yǎng)物收集抗體。最后可以通過使用被用作抗原的CCDC168蛋白或其部分對獲得的抗體實施抗原特異性純化來獲得針對CCDC168蛋白的單克隆抗體。進一步，所述的膠體金檢測試劑盒采用膠體金免疫層析技術(shù)或膠體金滲濾法。進一步，所述的膠體金檢測試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)(T)噴點有抗CCDC168單克隆抗體、質(zhì)控區(qū)(C)噴點有免疫球蛋白IgG。進一步地，本發(fā)明提供了一種用于檢測胰腺癌組織細胞中CCDC168基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的引物組，所述引物組包括甲基化引物對和非甲基化引物對；所述甲基化引物對包括上游引物如SEQIDNO:5所示和下游引物如SEQIDNO:6所示；所述非甲基化引物對的上游引物核苷酸序列如SEQIDNO:7所示，下游引物如SEQIDNO:8所示。進一步地，本發(fā)明提供了一種檢測胰腺癌組織細胞中CCDC168基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的試劑盒，所述試劑盒包含上述的引物組。優(yōu)選地，所述試劑盒包含甲基化陽性對照PCR模板，該模板為硫化修飾后的CCDC168基因啟動子區(qū)100％甲基化的胰腺癌細胞DNA。優(yōu)選地，所述試劑盒還包含非甲基化陽性對照PCR模板，該模板為硫化修飾后的CCDC168基因啟動子區(qū)100％非甲基化的正常胰腺細胞DNA。優(yōu)選地，所述試劑盒還包含10×MSPbuffer緩沖液，20mMdNTP，hotstartaq酶，去離子水。本發(fā)明還提供一種檢測CCDC168基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的方法，以此來對胰腺癌進行早期診斷、療效判定等，包括如下步驟：首先，利用甲基化引物對，以硫化修飾后的DNA為模板進行MS-PCR擴增；然后，根據(jù)擴增產(chǎn)物判斷甲基化狀態(tài)。優(yōu)選地，同時利用甲基化引物對和非甲基化引物對，以硫化修飾后的DNA為模板進行MS-PCR擴增；根據(jù)甲基化引物以及非甲基化引物的擴增產(chǎn)物，判斷甲基化狀態(tài)。用甲基化引物進行擴增，有擴增產(chǎn)物，而用非甲基化引物進行擴增則無擴增產(chǎn)物為完全甲基化；用甲基化及非甲基化引物進行擴增，均有擴增產(chǎn)物，為部分甲基化；用非甲基化引物進行擴增，有擴增產(chǎn)物，用甲基化引物進行擴增，無擴增產(chǎn)物，為無甲基化。部分甲基化及完全甲基化均判定為甲基化。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種檢測胰腺癌的分子標記物CCDC168，并進一步證實在胰腺癌組織中CCDC168基因啟動子區(qū)處于甲基化狀態(tài)。應(yīng)用本發(fā)明試劑盒來檢測CCDC168基因啟動子區(qū)高甲基化狀態(tài)可作為胰腺癌的診斷、療效觀察、預(yù)后判斷等的有力手段，而且，操作簡便、穩(wěn)定性好，具有深遠的臨床意義和推廣價值。附圖說明圖1TCGA中數(shù)據(jù)庫中胰腺癌組織及癌旁組織CCDC168cDNA表達情況；圖2胰腺癌組織及癌旁組織CCDC168cDNA表達情況。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用的試劑可以商業(yè)購買得到。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常為本領(lǐng)域常規(guī)方法，如按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆，實驗手冊(第三版)(科學出版社，2002)中的所述條件，或按照試劑制造廠家所建議的條件。本發(fā)明基于TCGA數(shù)據(jù)庫信息中160個胰腺癌患者的數(shù)據(jù)進行胰腺癌的生存分析篩選相關(guān)基因，篩選得到與生存時間相關(guān)CCDC168，通過單因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)CCDC168為保護性因素。運用SPSS統(tǒng)計學分析法，分析TCGA中160例胰腺癌病人和10例癌旁組織的CCDC168表達差異，發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織CCDC168表達顯著低于癌旁組織。本發(fā)明所述的基因是在本發(fā)明之前的已知基因，均來源于人類基因組。Genebank登錄號：CCDC168：GeneID:643677。進一步本發(fā)明通過實時定量PCR驗證CCDC168在胰腺癌組織中表達下調(diào)。進一步本發(fā)明通過甲基化特異性PCR法(MS-PCR)對胰腺癌組織及癌旁正常組織進行檢測，發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中CCDC168基因啟動子區(qū)處于甲基化狀態(tài)。實施例1基于TCGA數(shù)據(jù)庫信息進行胰腺癌的生存分析篩選相關(guān)基因1、臨床信息篩選檢索TCGA數(shù)據(jù)庫中的胰腺癌患者臨床信息，截至2015年12月10日，TCGA數(shù)據(jù)庫中總共記載了185例胰腺癌臨床病例。對這些數(shù)據(jù)進行篩選，共有160例患者納入研究。篩選時排除具有其他惡性腫瘤病史、曾接受過放療或化療的患者，同時納入研究的患者需含臨床信息和mRNA數(shù)據(jù)。2、生存期研究樣本統(tǒng)計160例胰腺癌患者生存時間的統(tǒng)計結(jié)果如下表所示:表1160例胰腺癌患者生存時間統(tǒng)計生存期時間t(年)期初進入研究人數(shù)期內(nèi)死亡人數(shù)期內(nèi)失訪人數(shù)t<116027741≤t<25922152≤t<3221023≤t<410224≤t<56015≤t5413、mRNA表達數(shù)據(jù)生存分析研究方案(1)對胰腺癌高通量mRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)檢索、數(shù)據(jù)下載及樣本挑選和歸類。由下載的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)通過生物信息學分析篩選得出與胰腺癌生存時間相關(guān)的mRNA。(2)用Cytoscape軟件構(gòu)建由mRNAs組成的生物信息網(wǎng)絡(luò)，通過DAVID對生物信息網(wǎng)絡(luò)中與胰腺癌生存時間相關(guān)的mRNA進行GO分析和Pathway分析。4、胰腺癌mRNA表達數(shù)據(jù)的生存分析結(jié)果將胰腺癌組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載后，去除readcount＝0小于20％的mRNA后用做下一步分析，包括17100個mRNA。提取mRNA基因表達量和胰腺癌TCGA數(shù)據(jù)庫生存時間數(shù)據(jù)，采用survival包的coxph函數(shù)完成，經(jīng)單因素Cox回歸分析，篩選得到單因素Cox回歸中p值<0.05的mRNA有580個，包括328個風險性mRNA和252個保護性mRNA。Coef值是回歸系數(shù)，HR＞1為風險性因素，HR＜1為保護性因素。為了更好的研究與生存時間相關(guān)的mRNA的功能，我們通過GORILLA和GeneCodis軟件對胰腺癌生存時間相關(guān)的mRNA進行GO功能富集和KEGG通路富集，篩選標準皆為FDR<0.05。其中CCDC168的p值為0.019414，HR<1，均為胰腺癌保護性mRNA。運用SPSS統(tǒng)計學分析法，分析TCGA中160例胰腺癌病人和10例癌旁組織的CCDC168表達差異，發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織CCDC168表達顯著低于癌旁組織，P<0.05認為在統(tǒng)計學上有顯著性差異，具體情況見圖1。實施例2RT-PCR驗證胰腺癌組織及癌旁組織CCDC168表達情況1、材料收集經(jīng)外科手術(shù)切除、并經(jīng)病理學檢查確診的45例胰腺癌患者組織及20癌旁組織標本，癌旁組織定義為距腫瘤邊緣3cm以外的胰腺組織。取樣來源于北京協(xié)和醫(yī)院2010年10月到2015年12月期間確診為胰腺癌并接受外科術(shù)切除的病人。手術(shù)切除胰腺癌組織后在病理科醫(yī)生的指導下立即取胰腺癌及癌旁組織放入液氮，編號后置-80℃低溫冰箱保存。2、方法2.1對組織樣本進行總RNA提取依據(jù)編號分別對45例胰腺癌組織及20例癌旁組織進行總RNA提取，采用Reagent(invitrogen，貨號15596-018)進行樣本RNA提取，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行，具體操作如下：收集樣本后凍存于液氮，取出后把組織放入已預(yù)冷的研缽中進行研磨，待組織樣本成粉末狀后：①加入Trizol，室溫保存5分鐘；②加氯仿0.2mL，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5分鐘-10分鐘；③12000rpm高速離心15分鐘后吸取上層水相(吸70％)到另一新離心管管中，注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì)。移入新管，加入等體積的-20℃預(yù)冷異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上10分鐘；④12000rpm高速離15分鐘后小心棄掉上清液，按1mL/mLTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振蕩混合，4℃下12000rpm高速離心5分鐘；⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5分鐘以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過的水溶解沉淀；⑥用Nanodrop2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，凍存于-80℃。RNA質(zhì)量判定標準：RNA樣本的OD260/OD280值為1.7-2.2之間；總RNA電泳圖譜有清晰的28S、18S條帶；70℃水浴保溫1小時后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無明顯差異。2.2RNA樣品的質(zhì)量分析RNA提取后瓊脂糖凝膠電泳，從電泳結(jié)果可以初步判定提取的RNA樣品質(zhì)量合格與否。進而通過NanoDrop1000分光光度計檢測RNA樣品要求：OD260/OD280為1.8-2.2。2.3逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA采用IIIReverseTranscriptase(invitrogen，貨號18080-044)進行cDNA反轉(zhuǎn)錄，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行，具體操作如下：使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對lμg總RNA進行逆反錄合成cDNA。采用25μL反應(yīng)體系，每個樣品取1μg總RNA作為模板RNA。將獲得的cDNA樣品稀釋10倍后保存在-20℃冰箱備用。2.4Real-TimePCR2.4.1儀器及分析方法用ABI7500型熒光定量PCR儀，采用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)相對定量分析。2.4.2引物設(shè)計采用在線引物設(shè)計軟件，基因序列參照NCBI:NM_001146197.1(CCDC168)，內(nèi)參選GAPDH，引物設(shè)計后由invitrogen公司合成。具體引物序列如下：表2引物序列操作過程如下：表3RealTime反應(yīng)體系組分加入量2×mix10μL上游引物(10uM)0.5μL下游引物(10uM)0.5μL模板2μL加入滅菌蒸餾水至25μL(一)反應(yīng)體系：用PowerGreenPCRMasterMix(invitrogen，貨號4367659)進行擴增，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行。擴增程序為：95℃5min，(95℃15sec，60℃45sec)×35個循環(huán)。(二)引物篩選將各樣本cDNA混合后，以此為模板進行5倍梯度稀釋，稀釋后樣品各取2μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進行擴增，同時在60-95℃進行融解曲線分析，根據(jù)擴增效率高和溶解曲線單峰原則進行引物篩選。(三)樣品RealTime-PCR檢測將各樣品cDNA10倍稀釋后取2μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進行擴增。同時在60-95℃進行溶解曲線分析。3、實驗結(jié)果實時定量PCR擴增曲線拐點清楚，擴增曲線整體平行性好，表明各反應(yīng)管的擴增效率相近，極限平而無上揚現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說明擴增效率較高；樣本擴增產(chǎn)物溶解曲線都是單峰，說明擴增產(chǎn)物只有一條，為特異性擴增；根據(jù)qRT-PCR的相對定量公式：2-ΔΔCt×100％，比較CCDC168在胰腺癌組織和癌旁組織中的表達水平。結(jié)果顯示：qRT-PCR擴增結(jié)果穩(wěn)定，其中CCDC168在胰腺癌患組織中的表達水平為癌旁組織的54％，具體情況見圖2。以上結(jié)果驗證了TCGA數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析CCDC168在胰腺癌患者中表達下調(diào)的結(jié)果。實施例3檢測CCDC168啟動子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)為了探索CCDC168低表達的機制，采用甲基化特異性PCR法(MSP)檢測胰腺癌組織和癌旁組織CCDC168啟動子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)。1、材料實施例2中的45例胰腺癌組織和20例癌旁正常組織。2、實驗方法2.1基因組DNA的提取及硫化修飾過程應(yīng)用常規(guī)酚-氯仿抽提的方法分別提取基因組DNA，紫外分光光度儀測定吸光度(A)值確定其含量及純度。亞硫酸鹽修飾：參考《J.G.Herman，J.R.Graff，S.Myohanen，B.D.NelkinandS.B.Baylin，Methylation-specificPCR：anovelPCRassayformethylationstatusofCpGislands，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(1996)，9821-9826.》文獻的MSP方法：取上述制備的基因組DNA，經(jīng)稀釋后精確取2ugDNA，加去離子水至終體積50μL，加入新鮮配制的3M的NaOH5μL，37℃孵育25min。之后加入新鮮配制的10mM的氫醌30μL及3M亞硫酸氫鈉520μL混合均勻(其內(nèi)已加入新鮮配制的3M的NaOH，計算方法：10mL3M亞硫酸氫鈉中加入3M的NaOH740μL)，50℃孵育16h，此后應(yīng)用DNA純化試劑盒(Promega公司產(chǎn)品)純化并回收DNA，應(yīng)用50μL去離子水洗脫DNA，向其內(nèi)加入5μL3M的NaOH以終止硫化修飾，用3倍體積的無水乙醇沉淀DNA，最終硫化修飾后的DNA重新溶解在20μL去離子水中，得到DNA模板，立即使用或-20℃保存?zhèn)溆谩?.2MS-PCR擴增以甲基化引物進行擴增的PCR反應(yīng)體系，以總體積25μL計，包括如下：表4甲基化反應(yīng)體系上游引物SEQIDNO:5：(5'GTGTTTTAGTTTTTTGAGTAGTCGG3')；下游引物SEQIDNO:6：(5'GAATCACTTAAAATTAAAAATTCGAA3')。以非甲基化引物進行擴增的PCR反應(yīng)體系，以總體積25μL計，包括：與甲基化引物進行擴增的PCR反應(yīng)體系所不同的是：引物不同，在該體系中為非甲基化引物(50pmol/μL)：上游引物SEQIDNO:7：(5'GTGTTTTAGTTTTTTGAGTAGTTGG3')；下游引物SEQIDNO:8：(5'AAATCACTTAAAATTAAAAATTCAAA3')。其余均與甲基化引物進行擴增的PCR反應(yīng)體系中的相同。應(yīng)用上述MSP反應(yīng)體系對已制備的DNA模板(45個胰腺癌組織樣本PC1～PC45，20個正常癌旁組織樣本PN1～PN20)分別進行擴增，并以ddH2O作為陰性對照，擴增程序為：95℃預(yù)變性5min，在95℃下變性30s，甲基化引物在57℃下退火30s，非甲基化引物在55℃退火30s，72℃下延伸40s，共35個循環(huán)，之后，繼續(xù)在72℃下延伸7min。PCR產(chǎn)物進行2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射分析儀檢測并照相。2.3結(jié)果判斷判斷標準如下：(1)應(yīng)用甲基化引物進行擴增，有擴增產(chǎn)物，并且應(yīng)用非甲基化引物進行擴增，無擴增產(chǎn)物的樣本則判讀為完全甲基化結(jié)果；(2)應(yīng)用甲基化引物及非甲基化引物進行擴增，均有擴增產(chǎn)物的樣本判讀為部分甲基化結(jié)果；(3)應(yīng)用非甲基化引物進行擴增，有擴增產(chǎn)物，并且用甲基化引物進行擴增，無擴增產(chǎn)物的樣本則判讀為非甲基化結(jié)果。(4)部分甲基化及完全甲基化的樣本均判讀為甲基化結(jié)果。數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件統(tǒng)計與分析，計數(shù)資料采用(例，％)表示，采用卡方檢驗。結(jié)果以P<0.05表示具有統(tǒng)計學意義。3、結(jié)果經(jīng)檢測后，20例癌旁正常胰腺組織中未檢測到CCDC168基因啟動子甲基化；在45例胰腺癌組織中，發(fā)現(xiàn)CCDC168基因啟動子均檢測到甲基化，兩組之間具有統(tǒng)計學意義(X2＝65.00，P<0.0001)。實施例4檢測胰腺癌組織的試劑盒組成檢測胰腺癌組織的試劑盒包括以下成分，其中，進行1次MS-PCR的用量為：1、濃度為50pmol/μL的甲基化引物：上游引物為SEQIDNO:5，下游引物為SEQIDNO:6，各為0.5μL。2、濃度為50pmol/μL的非甲基化引物：上游引物為SEQIDNO:7，下游引物為SEQIDNO:8，各為0.5μL。3、反應(yīng)液2份，分別配合甲基化引物和非甲基化引物試用，每份反應(yīng)體系包括：(1)10xMSPbuffer(緩沖液):2.5μL；(2)20mMdNTP：1.25μL；(3)Hotstarttaq酶：0.15μL；(4)ddH2O：18.1μL。一個試劑盒可以包括上述各成分進行多次MS-PCR的用量，如25次、50次、100次等，各成分的具體量視情況需要而定。試劑盒還包括：(1)陽性對照PCR模板：硫化修飾后的CCDC168基因啟動子區(qū)為100％甲基化的胰腺癌組織DNA，進行1次MSP的用量為：2μL。(2)陰性對照PCR模板：硫化修飾后的CCDC168基因啟動子區(qū)為100％非甲基化的正常胰腺組織DNA，進行1次MSP的用量為：2μL。(3)雙陰性的體系對照：ddH2O，用以評估體系是否存在PCR產(chǎn)物的污染，如ddH2O檢測的結(jié)果為雙陰性，則體系結(jié)果可信。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。序列表<110>北京致成生物醫(yī)學科技有限公司<120>CCDC168作為標記物在檢測胰腺癌試劑中的應(yīng)用<130>p16yxa77<160>8<170>PatentInversion3.5<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1tgagagcaaagccagcaact20<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2acacaatgttggtcctcaccta22<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3ggagcgagatccctccaaaat21<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>4ggctgttgtcatacttctcatgg23<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>5gtgttttagttttttgagtagtcgg25<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>6gaatcacttaaaattaaaaattcgaa26<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>7gtgttttagttttttgagtagttgg25<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>8aaatcacttaaaattaaaaattcaaa26當前第1頁1 2 3