本專利申請是申請?zhí)枮?014106745446的發(fā)明專利申請的分案申請，2014106745446號專利申請的申請日為2014年11月21日，其發(fā)明名稱為：元寶草中具有抗腫瘤和抗hiv活性的化合物及分離制備和用途。本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
：，涉及化合物1-30的分離制備方法及用途。具體涉及分離純化過程，結(jié)構(gòu)確證，抗腫瘤細(xì)胞增殖作用和抗艾滋病毒活性等。
背景技術(shù)：
：：元寶草為藤黃科(guttiferae)金絲桃屬(hypericum)植物元寶草(hypericumsampsoniihance)，別名對葉草、合掌草、葉抱枝、穿心草等。該植物為多年生草本，高約0.2–0.8米，全體無毛。莖單一或少數(shù)，圓柱形，無腺點(diǎn)，上部分枝。葉對生，無柄，其基部完全合生為一體而莖貫穿其中心?；ㄖ睆?–15毫米，花梗長約2–3毫米。蒴果寬卵珠形至或?qū)捇颡M的卵珠狀圓錐形，長6–9毫米，寬4–5毫米，散布有卵珠狀黃褐色囊狀腺體。種子黃褐色，長卵柱形，長約1毫米，兩側(cè)無龍骨狀突起，頂端無附屬物，表面有明顯的細(xì)蜂窩紋?；ㄆ?–6月，果期7–8月。元寶草在我國分布廣泛，產(chǎn)于陜西至江南各省。一般生于路旁、山坡、草地、灌叢、田邊、溝邊等處，海拔0–1200米。日本、越南(北部)、緬甸(東部)、印度(東北部)也有分布，但是較少。作為傳統(tǒng)中草藥，民間以元寶草全草入藥，該藥具有涼血止血、清熱解毒、活血調(diào)經(jīng)、祛風(fēng)通絡(luò)的作用。可用于治療吐血、咯血、創(chuàng)傷出血、腸炎、痢疾、乳癰、癰腫疔毒、燙傷、蛇咬傷、月經(jīng)不調(diào)、風(fēng)濕痹痛等。研究人員對該植物化學(xué)成分進(jìn)行了較為細(xì)致的研究，這些研究結(jié)果表明，元寶草化學(xué)成分主要包括多環(huán)多異戊烯基間苯三酚衍生物(ppaps)、二蒽酮、口山酮、黃酮和二苯甲酮類化合物，此外還有植物甾醇、苯甲酸、咖啡酸、揮發(fā)油等。在這些已經(jīng)分離鑒定的化合物中，包括了近四十個(gè)ppaps，是元寶草主要的化學(xué)成分。對這些化合物的活性研究表明，他們具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等多種藥理作用。近年來，癌癥和艾滋病患者的不斷增加，已成為威脅動物和人類生命安全的最主要的原因。尋找安全有效的治療癌癥和艾滋病毒的藥物是天然產(chǎn)物的研究熱點(diǎn)之一，因此，從藤黃科金絲桃屬植物元寶草中尋找具有抗腫瘤和抗艾滋病毒的新的天然產(chǎn)物具有非常重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供具有抗腫瘤和抗艾滋病毒活性的新的間苯三酚類化合物的來源以及分離純化方法及其潛在應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明的間苯三酚類化合物，其結(jié)構(gòu)式如式(1)；本發(fā)明人通過對藤黃科金絲桃屬植物元寶草的乙醇提取物進(jìn)行分離純化，得到30個(gè)新化合物。運(yùn)用多種波譜分析方法和其他手段，確定其結(jié)構(gòu)為間苯三酚類化合物，具體結(jié)構(gòu)如式(1)所示。通過對所有新化合物的抗腫瘤活性評價(jià)，發(fā)現(xiàn)化合物16-20對白血病細(xì)胞hl-60，人肝癌細(xì)胞smmc-7721，人肺癌細(xì)胞a-549，人乳腺癌細(xì)胞mcf-7，人結(jié)腸癌細(xì)胞sw480中的部分細(xì)胞表現(xiàn)出良好的活性，可以作為治療抗腫瘤細(xì)胞藥物開發(fā)的先導(dǎo)化合物。通過對化合物1和2的抗艾滋病毒活性測試，發(fā)現(xiàn)化合物1和2對hiv-1(lai)毒株表現(xiàn)出良好的抑制活性，可以作為治療艾滋病毒的先導(dǎo)化合物進(jìn)行開發(fā)。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供式(1)中所示化合物1-30在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供式(1)中所示化合物1和2在制備抗艾滋病毒藥物的應(yīng)用。附圖說明圖1：化合物13的實(shí)驗(yàn)ecd和計(jì)算ecd對比圖；圖2：化合物13及16-20的ecd對比圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：新化合物16-20的制備和結(jié)構(gòu)鑒定。(一)如式(1)所示化合物16-20的制備1.提取分離干燥的元寶草地上部分，切碎后用多功能提取罐用95％乙醇提取，每次100升左右于45℃下提取10小時(shí)，重復(fù)提取4次，減壓回收溶劑得總浸膏。將總浸膏懸浮于水中，依次用石油醚和氯仿萃取得到石油醚部位和氯仿部位。石油醚部位進(jìn)行硅膠柱層析(100-200目，5kg)，石油醚：丙酮梯度洗脫(100:0→0:100)，用tlc檢測合并類似部分，得到6個(gè)組分。部分ⅲ以硅膠劃段，之后反復(fù)交替使用硅膠、ods、sephadexlh-20和反相hplc純化得到化合物16。部分ⅳ以硅膠劃段，之后反復(fù)交替使用硅膠、ods、sephadexlh-20和反相hplc純化得到化合物17-18。部分ⅴ以ods劃段，之后反復(fù)交替使用硅膠、ods、sephadexlh-20和反相hplc純化得到化合物19。氯仿部位進(jìn)行硅膠柱層析(100–200目，6kg)，石油醚：丙酮梯度洗脫(100:0→0:100)，用tlc檢測合并類似部分，得到6個(gè)組分(ⅰ–ⅵ)，部分ⅱ用硅膠劃段，之后反復(fù)交替使用硅膠、ods、sephadexlh-20和反相hplc純化得到化合物20。如式1所示化合物16-20結(jié)構(gòu)鑒定對化合物16-20進(jìn)行質(zhì)譜，紫外光譜，紅外光譜，旋光，核磁共振(見表1和表2)，圓二色譜和計(jì)算圓二色譜等數(shù)據(jù)測試，從而確定化合物的結(jié)構(gòu)?；衔?6:colorlessoil,uv(ch3oh)λmax(logε)＝204(4.22),248(3.95),and275(3.88)nm；irνmax＝3421,1722,1696,and1626cm–1；for1hnmr(400mhz)and13cnmr(100mhz)dataseetables1and2；hresims[m+na]+m/z641.3431(calcdc38h50o7nafor641.3454).化合物16絕對構(gòu)型的確定是通過計(jì)算ecd和比較ecd來確定的，如圖1和圖2所示?；衔?7:colorlessoil,uv(ch3oh)λmax(logε)＝205(4.01),247(3.73),and277(3.65)nm；irνmax＝3454,1728,1697,and1626cm–1；for1hnmr(400mhz)and13cnmr(100mhz)dataseetables1and2；hresims[m+na]+m/z641.3431(calcdc38h50o7nafor641.3454).化合物17的絕對構(gòu)型是通過與化合物13的ecd對比來確定的，如圖1和圖2所示。化合物18:colorlessoil,uv(ch3oh)λmax(logε)＝205(4.46),248(4.17),and277(4.15)nm；irνmax＝3518,1728,1698,and1627cm–1；for1hnmr(400mhz)and13cnmr(100mhz)dataseetables1and2；hresims[m+na]+m/z641.3429(calcdc38h50o7nafor641.3454).化合物18的絕對構(gòu)型是通過與化合物13的ecd對比來確定的，如圖1和圖2所示?；衔?9:colorlessoil,uv(ch3oh)λmax(logε)＝203(4.25),247(4.00),and274(3.88)nm；irνmax＝3419,1734,and1700cm–1；for1hnmr(400mhz)and13cnmr(100mhz)dataseetable1and2；hresims[m+na]+m/z657.3380(calcdc38h50o8nafor657.3403).化合物19的絕對構(gòu)型是通過與化合物13的ecd對比來確定的，如圖1和圖2所示?；衔?0:colorlessoil,uv(ch3oh)λmax(logε)＝203(4.39),248(4.04),and277(3.95)nm；irνmax＝3423,1728,1697,and1626cm–1；for1hnmr(400mhz)and13cnmr(100mhz)dataseetables1and2；hresims[m+na]+m/z657.3383(calcdc38h50o8nafor657.3403).化合物20的絕對構(gòu)型是通過與化合物13的ecd對比來確定的，如圖1和圖2所示。實(shí)施例2：化合物16-20對白血病細(xì)胞hl-60，人肝癌細(xì)胞smmc-7721，人肺癌細(xì)胞a-549，人乳腺癌細(xì)胞mcf-7，人結(jié)腸癌細(xì)胞sw480活性細(xì)胞的抑制活性。化合物16-20的抗腫瘤活性通過mts法對白血病細(xì)胞hl-60，人肝癌細(xì)胞smmc-7721，人肺癌細(xì)胞a-549，人乳腺癌細(xì)胞mcf-7，人結(jié)腸癌細(xì)胞sw480五種人體腫瘤細(xì)胞進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果如表3所示：實(shí)施例3：化合物1和2對hiv-1型的抑制活性。選用hiv-1(lai)毒株，采用elisa檢測hiv核心蛋白p24抗原的方法，齊多夫定(azt)為陽性藥，對新化合物1，2和5進(jìn)行了初步的抗hiv活性篩選(單孔，6濃度)，結(jié)果見表4。其中化合物1和2具有較好的抗病毒活性和選擇指數(shù)，我們對其進(jìn)行了復(fù)篩(3孔，12濃度)。結(jié)果如表4所示：表1.化合物16–20的氫譜數(shù)據(jù)(table1.1hnmrdataforcompounds16–20)400mhz核磁測于氘代氯仿，化學(xué)位移單位ppm(recordincdcl3,400mhzfor1h,δinppm)表2.化合物16–20的碳譜數(shù)據(jù)(table2.13cnmrdataforcompounds16–20)100mhz核磁測于氘代氯仿，化學(xué)位移單位ppm(recordincdcl3,400mhzfor1h,δinppm)表3.化合物1–30細(xì)胞毒活性(table3cytotoxicactivitiesofcompounds1–30)表4.化合物1和2抗hiv活性(table4.anti-hivactivitiesofcompounds1and2)當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12