本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于抗癲癇藥嚴(yán)重皮膚過敏反應(yīng)的PCR檢測引物、試劑盒及檢測方法。

背景技術(shù)：

藥物超敏是一種嚴(yán)重的藥物不良反應(yīng)。在臨床上口服藥物超敏反應(yīng)由于沒有合適的測定方法，常常只能根據(jù)病人超敏反應(yīng)后而做治療處理。抗癲癇藥拉莫三嗪和卡馬西平(CBZ)在臨床上嚴(yán)重皮膚過敏反應(yīng)可表現(xiàn)為史蒂文斯-約翰遜綜合征（ Stevens-Johnson syndrome, SJS）和中毒性表皮壞死癥（Toxic epidermal necrolysis, TEN）。SJS 和TEN均屬于重癥藥疹?；颊呖沙霈F(xiàn)高熱、嚴(yán)重粘膜糜爛、重要臟器受損，發(fā)展迅速，常因繼發(fā)感染、水電解質(zhì)紊亂、腎功能衰竭及其他并發(fā)癥而很快死亡，死亡率達(dá)30-40%。

中國臺灣漢族人CBZ 超敏病人引起SJS和TEN的基因標(biāo)記物是人類白細(xì)胞抗原HLA-B*1502。并且漢族人卡馬西平超敏病人引起的SJS與HLA-B*1502基因是緊密相關(guān)的。

發(fā)明人實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)2009年公布的檢測抗癲癇藥物過敏反應(yīng)相關(guān)抗原基因型的試劑及臨床應(yīng)用的專利存在一些不足（CN101353698A）。（此專利中報(bào)道此方法可用于中國或亞裔人種中癲癇患者在服用卡馬西平等抗癲癇藥物之前，通過HLA-B*1502基因型檢測，如病人有此基因型可以預(yù)測用此類藥物后肯定會出現(xiàn)嚴(yán)重皮膚反應(yīng)而避免使用此類卡馬西平等抗癲癇藥物引起的皮膚過敏反應(yīng)。并具有準(zhǔn)確率高的特點(diǎn)。此專利使用PCR-SSP方法檢測HLA-B*1502，用4對引物和2對內(nèi)參）。發(fā)明人使用此專利的引物及條件總共對138例過敏及對照病人樣品進(jìn)行了HLA-B*1502的檢測, 有數(shù)十例病例重復(fù)數(shù)次進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此專利有以下不足：1）PCR條件不合適。按照專利PCR條件（94℃, 60S, 一個循環(huán)，94℃，30S,56℃, 30S, 72℃, 45S, 30個循環(huán)）陽性樣品在使用引物1，引物3擴(kuò)增時沒有條帶出現(xiàn)。發(fā)明人在測定樣品時還參考并采用其專利作者在中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志（高玫梅等，2009）的PCR條件（96℃, 60S, 一個循環(huán)，96℃，30S,62℃, 45S,72℃, 45S, 4個循環(huán)。96℃，10S,58℃, 45S, 72℃, 45S, 35個循環(huán)，96℃，10S,55℃, 50S, 72℃, 90S, 9個循環(huán)）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3對引物中引物3的PCR沒有結(jié)果，發(fā)明人對引物3設(shè)計(jì)新的PCR條件（94℃, 5’, 一個循環(huán)，94℃，1’30”,58℃, 45S,72℃, 45S, 35個循環(huán)）結(jié)果引物3產(chǎn)物大小沒有在488 而在637。 2）此專利試劑盒不能進(jìn)行準(zhǔn)確的結(jié)果測定。綜合專利的引物及文章的PCR條件和發(fā)明人設(shè)計(jì)的PCR條件，并根據(jù)專利的描述全部6個條帶出現(xiàn)應(yīng)為HLA-B*1502基因攜帶者，通過對138例樣品檢測有6個樣品符合上述要求，應(yīng)為HLA-B*1502基因攜帶者, 為了證實(shí)是否為HLA-B*1502基因攜帶者, 發(fā)明人對這6個樣品同時還進(jìn)行了高分序列測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅1例為HLA-B*1502基因攜帶者，準(zhǔn)確率為16.6%（1/6），說明此方法不能準(zhǔn)確的作為抗癲癇藥嚴(yán)重皮膚過敏時的判斷而只能作為初步的判斷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的主要是提供一種用于抗癲癇藥嚴(yán)重皮膚過敏反應(yīng)的PCR檢測引物、試劑盒及檢測方法。

本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種用于抗癲癇藥嚴(yán)重皮膚過敏反應(yīng)的PCR檢測引物，引物序列如序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

進(jìn)一步地，引物序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8為四對序列特異性引物，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10為內(nèi)參引物，適用于以人的外周血提取的基因組DNA為模塊進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

一種用于抗癲癇藥嚴(yán)重皮膚過敏反應(yīng)的試劑盒，包括PCR MIX和PCR引物；所述PCR引物序列如序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

進(jìn)一步地，引物序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8為四對序列特異性引物，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10為內(nèi)參引物，適用于以人的外周血提取的基因組DNA為模塊進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

一種用于抗癲癇藥嚴(yán)重皮膚過敏反應(yīng)的檢測方法，包括以下步驟：

（1）設(shè)計(jì)如序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的引物；采用三對特異引物P1，R1，P2，R2，P3，R3，P4和R4擴(kuò)增HLA-B*1502基因的第2，3號外顯子，用內(nèi)參引物C擴(kuò)增HLA-DRB1的3號內(nèi)含子；

（2）以人外周血提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

（3）采用2%凝膠電泳檢測，當(dāng)被檢測的所有樣本均出現(xiàn)內(nèi)參C的特異性目的片段時，表明擴(kuò)增反應(yīng)有效；當(dāng)反應(yīng)引物P1，R1，P2，R2，P3，R3，P4和R4的特異性目的片段都出現(xiàn)時，表明病人樣本的基因型為HLA-B*1502；

其中，引物P1的序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，引物R1的序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，引物P2的序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，引物R2的序列如序列表中SEQ ID NO.4所示，引物P3的序列如序列表中SEQ ID NO.5所示，引物R3的序列如序列表中SEQ ID NO.6所示，引物P4的序列如序列表中SEQ ID NO.7所示，引物R4的序列如序列表中SEQ ID NO.8所示，引物C的序列如序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

進(jìn)一步地，步驟（2）中PCR反應(yīng)條件為：95℃，5min，一個循環(huán)，95℃，30s，60℃，30s，72℃，30s，35個循環(huán)。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

本發(fā)明通過PCR-SSP技術(shù)檢測抗癲癇藥物嚴(yán)重皮膚過敏反應(yīng)相關(guān)基因型的方法，方法特異性高，通過設(shè)計(jì)4對特異性引物擴(kuò)增HLA-B基因的第二，第三號外顯子，從而對癲癇患者是否具有HLA-B*1502進(jìn)行的檢測，預(yù)防嚴(yán)重皮膚不良反應(yīng)的發(fā)生。具有操作簡單，準(zhǔn)確率高，成本低的特點(diǎn)。適用于中國和亞洲人種患者服用卡馬西平等抗癲癇藥之前，通過進(jìn)行HLA-B*1502基因的檢測，確認(rèn)是否可使用卡馬西平等芳香類抗癲癇藥物。

附圖說明

圖1為本發(fā)明電泳凝膠成像圖一。

圖2為本發(fā)明電泳凝膠成像圖二。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此。

實(shí)施例

1、模板：使用抗癲癇藥物患者的全血基因組DNA。

2、主要試劑：PCR MIX，PCR buffer。

3、引物及擴(kuò)展的片段

本實(shí)施例中，針對HLA-B*1502基因的2，3號外顯子設(shè)計(jì)四對序列特異性引物：P1，R1；P2，R2；P3，R3；P4，R4；序列分別如序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；內(nèi)參引物C擴(kuò)增HLA-DRB1的3號內(nèi)含子，序列如序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

4、PCR反應(yīng)體系和程序

25μL PCR反應(yīng)體系如下：基因組DNA：10-50ng，PCR MIX 12.5μL，加雙蒸餾水至25μL。PCR反應(yīng)程序：95℃，5min，一個循環(huán)，95℃，30s，60℃，30s，72℃，30s，35個循環(huán)。

5、檢測結(jié)果

采用2.0%的凝膠電泳檢測，電泳時間為40分鐘，電壓為150伏。本次檢測是采用本申請的四對引物（P1、P2、P3、P4）和一對內(nèi)參（PC）對6個樣品進(jìn)行測定后的結(jié)果。具體檢測結(jié)果如圖1所示。其中，樣品1：CBZ用藥無過敏；樣品2～4：對照，樣品5、6：CBZ過敏的HLA-B*1502基因攜帶者樣品。其檢測結(jié)果與實(shí)際情況相符。值得說明的是，圖1中內(nèi)參對第六個樣品測定的結(jié)果在P4測定結(jié)果的右邊（單獨(dú)標(biāo)記6所對應(yīng)的電泳凝膠成像圖）。

另外，本發(fā)明還可以將內(nèi)參引物C與四對特異性引物混合后進(jìn)行PCR檢測，同樣采用2.0%的凝膠電泳檢測，電泳時間為40分鐘，電壓為150伏。這次檢測同樣是對6個樣品進(jìn)行測定，其結(jié)果如圖2所示。其中，樣品1～3：HLA-B*1502攜帶者，樣品4～6：非HLA-B*1502攜帶者。其檢測結(jié)果與實(shí)際情況相符。

按照上述實(shí)施例，便可很好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。值得說明的是，基于上述設(shè)計(jì)的前提下，為解決同樣的技術(shù)問題，即使在本發(fā)明上做出的一些無實(shí)質(zhì)性的改動或潤色，所采用的技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)仍然與本發(fā)明一樣，故其也應(yīng)當(dāng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川精準(zhǔn)醫(yī)療科技有限責(zé)任公司

<120> 用于抗癲癇藥嚴(yán)重皮膚過敏反應(yīng)的PCR檢測引物、試劑盒及檢測方法

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P1

<400> 1

cgcgagtccg aggatggc 18

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> R1

<400> 2

gcgcaggttc cgcaggc 17

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<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P2

<400> 3

accggaacac acagatctc 19

<210> 4

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<212> DNA

<213> Artificial

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<223> R2

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cgtaggcgga ctggtcata 19

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<212> DNA

<213> Artificial

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cgcgagtccg aggatggc 18

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<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

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<400> 6

gccatacatc ctctggatga 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> P4

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cgcgagtccg aggatggc 18

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<213> Artificial

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tccttcccgt tctccaggta 20

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<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> C-P

<400> 9

actgacaccg acagtcctt 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> C-R

<400> 10

gctgtgtcct ggcaatggt 19