本發(fā)明屬于腫瘤標記物的檢測方法
技術領域：
，具體涉及一種利用多重PCR檢測多種胰腺癌腫瘤標記物的方法及檢測用引物和探針。
背景技術：
：胰腺癌是一種高度惡化的消化系統(tǒng)腫瘤，臨床表現無特異性，雖然近20年來醫(yī)療技術有了很大提高，但在診斷和治療胰腺癌方面仍存在很多問題：早期的確診率不高，手術死亡率較高，治愈率很低，我國胰腺癌的發(fā)病率位于常見腫瘤的第10位，致死率位居第4位。雖然胰腺癌患者的血清中含有較多的腫瘤標記物，如CAl9-9和CA242，以及癌胚抗原(CEA)等，但是現階段血清學腫瘤標記物檢測的靈敏度及特異性尚未盡如人意，故臨床急需有效的聯合檢測以提高胰腺癌早期診斷率，改善整體治療效果。胰腺癌基因腫瘤標記物可作為血清學腫瘤標記物的有效補充。上皮細胞間緊密連接骨架蛋白(Claudin)是細胞間緊密連接蛋白的主要結構之一，其表達具有組織特異性，在維持細胞急性和緊密連接屏障功能方面起著重要作用。緊密連接蛋白(Claudin)屬于跨膜緊密連接蛋白，兩個相鄰的Claudin相互作用構成了細胞間的連接骨架，其完整性的破壞可引起細胞問黏附的丟失和腫瘤的擴散轉移。有研究者發(fā)現Claudin中的主要成員Claudin-4在PanIN、原發(fā)性PDAC和侵襲性PDAC中高表達，而在正常胰腺導管上皮中低表達。還有一些研究者發(fā)現Claudin-4在癌組織中表達的陽性率明顯高于胰腺正常組織，與胰腺炎相比，其表達與胰腺癌顯著相關。有研究者使用4992個人類基因cDNA微陣列分析胰腺腫瘤，發(fā)現Claudin-4等基因上調，這為胰腺癌的早期診斷和良惡性胰腺病變的鑒別提供了可能。P53是腫瘤抑制基因，P53突變后細胞容易帶著受損的DNA進入S期，使細胞遺傳不穩(wěn)定而產生突變和染色體畸變，導致細胞惡性變。有報導稱50％～60％胰腺癌中存在突變型P53的過表達。胰腺癌關系最密切的抑癌基因為P53基因，約60％～80％的胰腺侵襲性腫瘤中發(fā)現該基因的失活，抑制細胞的凋亡并導致細胞的過度生長，且該基因在慢性胰腺炎中通常為陰性。P53突變在胰腺癌的發(fā)生過程中是具有高度特異性的腫瘤標志物。多重PCR即是在同一PCR反應體系中加入兩對或兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，其反應原理、反應試劑盒操作過程與一般PCR相同。但由于多重PCR實驗設計較一般PCR設計難度更大，除了需要考慮到引物與模板的特異性結合，還需要考慮引物與引物之間、引物與探針、產物與產物等之間的堿基配對結合，故其引物序列的設計是成功的關鍵，除此之外，為保證每個基因都得到有效的擴增，必須反復優(yōu)化實驗條件，包括反應體系及反應條件。目前，未見利用多重PCR檢測多種胰腺癌腫瘤標記物Claudin-4、P53和18sRNA的方法的報導。技術實現要素：針對現有技術中存在的上述問題，本發(fā)明提供一種利用多重PCR檢測多種胰腺癌腫瘤標記物的方法及檢測用引物和探針，可簡便、快捷的檢測胰腺癌腫瘤標記物。為實現上述目的，本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：一種利用多重PCR檢測多種胰腺癌腫瘤標記物的方法，包括以下步驟：(1)設計引物和探針：根據檢測基因Claudin-4和P53，選擇18sRNA作為定量內參，使用BeaconDesigner7軟件設計引物和探針序列；P53Forwardprimer：5’-CAAAAGTCTAGAGCCACC-3’(SEQIDNo:1)；P53Reverseprimer：5’-AATGTTTCCTGACTCAGAG-3’(SEQIDNo:2)；P53probe：5’FAM-TCTGACTGCGGCTCCTCC-3’DABCYL(SEQIDNo:3)；Claudin-4Forwardprimer：5’-GCCAGCAACTACGTGTAA-3’(SEQIDNo:4)；Claudin-4Reverseprimer：5’-CTCAGTCCAGGGAAGAAC-3’(SEQIDNo:5)；Claudin-4probe：5’HEX-ACGGCTCCACTCTGTTCCTC-3’DABCYL(SEQIDNo:6)；18sRNAForwardprimer：5’-GCAGCTAGGAATAATGGA-3’(SEQIDNo:7)；18sRNAReverseprimer：5’-GAATTTCACCTCTAGCGGCG-3’(SEQIDNo:8)；18sRNAprobe：5’CY5-CCGAAAACCAACAAAATAGAACCGC-3’BHQ2(SEQIDNo:9)；(2)提取胰腺組織總RNA，此處用試劑盒mirVanaTMmiRNAIsolationKit(AM1561，Ambion)進行操作，具體過程如下：采用液氮研磨的方式破碎胰腺組織，然后取1g研磨后的粉末，加入500μL裂解液，混勻，得裂解體系，然后加入1/10倍裂解體系體積的miRNAHomogenateAdditive，冰上裂解10min，最后加入與裂解后溶液等體積的酚氯仿異戊醇(V:V:V＝25:24:1)抽提，接著于13500r/min離心5min，轉移上清至新管，再加入1/3上清液體積的無水乙醇沉淀兩次后過柱純化得總RNA；(3)RNA濃度及純度鑒定：用酶標儀測定RNA濃度，15％聚丙烯酰胺變性凝膠電泳鑒定RNA完整性；(4)去除DNA以及合成cDNA，此處用試劑盒PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(CodeNo.RR047A，TakaRa)進行操作，具體操作如下：總RNA經gDNAEraser處理去除基因組DNA，采用Randomprimer和OligodTPrimer混合的RTPrimer作為反轉錄引物，加入1.5μg總RNA，反應程序依次為37℃，15min，85℃，5s，具體過程按照PrimeScriptTMRTreagentKit說明書進行操作；(5)real-timePCR，此處用試劑盒SsoAdvancedTMUniversalProbesSupermix(bio-rad，1725282)進行操作，具體操作如下：根據步驟(1)中設計的引物和探針進行熒光定量PCR檢測。進一步地，步驟(5)中熒光定量PCR檢測的反應體系為20μL，包括P53上下游引物各0.4μL、P53probe0.3μL、Claudin-4上下游引物各0.4μL、Claudin-4probe0.3μL、18sRNA上下游引物各0.3μL、18sRNAprobe0.2μL、DNA模板3μL，去離子水補至20μL。進一步地，步驟(5)中熒光定量PCR檢測的擴增程序為擴增程序為95℃預變性3min，95℃變性5s，61℃退火30s，共40個循環(huán)。利用多重PCR檢測多種胰腺癌腫瘤標記物的2種引物，該2種引物序列分別為：P53Forwardprimer：5’-CAAAAGTCTAGAGCCACC-3’(SEQIDNo:1)；P53Reverseprimer：5’-AATGTTTCCTGACTCAGAG-3’(SEQIDNo:2)；Claudin-4Forwardprimer：5’-GCCAGCAACTACGTGTAA-3’(SEQIDNo:4)；Claudin-4Reverseprimer：5’-CTCAGTCCAGGGAAGAAC-3’(SEQIDNo:5)。利用多重PCR檢測多種胰腺癌腫瘤標記物的2種探針，該2種探針序列分別為：P53probe：5’FAM–TCTGACTGCGGCTCCTCC-3’DABCYL(SEQIDNo:3)；Claudin-4probe：5’HEX-ACGGCTCCACTCTGTTCCTC-3’DABCYL(SEQIDNo:6)。本發(fā)明提供的利用多重PCR檢測多種胰腺癌腫瘤標記物的方法及檢測用引物和探針，具有以下有益效果：本發(fā)明提供的檢測方法，采集一個標本便可同時進行Claudin-4、P53與內參18sRNA檢測，采用探針法檢測，本發(fā)明設計的引物和探針，特異性好，靈敏度高，結果數據可靠，重復性強，與單個檢測相比，可節(jié)約成本和時間。附圖說明圖1為胰腺組織總RNA電泳圖；圖2為多重PCR擴增曲線圖；圖3為多重PCR產物的電泳圖；圖4為CY5標記的18sRNA擴增效率圖；圖5為HEX標記的Claudin-4擴增效率圖；圖6為FAM標記的P53擴增效率圖；圖7為不同樣本的Claudin-4相對表達量統(tǒng)計圖；圖8為不同樣本的P53相對表達量統(tǒng)計圖。具體實施方式實施例11、一種利用多重PCR檢測多種胰腺癌腫瘤標記物的方法，包括以下步驟：(1)根據檢測基因Claudin-4(NCBIReferenceSequence:NM_001305.4)和P53(NCBIReferenceSequence:NM_001126112.2)，選擇18sRNA(NCBIReferenceSequence:NR_003286.2)作為定量內參，使用BeaconDesigner7軟件設計引物和探針序列；P53Forwardprimer：5’-CAAAAGTCTAGAGCCACC-3’(SEQIDNo:1)；P53Reverseprimer：5’-AATGTTTCCTGACTCAGAG-3’(SEQIDNo:2)；P53probe：5’FAM-TCTGACTGCGGCTCCTCC-3’DABCYL(SEQIDNo:3)；Claudin-4Forwardprimer：5’-GCCAGCAACTACGTGTAA-3’(SEQIDNo:4)；Claudin-4Reverseprimer：5’-CTCAGTCCAGGGAAGAAC-3’(SEQIDNo:5)；Claudin-4probe：5’HEX-ACGGCTCCACTCTGTTCCTC-3’DABCYL(SEQIDNo:6)；18sRNAForwardprimer：5’-GCAGCTAGGAATAATGGA-3’(SEQIDNo:7)；18sRNAReverseprimer：5’-GAATTTCACCTCTAGCGGCG-3’(SEQIDNo:8)；18sRNAprobe：5’CY5-CCGAAAACCAACAAAATAGAACCGC-3’BHQ2(SEQIDNo:9)；(2)提取胰腺組織總RNA，此處用試劑盒mirVanaTMmiRNAIsolationKit(AM1561，Ambion)進行操作，具體過程如下：采用液氮研磨的方式破碎胰腺組織，然后取1g研磨后的粉末，加入500μL裂解液，混勻，得裂解體系，然后加入1/10倍裂解體系體積的miRNAHomogenateAdditive，冰上裂解10min，再加入與裂解后溶液等體積的酚氯仿異戊醇(V:V:V＝25:24:1)抽提，接著于13500r/min離心5min，轉移上清至新管，再加入1/3上清液體積的無水乙醇沉淀兩次后過柱純化得總RNA；(3)RNA濃度及純度鑒定：用ThermoNanoDrop2000全波長酶標儀測定RNA濃度，15％聚丙烯酰胺變性凝膠電泳鑒定RNA完整性，Bio-RadChemiDocMPimagingsystem成像；(4)DNA去除與cDNA合成，此處用試劑盒PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(CodeNo.RR047A，TakaRa)進行操作，具體操作如下：總RNA經gDNAEraser處理去除基因組DNA，采用Randomprimer和OligodTPrimer混合的RTPrimer作為反轉錄引物，加入1.5μg總RNA進行反應，反應程序依次為37℃，15min；85℃，5s；具體過程參照PrimeScriptTMRTreagentKit說明書；(5)real-timePCR，此處用試劑盒SsoAdvancedTMUniversalProbesSupermix(bio-rad，1725282)進行操作，具體操作如下：在Bio-RadCFX96熒光定量PCR儀中進行擴增反應，用軟件CFXManager進行結果分析，擴增反應體系共20μL，具體成分見表1，擴增程序為95℃預變性3min，95℃變性5s，61℃退火30s，共40個循環(huán)；表1real-timePCR擴增反應體系(6)多重PCR擴增效率檢測取步驟(5)中多重PCR產物作為DNA模板，將其稀釋10000倍作為初始濃度，然后再對初始濃度按10倍依次稀釋5個梯度，每個梯度取3μL作為模板，按照步驟(5)中PCR體系及程序進行擴增反應，并用軟件CFXManager計算多重PCR擴增效率。2、結果(1)胰腺組織總RNA濃度及純度檢測所提取的總RNA濃度在133-1273μg/μL，A260/A280比值在1.8～2.1之間，隨機挑取5個樣本進行瓊脂糖凝膠電泳，Bio-RadChemiDocMPimagingsystem成像，RNA完整性良好，總RNA電泳圖見圖1。由圖1可知，胰腺組織總RNA完整性較好，條帶清晰無拖尾，可見28srRNA、18srRNA、5srRNA三條帶。(2)多重PCR擴增曲線多重PCR擴增曲線見圖2，其中，a為CY5標記的18sRNA的擴增曲線；b為HEX標記的Claudin-4的擴增曲線；c為FAM標記的P53的擴增曲線。由圖2可知，隨著熒光信號值不斷積累增長，擴增曲線分背景信號器、對數增長期、平臺期、NTC(notempletcontrol)未出現擴增，數據可靠。(3)對多重PCR產物進行電泳分析隨機選取多重PCR產物，每種產物分別取10μL，進行2％瓊脂糖凝膠電泳，Bio-RadChemiDocMPimagingsystem成像，電泳結果見圖3。由圖3可知，每個樣品均呈現3條條帶，條帶大小分別為70bp、150bp和200bp，由此可知，本發(fā)明設計的引物擴增產物，檢測基因PCR擴增產物的大小與之相符，結果可靠。雖然從左邊數第一個樣品有一條條帶不清晰，這是因為此樣品對應的P53表達量比較低的原因，但此條帶還是存在的。(4)多重PCR擴增效率多重PCR擴增效率見圖4-圖6；其中，圖4為CY5標記的18sRNA擴增效率圖；圖5為HEX標記的Claudin-4擴增效率圖；圖6為FAM標記的P53擴增效率圖。圖4中標準曲線線性R2＝0.995，擴增效率為91.8％，符合PCR擴增檢測的要求。圖5中標準曲線線性R2＝0.995，擴增效率為95.9％，符合PCR擴增檢測的要求。圖6中標準曲線線性R2＝0.996，擴增效率為90.7％，符合PCR擴增檢測的要求。實驗例根據2-△△CT法定量分析胰腺癌組織10例，胰腺癌遠端正常組織10例，慢性胰腺炎組織7例的Claudin-4相對表達量，具體結果見表2和圖7；P53相對表達量，具體結果見表3和圖8。表2組織樣本的Claudin-4相對表達量樣本編號樣本類型Claudin-4相對表達量1Normal0.536872Normal0.290323Normal0.505184Normal0.584005Normal1.089336Normal0.094217Normal0.218218Normal1.007499Normal0.5330610Normal0.3551511chronicpancreatitis0.1855312chronicpancreatitis0.2540613chronicpancreatitis0.3673814chronicpancreatitis0.4662215chronicpancreatitis0.6118016chronicpancreatitis1.4290117chronicpancreatitis0.3531618pancreaticcancer10.5892519pancreaticcancer6.1106320pancreaticcancer1.1430721pancreaticcancer1.3794322pancreaticcancer0.8400923pancreaticcancer2.8433124pancreaticcancer0.5841225pancreaticcancer1.0655626pancreaticcancer2.0004927pancreaticcancer1.23103圖7為Claudin-4表達量統(tǒng)計結果，其中cancer為10例胰腺癌組織Claudin-4的相對表達量，normal為10例胰腺癌遠端正常組織Claudin-4的相對表達量，cp為7例慢性胰腺炎組織Claudin-4的相對表達量，經多重t檢驗分析，結果表明胰腺癌組織Claudin-4的表達量遠遠高于另外兩組(P<0.05)。表3組織樣本的P53相對表達量表3為組織樣本的P53相對表達量，圖8為P53表達量統(tǒng)計結果。由表3和圖8可知，胰腺癌組織的P53相對表達量均值為1.61832，胰腺癌遠端正常組織的P53相對表達量均值為0.75167，慢性胰腺炎組織的P53相對表達量均值為0.59902，胰腺癌遠端正常組織的P53相對表達量與慢性胰腺炎組織的P53相對表達量無明顯差異。胰腺癌組織19號、20號、21號、25號、27號樣本表達量高出平均水平，排除這幾種樣品，胰腺癌組表達量為0.82246，與正常和慢性胰腺炎組無明顯差異。雖然P53的失活主要體現在基因的點突變，與其表達量關系不大。但這幾個樣品表達量比較高，很可能存在P53突變，導致P53蛋白水平過表達，成為導致腫瘤發(fā)生的重要因素之一，需要結合測序結果進行綜合分析。SEQUENCELISTING<110>四川大學華西醫(yī)院<120>一種利用多重PCR檢測多種胰腺癌腫瘤標記物的方法及檢測用引物和探針<130>2016<160>9<170>PatentInversion3.3<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1caaaagtctagagccacc18<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>2aatgtttcctgactcagag19<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>3tctgactgcggctcctcc18<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>4gccagcaactacgtgtaa18<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>5ctcagtccagggaagaac18<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6acggctccactctgttcctc20<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>7gcagctaggaataatgga18<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8gaatttcacctctagcggcg20<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>9ccgaaaaccaacaaaatagaaccgc25當前第1頁1 2 3