本發(fā)明涉及一種檢測(cè)方法，具體是一種豬衣原體的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

衣原體是介于細(xì)菌和病毒之間的一類微生物 ,直徑0 .2μm～1 .5μm ,它只能在寄主細(xì)胞原生質(zhì)內(nèi)部以一種發(fā)育史進(jìn)行繁殖。此發(fā)育史是以小的原體變成較大的網(wǎng)狀體為特征的 ,網(wǎng)狀體以分裂方式繁殖 ,網(wǎng)狀體發(fā)育成熟后破裂 ,釋放出大量的原體。原體具有感染性 ,網(wǎng)狀體對(duì)新的宿主細(xì)胞未見(jiàn)感染性。豬衣原體革蘭氏染色呈陰性。細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和成分與其他革蘭氏陰性菌相似 ,但只有微量或無(wú)胞壁酸。

豬衣原體病主要是由鸚鵡熱嗜衣原體( Chlamydia psittaci )感染豬引起的一種多征候性傳染病 ,臨床表現(xiàn)為懷孕母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)和產(chǎn)出生命力弱的仔豬；仔豬肺炎、腸炎、心包炎、腦膜腦炎、多關(guān)節(jié)炎和結(jié)膜炎；公豬睪丸炎等癥狀。其中豬衣原體性流產(chǎn)和引起仔豬大批死亡的衣原體性肺炎-腸炎對(duì)集約化養(yǎng)豬業(yè)危害嚴(yán)重。

豬衣原體(Chlamydophila psittaci，Cps) 是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的人獸共患病病原體，能引起人和動(dòng)物多種疾病。Cps 對(duì)鳥(niǎo)類、家禽和家畜有很強(qiáng)的感染性，可引起禽類的肺炎、氣囊炎、輸卵管炎及受精率降低和哺乳動(dòng)物流產(chǎn)、死產(chǎn)等生殖系統(tǒng)障礙，是一類十分重要的自然疫源性傳染病，呈地方流行。豬衣原體病是由豬衣原體感染牛引起的一種多癥狀性傳染病，主要表現(xiàn)為妊娠母牛流產(chǎn)、死產(chǎn)和產(chǎn)弱犢；新生牛多發(fā)生肺炎、腸炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、腦炎和結(jié)膜炎；種公牛發(fā)生睪丸炎等，對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成很大危害及經(jīng)濟(jì)損失。

目前針對(duì)豬衣原體疾病的檢測(cè)主要通過(guò)檢測(cè)病原體是否存在來(lái)作為主要依據(jù)，常用的有碘和Giemsa 染色，免疫熒光法，根據(jù)抗原抗體的酶免疫技術(shù)以及靈敏度比較高的PCR 技術(shù)。然而針對(duì)PCR 反應(yīng)，目前主要體現(xiàn)在MOMP 基因、rRNA 基因和內(nèi)源性質(zhì)粒這三個(gè)目的片段，內(nèi)源性質(zhì)粒的敏感性和特異性高于MOMP 基因、rRNA 基因的檢測(cè)，能夠檢測(cè)敏感性達(dá)1fg 的質(zhì)粒DNA，rRNA 基因能夠檢測(cè)到10fg 的總DNA，MOMP 基因的敏感性卻為100fg 的總DNA，為此我們建立基于TaqMan 探針的Real time PCR 技術(shù)，針對(duì)MOMP 基因中的ompA(major outer membrane protein A，ompA) 基因建立快速的、高靈敏的PCR 檢測(cè)試劑盒，從而為豬衣原體感染檢測(cè)提供強(qiáng)有力的技術(shù)保障。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種豬衣原體的檢測(cè)方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種豬衣原體的檢測(cè)方法，包含以下步驟，A、樣品制備，采取疑似患病豬的血液樣本，B、DNF提取，用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取豬衣原體的DNA，將提取后的DNA置于-70℃保存?zhèn)溆?，C、引物及探針設(shè)計(jì)；D、PCR；E、靈敏度檢測(cè)；F、特異性檢測(cè)。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：包含以下步驟，先用引物，其中，涉及的引物如下：根據(jù)GenBank 中牛豬衣原體主要外膜A 蛋白o(hù)mpA 基因序列，利用Primer5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，上游序列為4′-CGTACCATGTGGGAAGGTGCTTG-3′，下游序列為4′-CGCATTT GGAGAGGATCCTGTG-3′，針對(duì)引物之間的基因片段利用Primer Express設(shè)計(jì)TaqMAN 探針，序列為4′-GCGCAGGATACTACGGAGATTATG-3′，4’：端標(biāo)記FAM，3’端標(biāo)記NFQ-MGB，擴(kuò)增目標(biāo)片段的長(zhǎng)度為150bp。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：涉及的主要PCR 方法：Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)10.0μL ；PCR ForwardPrimer(10uM)0.8μL ；PCR Reverse Primer(10uM)0.8μL ；Probe1.0μL ；總DNA2.0μL ；ddH2O5.4μL ；總體系20μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30s ；95℃ 5s，62℃ 20s，72℃ 20s，40個(gè)循環(huán)；最后37℃降溫20min，至反應(yīng)結(jié)束。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明豬衣原體的檢測(cè)方法通過(guò)摸索選用了優(yōu)化后的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)條件和擴(kuò)增體系，提高了檢測(cè)的特異性和敏感性，建立了TaqMan MGB 探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)豬衣原體的方法，并將其固相化集成快速檢測(cè)試劑盒，敏感性為10fg 的總DNA，同時(shí)不與沙眼衣原體55Y120 株、肺炎衣原體AR39 株、沙眼衣原體、肺炎衣原體、牛結(jié)核分枝桿菌、布魯士桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、乳鏈球菌、肺炎克雷伯桿菌和沙門氏菌發(fā)生交叉反應(yīng)，具有較強(qiáng)的特異性。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本專利的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明。

一種豬衣原體的檢測(cè)方法，包含以下步驟，A、樣品制備，采取疑似患病豬的血液樣本，B、DNF提取，用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取豬衣原體的DNA，將提取后的DNA置于-70℃保存?zhèn)溆?，C、引物及探針設(shè)計(jì)；D、PCR；E、靈敏度檢測(cè)；F、特異性檢測(cè)。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：包含以下步驟，先用引物，其中，涉及的引物如下：根據(jù)GenBank 中牛豬衣原體主要外膜A 蛋白o(hù)mpA 基因序列，利用Primer5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，上游序列為4′-CGTACCATGTGGGAAGGTGCTTG-3′，下游序列為4′-CGCATTT GGAGAGGATCCTGTG-3′，針對(duì)引物之間的基因片段利用Primer Express設(shè)計(jì)TaqMAN 探針，序列為4′-GCGCAGGATACTACGGAGATTATG-3′，4’：端標(biāo)記FAM，3’端標(biāo)記NFQ-MGB，擴(kuò)增目標(biāo)片段的長(zhǎng)度為150bp。

涉及的主要PCR 方法：Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)10.0μL ；PCR ForwardPrimer(10uM)0.8μL ；PCR Reverse Primer(10uM)0.8μL ；Probe1.0μL ；總DNA2.0μL ；ddH2O5.4μL ；總體系20μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30s ；95℃ 5s，62℃ 20s，72℃ 20s，40個(gè)循環(huán)；最后37℃降溫20min，至反應(yīng)結(jié)束。

本發(fā)明的工作原理是：本發(fā)明涉及的敏感性檢測(cè)顯示：標(biāo)準(zhǔn)菌株總DNA 進(jìn)過(guò)稀釋，最大DNA 濃度為1μg，最小DNA 濃度為1fg，每個(gè)樣3 次重復(fù)，結(jié)果顯示1fg 的總DNA 在兩臺(tái)儀器中都無(wú)擴(kuò)增曲線，說(shuō)明最大靈敏度為總DNA10fg。兩臺(tái)儀器都顯示出良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，IQ5 儀器的相關(guān)系數(shù)R2 ＝ 0.996，LightCycler 的相關(guān)系數(shù)R2 ＝ 0.0.993，溶解曲線峰值單一，IQ5 儀器的Tm ＝74.3℃，LightCycler 的Tm ＝ 74.1℃。

肺炎衣原體AR39 株采用細(xì)胞培養(yǎng)分離，提取總DNA，并且進(jìn)行梯度稀釋，采用TaqMan 定量PCR 上級(jí)分析，結(jié)果顯示陽(yáng)性豬衣原體10fg 以上的總DNA 都顯示出特異性擴(kuò)增曲線，并且溶解曲線單一，Tm ＝ 74.1。沙眼衣原體、肺炎衣原體、沙眼衣原體、肺炎衣原體、牛結(jié)核分枝桿菌、布魯士桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、乳鏈球菌、肺炎克雷伯桿菌和沙門氏菌均為典型陰性反應(yīng)，均未見(jiàn)特異性的熒光擴(kuò)增曲線，均無(wú)熒光值增長(zhǎng)。結(jié)果表明，所建立的豬衣原體TaqMan MGB 探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法具有較強(qiáng)的特異性。

本發(fā)明涉及的樣品檢測(cè)顯示：針對(duì)食用豬肉樣本，采用豬衣原體IHA 診斷試劑盒檢測(cè)，PCR 和RT-QPCR 分別經(jīng)行血液和組織的檢測(cè)，結(jié)果顯示A 牛場(chǎng)(N＝ 164)IHA 檢測(cè)陽(yáng)性樣本47 例，陽(yáng)性率為28.66％，PCR 檢測(cè)陽(yáng)性樣本54 例，陽(yáng)性率為32.93％，RT-QPCR 檢測(cè)陽(yáng)性樣本60 例，陽(yáng)性率為36.59％ ；B 牛場(chǎng)(N ＝ 115)IHA 檢測(cè)陽(yáng)性樣本26 例，陽(yáng)性率為22.61％，PCR 檢測(cè)陽(yáng)性樣本29 例，陽(yáng)性率為25.22％，RT-QPCR 檢測(cè)陽(yáng)性樣本31 例，陽(yáng)性率為26.96％ ；C 牛場(chǎng)(N ＝ 97)IHA 檢測(cè)陽(yáng)性樣本17 例，陽(yáng)性率為17.53％，PCR 檢測(cè)陽(yáng)性樣本21 例，陽(yáng)性率為21.65％，RT-QPCR 檢測(cè)陽(yáng)性樣本23 例，陽(yáng)性率為23.71％。

針對(duì)所有樣品經(jīng)行RT-QPCR、PCR 與IHA 方法的敏感性與特異性檢測(cè)顯示RT-QPCR

的敏感性達(dá)到了99.03％ (102/103)，特異性為95.60％ (261/273)。

樣品制備：

病例樣品分別采取疑似患病牛的血液樣品以及對(duì)應(yīng)的組織樣本。豬衣原體的培養(yǎng)采用Hela 細(xì)胞c 將凍存的樣品常溫解凍后接種到培養(yǎng)狀態(tài)良好的Hela 細(xì)胞中，同時(shí)接種陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)菌株豬衣原體( 牛源)SX5 株作為陽(yáng)性對(duì)照，接種沙眼衣原體55Y120 作為陰性對(duì)照，5％二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48-72 小時(shí)，最后收集細(xì)胞，進(jìn)行DNA 的提取。豬衣原體DNA的提取按照UNIQ-10 柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒( 上海生工) 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

DNA 提?。?/p>

用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取沙眼衣原體、肺炎衣原體、牛結(jié)核分枝桿菌、布魯士桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、乳鏈球菌、肺炎克雷伯桿菌和沙門氏菌的DNA 和奶牛拭子的DNA( 具體操作詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū))，將提取后DNA 置-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

靈敏性檢測(cè)：

將SX5 株培養(yǎng)后提取的DNA 進(jìn)行核酸定量檢測(cè)，采用10 倍稀釋法進(jìn)行梯度稀釋，建立6 個(gè)梯度，最大DNA 濃度為1μg，最小DNA 濃度為1fg。按照前面所述PCR 體系及條件在兩臺(tái)PCR 儀上機(jī)分析。

特異性檢測(cè)：

陽(yáng)性豬衣原體SX5 株、沙眼衣原體55Y120 株、肺炎衣原體AR39 株、沙眼衣原體、肺炎衣原體、牛結(jié)核分枝桿菌、布魯士桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、乳鏈球菌、肺炎克雷伯桿菌和沙門氏菌同時(shí)采用上文設(shè)計(jì)引物探針進(jìn)行定量分析檢測(cè)，模板采用6 個(gè)梯度，最大DNA 濃度為1μg，最小DNA 濃度為1fg。