本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及魚類分子標(biāo)記育種方法，具體涉及一種鯛魚種質(zhì)鑒定的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

真鯛Pagrosomus major屬鱸形目、鯛科、真鯛屬，黑鯛Spraus macrocephalus屬鱸形目、鯛科、黑鯛屬，它們都是我國重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類。真鯛具有個體大、生長快、肉質(zhì)好、色澤美、抗病能力強(qiáng)等特點，但對鹽度、溫度變化敏感，抗逆性較差；黑鯛對溫度、鹽度適應(yīng)范圍較廣，但生長慢，養(yǎng)成周期長。通過真鯛和黑鯛雜交育種，可以獲得具有雙親優(yōu)良性狀的雜交子代，從而提高鯛魚養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益，推動鯛魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。在雜交后代中，正交后代(真鯛♀×黑鯛♂)和反交后代(黑鯛♀×真鯛♂)體現(xiàn)出不一樣的生產(chǎn)性能，其中正交后代具有較好的雜交優(yōu)勢，生產(chǎn)性能優(yōu)良。在生產(chǎn)中，雜交種外部形態(tài)又與親本很相似，正交后代與反交后代也容易混淆，因此，生產(chǎn)上很容易造成鯛魚種質(zhì)混雜，導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降和種質(zhì)退化。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，獲得一種快速、準(zhǔn)確的檢測方法，且為鯛魚的品種鑒定、種質(zhì)資源保護(hù)和育種等提供重要依據(jù)，本發(fā)明提供了一種鯛魚種質(zhì)鑒定的方法及其應(yīng)用。

技術(shù)方案：一種鯛魚種質(zhì)鑒定的方法，包含以下步驟：

(1)以鯛魚基因組DNA為模板，采用引物A進(jìn)行特異性擴(kuò)增，鑒別真鯛、黑鯛及二者的雜交后代；所述引物A的序列為SEQ ID NO：1～2；

(2)以步驟(1)鑒別獲得的雜交后代基因組DNA為模板，采用引物B進(jìn)行特異性擴(kuò)增；所述引物B的序列為SEQ ID NO：3～4；

(3)酶切步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，鑒別正交后代和反交后代。

引物序列如表1所示：

表1鯛魚種質(zhì)鑒定的引物序列

優(yōu)選的，步驟(3)酶切過程采用的是限制性內(nèi)切酶MspI。

優(yōu)選的，步驟(3)酶切的體系為：擴(kuò)增產(chǎn)物10μL，滅菌雙蒸水18μL，10×buffer Tango 2μL，酶10～20U，37℃酶切12h。

優(yōu)選的，步驟(1)和步驟(2)的擴(kuò)增體系為：總體積20μL，其中含10×反應(yīng)緩沖液2μL，Mg²⁺2mmol/L，dNTP 200μmol/L,上下游引物各0.2μmol/L，Taq酶0.5U，DNA模板100ng～200ng，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至20μL。

優(yōu)選的，步驟(1)擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：94℃2min；94℃30s，57℃退火30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。

優(yōu)選的，步驟(2)擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：94℃2min；94℃30s，55℃退火30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。

優(yōu)選的，步驟(1)的擴(kuò)增產(chǎn)物采用8.0％的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離。

優(yōu)選的，步驟(3)酶切產(chǎn)物采用3％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。

所述鯛魚種質(zhì)鑒定的方法在鯛魚育種中的應(yīng)用。

有益效果：(1)本發(fā)明所述鯛魚種質(zhì)鑒定的方法能夠在分子水平快速、準(zhǔn)確的鑒定鯛魚的種質(zhì)；(2)所述方法能夠清楚鑒別真鯛、黑鯛及二者正反交后代，為鯛魚的品種鑒定、種質(zhì)資源保護(hù)和育種等提供重要依據(jù)。

附圖說明

圖1是真鯛、黑鯛及正反交后代鑒定結(jié)果圖；

其中，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1～10為真鯛，11～19為正交后代，20～29為黑鯛，30～35為反交后代；

圖2是雜交后代鑒定結(jié)果圖；

其中，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1～12為正交后代，13～23為反交后代；

圖3為實施例3中真鯛、黑鯛及二者雜交后代鑒定結(jié)果圖；

其中，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1～12、35～37為雜交后代，13～24為真鯛，25～34為黑鯛；

圖4為實施例3雜交后代鑒定結(jié)果圖；

其中，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1～12為正交后代，13～25為反交后代。

具體實施方式

以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實施例1引物A可行性分析

種質(zhì)確定的真鯛、黑鯛各10尾，正交后代(真鯛♀×黑鯛♂)9尾，反交后代(黑鯛♀×真鯛♂)6尾，共35個樣品，從江蘇省海洋水產(chǎn)研究所呂四基地采得。

每尾魚取30μL血細(xì)胞抽提基因組DNA，分別以提取得到的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物A的正義引物序列為：5′AACACTTATCGCACGGCTCAG3′，反義引物序列為：5′CCCTCTGAGATCTTCACCTCCA 3′；PCR體系總體積20μL，其中含10×反應(yīng)緩沖液2μL，Mg²⁺2mmol/L，dNTP 200μmol/L,上下游引物各0.2μmol/L，Taq酶0.5U，DNA模板100ng～200ng，用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足體積至20μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃2min；94℃30s，57℃退火30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。每個樣本取PCR反應(yīng)產(chǎn)物3μL采用8.0％的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，銀染法染色后，拍照記錄電泳結(jié)果。

如圖1所示，真鯛有1條255bp的條帶，黑鯛有1條271bp的條帶，真鯛和黑鯛的雜交后代(正交和反交)都有2條條帶，分別為255bp和271bp。因此，引物A可將真鯛、黑鯛及其雜交后代區(qū)別開來。

實施例2引物B結(jié)合酶切可行性分析

種類確定的正交后代(真鯛♀×黑鯛♂)12尾，反交后代(黑鯛♀×真鯛♂)11尾，共23個樣品，從江蘇省海洋水產(chǎn)研究所呂四基地采得。

每尾魚取30μL血細(xì)胞抽提基因組DNA，分別以提取得到的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物B的正義引物序列為：5′GCATAACACTGAAGCTGTTAAGATGG3′，反義引物序列為：5′CAATGTTTATCACTGCTGAGTACCCT 3′；PCR體系總體積20μL，其中含10×反應(yīng)緩沖液2μL，Mg²⁺2mmol/L，dNTP 200μmol/L,上下游引物各0.2μmol/L，Taq酶0.5U，DNA模板100ng～200ng，用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足體積至20μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃2min；94℃30s，55℃退火30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。每個樣本取PCR反應(yīng)產(chǎn)物7μL用1.5％的瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果都擴(kuò)出1條235bp左右的目的條帶。在剩余的PCR反應(yīng)產(chǎn)物中，每個樣品配制酶切體系：PCR反應(yīng)產(chǎn)物10μL，滅菌雙蒸餾水18μL，10×buffer Tango 2μL，MspI酶15U，37℃酶切12h后，酶切產(chǎn)物用3％的瓊脂糖電泳拍照記錄電泳結(jié)果。如圖2所示，正交后代都有2條條帶，分別為141bp和93bp，反交后代都有1條條帶，235bp。因此，引物B結(jié)合酶切的方法能將正交后代和反交后代區(qū)別開來。

實施例3鯛魚種質(zhì)鑒定

待檢真鯛12尾，黑鯛10尾，真鯛和黑鯛雜交鯛15尾，從江蘇省海洋水產(chǎn)研究所呂四基地采得。

剪取每尾魚尾鰭并抽提基因組DNA，采用如實施例1所述的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳檢測。如圖3所示，真鯛都有1條255bp的條帶，黑鯛都有1條271bp的條帶，真鯛和黑鯛雜交鯛都有2條條帶，分別為255bp和271bp，所檢測的12尾真鯛，10尾黑鯛都為純種，沒有種質(zhì)混雜。

15尾雜交鯛再采用如實施例2所述的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增、檢測、再酶切，酶切產(chǎn)物用3％的瓊脂糖電泳拍照記錄電泳結(jié)果。如圖4所示，15尾雜交鯛中有12尾有2條條帶，分別為141bp和93bp，為正交鯛魚(真鯛♀×黑鯛♂)，有3尾只有1條235bp的條帶，為反交鯛魚(黑鯛♀×真鯛♂)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心

江蘇省海洋水產(chǎn)研究所

<120> 一種鯛魚種質(zhì)鑒定的方法及其應(yīng)用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aacacttatc gcacggctca g 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccctctgaga tcttcacctc ca 22

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcataacact gaagctgtta agatgg 26

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caatgtttat cactgctgag taccct 26