一種大孔樹(shù)脂法提高間苯三酚生產(chǎn)菌的產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物法制備間苯三酚的領(lǐng)域，通過(guò)使用吸附手段提高間苯三酚的產(chǎn)量。
【背景技術(shù)】
[0002]間苯三酚又稱(chēng)均苯三酚或I，3，5-苯三酚，別名斯帕豐(Spasfon)，俗稱(chēng)根皮苷酚，英文名稱(chēng)為phloroglucino1、m_trihydroxybenzene、PhlorogIucinoI dihydrate，簡(jiǎn)稱(chēng)為phi。間苯三酚及其衍生物在自然界中廣泛分布于陸生植物和海藻中，是一種重要的醫(yī)藥中間體。作為一種親肌性非阿托品非罌粟堿類(lèi)平滑肌解痙藥，主要用于治療多種急性痙攣性疼痛。是胃腸道、泌尿生殖道痙攣及孕期宮縮治療的首選藥物，作用迅速，副作用少。由于化學(xué)法合成存在各種弊端，生物合成法成為制備間苯三酚的潛在手段和研究熱點(diǎn)。但是間苯三酚本身作為許多抗生素的前體，由于它自身的毒性，限制了其在生物合成法中產(chǎn)量的增加。本發(fā)明涉及利用大孔樹(shù)脂提高生物發(fā)酵過(guò)程中間苯三酚的產(chǎn)量，使其生產(chǎn)間苯三酚的廣量大大提尚。
[0003]生物法合成間苯三酚的研究主要是基于發(fā)現(xiàn)phlD基因是控制產(chǎn)生間苯三酚的關(guān)鍵基因，因此，目前的很多研究通過(guò)將PhlD基因轉(zhuǎn)化到大腸桿菌體內(nèi)進(jìn)行異源表達(dá)，并利用大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的生物酶體系和原料來(lái)合成間苯三酚。
[0004]生物合成法生產(chǎn)間苯三酚受到幾個(gè)不同方面的限制，比如間苯三酚自身的理化性質(zhì)，phID催化過(guò)程中底物、關(guān)鍵酶等的限制，基因工程菌高密度發(fā)酵條件的影響等等。針對(duì)以上限制因素，可以采取相應(yīng)的措施來(lái)提高間苯三酚的表達(dá)量。
[0005]I)提高大腸桿菌對(duì)間苯三酚的耐受性
[0006]間苯三酚是許多抗生素的前體，由于它自身的毒性，限制了其在發(fā)酵條件下產(chǎn)量的增加。有文獻(xiàn)報(bào)道，間苯三酚濃度達(dá)到0.5g/L時(shí)，將顯著抑制大腸桿菌細(xì)胞生長(zhǎng)。因此提高大腸桿菌對(duì)間苯三酚的耐受性是提高間苯三酚產(chǎn)量的關(guān)鍵。多重抗生素耐藥基因(mar)是大腸桿菌中的一個(gè)普遍的抗性基因簇，研究顯示其對(duì)多種抗生素、消毒劑和有機(jī)溶劑等具有耐藥性。因此，通過(guò)提高marA基因的表達(dá)可以提高大腸桿菌對(duì)間苯三酚的耐受性。
[0007]2)增強(qiáng)間苯三酚合成途徑中的關(guān)鍵酶
[0008]由于phlD催化合成間苯三酚是以丙二酸單酰輔酶A作為唯一底物，所以可以推測(cè)大腸桿菌中丙二酸單酰輔酶A的濃度高低對(duì)間苯三酚的產(chǎn)量有很大的影響。然而，利用LC-ES1-MS/MS分析方法測(cè)得野生型大腸桿菌中，細(xì)胞內(nèi)的丙二酸單酰輔酶A濃度被嚴(yán)格控制在很低的水平，以維持其正常代謝活動(dòng)。丙酮酸脫羧酶復(fù)合體催化產(chǎn)生的乙酰輔酶A，大部分進(jìn)入了 TCA循環(huán)，小部分由乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)羧化為丙二酸單酰輔酶A進(jìn)入脂肪酸合成途徑。即乙酰輔酶A羧化為丙二酸單酰輔酶A也可能是間苯三酚合成的限速反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，由acc基因編碼的ACCase是催化乙酰輔酶A合成丙二酰輔酶A的關(guān)鍵酶，因此提高大腸桿菌中ACCase的表達(dá)量，從而增加基因工程菌中丙二酸單酰輔酶A的含量，以期提高間苯三酸的合成量。
[0009]3)降低間苯三酚合成途徑中的競(jìng)爭(zhēng)酶
[0010]基因工程菌的高密度發(fā)酵技術(shù)廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，并且取得了很好的成果。但是在實(shí)際應(yīng)用中該技術(shù)仍然存在一定的缺陷。比如，細(xì)菌在代謝過(guò)程中產(chǎn)生很多有害的代謝廢物，使得菌體過(guò)早地衰老、自溶，導(dǎo)致外源基因不能充分表達(dá)。因此，應(yīng)用代謝工程技術(shù)對(duì)工程菌進(jìn)行改良，敲除或者降低間苯三酚合成途徑中的競(jìng)爭(zhēng)酶，阻斷產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物的途徑，是降低代謝副產(chǎn)物產(chǎn)量的最直接的方法，也是提高間苯三酚表達(dá)量的可選途徑。
[0011]以葡萄糖為原料合成間苯三酚的代謝途徑如附圖1所示。分析野生型大腸桿菌的中心代謝途徑可知，由丙酮酸脫羧酶復(fù)合體催化產(chǎn)生的乙酰輔酶A大部分進(jìn)入了 TCA循環(huán)，小部分由ACCase羧化為丙二酸單酰輔酶A進(jìn)入脂肪酸合成途徑，還有一部分被乙醇途徑(途徑5)和乙酸途徑(途徑6、7)消耗。阻斷乙酰CoA的分支代謝途徑，減少相關(guān)副產(chǎn)物的生成，從而使更多的乙酰CoA羧化成丙二酸單酰CoA，進(jìn)入間苯三酚代謝途徑，間接提高間苯三酚的產(chǎn)量。
[0012]乙酸是大腸桿菌的主要副產(chǎn)物之一，乙酸的濃度過(guò)高會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。當(dāng)乙酸濃度超過(guò)1.0?1.5g/L時(shí)，重組外源基因的表達(dá)會(huì)大幅度降低，所以要降低代謝過(guò)程中乙酸的產(chǎn)生量。阻斷乙酸產(chǎn)生的主要途徑可以采用Red重組法，得到AackA-pta的變株，使得乙酰CoA得以累積，從而提高間苯三酚的前體丙二酸單酰輔酶A的合成量。
[0013]2009年，Zha等把磷酸轉(zhuǎn)乙?；?乙酸激酶A和乙醇脫氫酶同時(shí)敲除，同時(shí)阻斷了乙酸途徑和乙醇途徑，檢測(cè)到間苯三酚的產(chǎn)量達(dá)到原來(lái)的3.7倍，產(chǎn)量達(dá)12 8 O m g / L。與Achkar等的研究相比，間苯三酚的產(chǎn)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)而增加。2011年，Cao等將marA基因和大腸桿菌中的ACCase基因共表達(dá)，在間歇發(fā)酵培養(yǎng)條件下，目的菌株的間苯三酚積累量可高達(dá)3.8g/L。在Cao的另外一篇論文中發(fā)現(xiàn)，使用源自fic基因的穩(wěn)定期啟動(dòng)子及高拷貝質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)PhlD，在搖瓶條件下此工程菌株的間苯三酚產(chǎn)量可以達(dá)到0.28g/L，消耗的葡萄糖中有9.2 %轉(zhuǎn)化成了間苯三酚。
[0014]現(xiàn)有的生物合成間苯三酚的方法通過(guò)各種途徑來(lái)達(dá)到提高間苯三酚產(chǎn)量的目的，但是仍然受到間苯三酚自身作為抗生素前體的影響，抑制了間苯三酚生產(chǎn)菌株的生長(zhǎng)和代謝，從而限制了間苯三酚產(chǎn)量的提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明利用吸附材料來(lái)吸附發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的間苯三酚，從而減少了發(fā)酵液中的間苯三酚對(duì)菌體生長(zhǎng)和代謝的抑制，大大提高了間苯三酚的產(chǎn)量，并且簡(jiǎn)化了間苯三酚的純化。
[0016]吸附材料可以為本領(lǐng)域?qū)﹂g苯三酚有吸附效果的任意吸附材料，優(yōu)選大孔樹(shù)脂，例如 H-103、XDA-l、DA-201、ADS-7、XDA-200、D101、DM130、X-5 等大孔樹(shù)脂。所述吸附材料優(yōu)選放入透析袋中，所述透析袋優(yōu)選截留分子量為8000-14000，例如MD77等。因此實(shí)驗(yàn)中采取將大孔樹(shù)脂裝入透析袋中，再加入發(fā)酵液中進(jìn)行吸附，一方面防止了菌體及其固體代謝物對(duì)大孔樹(shù)脂的堵塞，另一方面降低了大孔樹(shù)脂和發(fā)酵液的分離難度，簡(jiǎn)化了間苯三酚的純化。
[0017]在間苯三酚生產(chǎn)菌株發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)間苯三酚的培養(yǎng)液中加入大孔樹(shù)脂，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為0.5-5天。培養(yǎng)結(jié)束后，分別處理發(fā)酵液和大孔樹(shù)脂。發(fā)酵液離心后，取上清液經(jīng)萃取后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后獲得樣品；大孔樹(shù)脂洗脫后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后獲得樣品。分別經(jīng)TLC和HPLC檢測(cè)，確定產(chǎn)生間苯三酚的量。洗脫大孔樹(shù)脂的洗脫液可以為甲醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醇等，優(yōu)選乙醇。洗脫液濃度為70 %-100%,優(yōu)選為95 % ο洗脫液體積為大孔樹(shù)脂體積的5-40倍，洗脫液體積優(yōu)選為大孔樹(shù)脂體積的20倍，洗脫率可達(dá)吸附量的95 %以上。
[0018]使用大孔樹(shù)脂的間苯三酚生產(chǎn)菌產(chǎn)量相比于對(duì)照發(fā)酵液產(chǎn)生的間苯三酚的量，產(chǎn)量提高I倍。
【附圖說(shuō)明】
[0019]附圖1以葡萄糖為原料合成間苯三酚的代謝途徑。
【具體實(shí)施方式】
[0020]實(shí)驗(yàn)材料:
[0021 ] 大孔樹(shù)脂:H-103、XDA-1、DA_201、ADS_7均為分析純；間苯三酚生產(chǎn)菌:實(shí)驗(yàn)室自主構(gòu)建；間苯三酚對(duì)照品:公司自產(chǎn)；乙醇，乙酸乙酯均為分析純；透析袋MD77:截留分子量8000-14000。
[0022]實(shí)施例1:
[0023]將間苯三酚生產(chǎn)菌株接種到培養(yǎng)基(蛋白胨、酵母膏、NaCl)中，37°C150-180rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，作為種子液。將種子液按2%接種量接種于200mL培養(yǎng)基中，37°C180-220rpm振蕩培養(yǎng)2.5-3h;加入IPTG誘導(dǎo)劑(終濃度為ImM)，培養(yǎng)條件改為25°C，160-180rpm，培養(yǎng)5-6h后，加入1ml葡萄糖(0.5g/L)和1g大孔樹(shù)脂XDA-1 (濕重)，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)48h。
[0024]培養(yǎng)結(jié)束后，分別處理發(fā)酵液和大孔樹(shù)脂。發(fā)酵液離心后，取上清液經(jīng)乙酸乙酯萃取后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后獲得樣品；大孔樹(shù)脂用乙醇洗脫后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后獲得樣品。95%的乙醇對(duì)間苯三酚的洗脫率可達(dá)吸附量的95%以上，洗脫液體積為大孔樹(shù)脂體積的20倍。
[0025]分別經(jīng)TLC和HPLC檢測(cè)，確定產(chǎn)生間苯三酚的量為4克。
[0026]對(duì)比例1:
[0027]未加大孔樹(shù)脂，其他與實(shí)施例1一致，確定產(chǎn)生間苯三酚的量為2克。
[0028]實(shí)施例2:
[0029]將實(shí)施例1中的大孔樹(shù)脂XDA-1替換為H-103，其他與實(shí)施例1一致，確定產(chǎn)生間苯三酚的量為2.3克。
[0030]實(shí)施例3:
[0031]將實(shí)施例1中的大孔樹(shù)脂XDA-1替換為DA-201，其他與實(shí)施例1一致，確定產(chǎn)生間苯三酚的量為2.8克。
[0032]實(shí)施例4:
[0033]將實(shí)施例1中的大孔樹(shù)脂XDA-1替換為ADS-7，其他與實(shí)施例1一致，確定產(chǎn)生間苯三酚的量為3.4克。
[0034]盡管發(fā)明人已經(jīng)對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做了較為詳細(xì)的闡述和列舉，應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)于本領(lǐng)域一個(gè)熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，對(duì)上述實(shí)施例作出的修改和/或變通或者采用等同的替代方案是顯然的，并未脫離本發(fā)明精神的實(shí)質(zhì)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種提高間苯三酚生產(chǎn)菌的產(chǎn)量的方法，包括發(fā)酵步驟、后處理步驟，其特征在于:在發(fā)酵步驟中加入間苯三酚吸附材料，減少發(fā)酵液中的間苯三酚對(duì)菌體生長(zhǎng)和代謝的抑制，提高了間苯三酚的產(chǎn)量。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于吸附材料采用裝入透析袋中的方式加入發(fā)酵液中。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述間苯三酚吸附材料為大孔樹(shù)脂。4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述大孔樹(shù)脂選自H-103、XDA-1、DA-201、ADS-7、XDA-200、D101、DM130、X-5o5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述大孔樹(shù)脂優(yōu)選為XDA-1。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述后處理步驟包括洗脫大孔樹(shù)脂的步驟，洗脫液選自甲醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醇，優(yōu)選為乙醇，洗脫液體積為大孔樹(shù)脂體積的5-40倍。7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述洗脫液濃度為70%-100%，洗脫液體積為大孔樹(shù)脂體積的20倍。8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于洗脫率為吸附量的95%以上。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述產(chǎn)量提高I倍以上。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種大孔樹(shù)脂法提高間苯三酚生產(chǎn)菌的產(chǎn)量的方法，包括發(fā)酵步驟、后處理步驟。在發(fā)酵步驟中加入間苯三酚吸附材料，減少發(fā)酵液中的間苯三酚對(duì)菌體生長(zhǎng)和代謝的抑制，提高了間苯三酚的產(chǎn)量。吸附材料優(yōu)選采用裝入透析袋中的方式加入發(fā)酵液中，吸附材料優(yōu)選為大孔樹(shù)脂，產(chǎn)量可提高1倍以上。
【IPC分類(lèi)】C12P7/22
【公開(kāi)號(hào)】CN105543288
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510795955
【發(fā)明人】孫秀娟, 閻振鑫, 李倩, 彼得普勞克斯, 林文翰, 吳偉成
【申請(qǐng)人】壽光富康制藥有限公司
【公開(kāi)日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2015年11月18日