本發(fā)明涉及一種核苷酸膦酸酯一水合物及其制備方法和在醫(yī)藥上的應(yīng)用，具體的說，本發(fā)明涉及一種化合物(I)的一水合物其制備方法、組合物和在制備用于治療病毒感染性疾病的藥物上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：乙肝是世界性的疾病之一，它由乙肝病毒引起。世界上有三分之一的人口均在某種程度上感染了乙肝病毒，其中包括3億5千萬慢性攜帶者。在一些亞洲和非洲國家，乙肝已經(jīng)變成流行性疾病，尤其是在中國。乙肝病毒能引起急性和慢性感染，急性感染通常伴隨著肝臟發(fā)炎，嘔吐，黃疸，極個別的還會引起死亡，而慢性感染有可能誘發(fā)肝硬化及肝癌。目前雖然可以通過疫苗預(yù)防乙肝病毒感染，但仍無有效的方法治療慢性乙肝疾病。替諾福韋(tenofovir)，化學名稱為[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基-乙氧基]甲基磷酸(PMPA)，是一種核苷酸類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，具有抗HBV和HIV；但是由于其含有磷酸基團，具有較大極性，生物膜穿透能力差，在生物體內(nèi)生物利用度差等缺點。為了克服這一缺點，可制成膦酸酯或者膦酰胺前藥形式。2002年由吉利德公司研發(fā)上市的藥物Viread(富馬酸替諾福韋二吡呋酯)為PMPA的一種前藥方式，制備成膦酸酯的前藥形式大大提高了生物利用度。Viread在治療HIV和HBV方面發(fā)揮了重要的作用。同時，該公司的另一個PMPA的前藥tenofoviralafenamide(TAF)與恩曲他濱/cobicistat/elvitegravir組成的復(fù)方(商品名Genvoya)已經(jīng)被FDA批準，用于治療HIV感染。tenofoviralafenamide單獨服用，用于治療HBV感染目前正處于臨床3期。本發(fā)明提供了一種新的PMPA前藥的水合物，可用于治療病毒感染性疾病，其中病毒感染性疾病包括HBV和HIV病毒引起的感染性疾病。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種化合物(I)的一水合物：本發(fā)明優(yōu)選方案，一種化合物(I)的一水合物，該化合物通過單晶衍射結(jié)構(gòu)分析確定屬于單斜晶系，空間群為P21，晶胞參數(shù)為α＝γ＝90°和β＝95.086(5)°，晶軸比a/b＝0.8391，b/c＝0.4076和c/a＝2.9237，Z＝2，本發(fā)明提供一種制備化合物(I)的一水合物的方法，該方法為將化合物(I)溶于乙腈和水的混合溶劑中，在適宜的溫度下，溶劑揮發(fā)即可制備得到化合物(I)的一水合物。本發(fā)明優(yōu)選方案，一種制備化合物(I)的一水合物的方法，該方法為將化合物(I)溶于乙腈和水的混合溶劑中，在適宜的溫度下，溶劑揮發(fā)即可制備得到化合物(I)的一水合物，所述適宜的溫度優(yōu)選10～30℃。本發(fā)明優(yōu)選方案，一種制備化合物(I)的一水合物的方法，該方法為將化合物(I)溶于乙腈和水的混合溶劑中，在適宜的溫度下，溶劑揮發(fā)即可制備得到化合物(I)的一水合物，乙腈和水的體積比為10:1至2:1，優(yōu)選10:1至1:1，更優(yōu)選5:1至1:1，進一步優(yōu)選4:1，適宜的溫度優(yōu)選10～30℃。本發(fā)明提供一種藥物組合物，所述藥物組合物含有治療有效劑量的上述任一項所述的化合物(I)的一水合物，以及藥學上可接受的載體或者賦形劑。本發(fā)明提供一種上述任一項所述的化合物(I)的一水合物或者其組合物在制備用于治療病毒感染性疾病的藥物上的應(yīng)用，所述的病毒感染性疾病優(yōu)選HBV和HIV引起的感染性疾病。除非有相反的陳述，在說明書和權(quán)利要求書中使用的術(shù)語具有下述含義。本發(fā)明所述基團和化合物中所涉及的元素碳、氫、氧、硫、氮或鹵素均包括它們的同位素情況，及本發(fā)明所述基團和化合物中所涉及的元素碳、氫、氧、硫或氮任選進一步被一個或多個它們對應(yīng)的同位素所替代，其中碳的同位素包括12C、13C和14C，氫的同位素包括氕(H)、氘(D，又叫重氫)、氚(T，又叫超重氫)，氧的同位素包括16O、17O和18O，硫的同位素包括32S、33S、34S和36S，氮的同位素包括14N和15N，氟的同位素19F，氯的同位素包括35Cl和37Cl，溴的同位素包括79Br和81Br。“藥物組合物”表示一種或多種文本所述化合物或其生理學/藥學上可接受的鹽與其他組成成分的混合物，其中其它組分包含生理學/藥學上可接受的載體和賦形劑。“載體”指的是不會對生物體產(chǎn)生明顯刺激且不會消除所給予化合物的生物活性和特性的載體或稀釋劑?！百x形劑”指的是加入到藥物組合物中以進一步依賴于化合物給藥的惰性物質(zhì)。賦形劑的實例包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖和不同類型的淀粉、纖維素衍生物(包括微晶纖維素)、明膠、植物油、聚乙二醇類、稀釋劑、成粒劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑等。附圖說明圖1為化合物(I)的一水合物單晶衍射譜圖。具體實施方式以下通過具體實施例詳細說明本發(fā)明的實施過程和產(chǎn)生的有益效果，旨在幫助閱讀者更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)和特點，不作為對本案可實施范圍的限定?；衔锏慕Y(jié)構(gòu)是通過核磁共振(NMR)或(和)質(zhì)譜(MS)來確定的。NMR位移(δ)以10-6(ppm)的單位給出。NMR的測定是用(BrukerAvanceIII400和BrukerAvance300)核磁儀，測定溶劑為氘代二甲基亞砜(DMSO-d6)，氘代氯仿(CDCl3)，氘代甲醇(CD3OD)，內(nèi)標為四甲基硅烷(TMS)。MS的測定用(Agilent6120B(ESI)和Agilent6120B(APCI))。HPLC的測定使用安捷倫1260DAD高壓液相色譜儀(ZorbaxSB-C18100×4.6mm)。薄層層析硅膠板使用煙臺黃海HSGF254或青島GF254硅膠板，薄層色譜法(TLC)使用的硅膠板采用的規(guī)格是0.15mm～0.20mm，薄層層析分離純化產(chǎn)品采用的規(guī)格是0.4mm～0.5mm。柱層析一般使用煙臺黃海硅膠200～300目硅膠為載體。本發(fā)明的己知的起始原料可以采用或按照本領(lǐng)域已知的方法來合成，或可購買于泰坦科技、安耐吉化學、上海德默、成都科龍化工、韶遠化學科技、百靈威科技等公司。氮氣氛是指反應(yīng)瓶連接一個約1L容積的氮氣氣球。氫氣氛是指反應(yīng)瓶連接一個約1L容積的氫氣氣球。氫化反應(yīng)通常抽真空，充入氫氣，反復(fù)操作3次。實施例中無特殊說明，反應(yīng)在氮氣氛下進行。實施例中無特殊說明，溶液是指水溶液。實施例中無特殊說明，反應(yīng)的溫度為室溫。室溫為最適宜的反應(yīng)溫度，為20℃～30℃。實施例1(2S)-2-[[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基-苯氧基-磷?；鵠氨基]丙酸硫代異丙酯一水合物(化合物1，光學純Rp-1)S-isopropyl(2S)-2-[[[(1R)-2-(6-aminopurin-9-yl)-1-methyl-ethoxy]methyl-phenoxy-phosphoryl]amino]propanethioatehydrate第一步：(S)-2-(叔丁氧基羰基)氨基丙酸硫代異丙酯(1B)(S)-S-isopropyl2-((tert-butoxycarbonyl)amino)propanethioate將N-叔丁氧基羰基-L-丙氨酸(1A)(5g,26.4mmol)溶解于四氫呋喃(40mL)中，加入N,N'-羰基二咪唑(CDI)(4.7g，29.1mmol)，室溫攪拌2小時。加入硫代異丙醇(6.2g,79.3mmol)，室溫反應(yīng)過夜。加入4mol/L的氫氧化鈉溶液(30mL)，用二氯甲烷(50mL×4)萃取，合并有機層，無水硫酸鈉干燥，濃縮，殘留物用硅膠柱分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v/v)＝1:0～9:1)，得標題化合物(S)-2-(叔丁氧基羰基)氨基丙酸硫代異丙酯(1B)，淺黃色液體(4g，產(chǎn)率61％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ3.61(m,1H),2.37–2.16(m,1H),1.46(s,9H),1.36(d,3H),1.30(d,6H)。第二步：(S)-2-氨基丙酸硫代異丙酯三氟乙酸鹽(1C)(S)-S-isopropyl2-aminopropanethioatetriflouroacetate將(S)-2-(叔丁氧基羰基)氨基丙酸硫代異丙酯(1B)(4g,16.2mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入三氟乙酸(10mL)，室溫攪拌4小時。減壓濃縮至干得粗品(S)-2-氨基丙酸硫代異丙酯三氟乙酸鹽(1C)(4g)，直接用于下一步。第三步：[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]苯氧基次磷酸(1E)[(1R)-2-(6-aminopurin-9-yl)-1-methyl-ethoxy]methyl-phenoxy-phosphinicacid氮氣保護下將[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]磷酸(即PMPA)(1D)(5g,17.4mmol)加到三頸瓶中，加入乙腈(40mL)，三乙胺(3.5g,34.8mmol),4-二甲氨基吡啶(即DMAP)(2.1g，17.4mmol)和亞磷酸三苯酯(8.1g，26.1mmol)加完后，加熱至內(nèi)溫80℃反應(yīng)兩天。將反應(yīng)液減壓濃縮除去乙腈，向殘留物中加入乙酸乙酯(10mL)和水(15mL)，分液，水層用乙酸乙酯(10mL×2)萃取，合并水層，水層用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至3，室溫攪拌10分鐘，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至2，冰水冷卻至10℃攪拌兩小時后靜置過夜，過濾，濾餅用水(10mL)洗滌，收集濾餅，烘干標題化合物[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]苯氧基次磷酸(1E)，(3.5g，產(chǎn)率56％)。1HNMR(400MHz,DMSO)δ8.16(s,1H),8.14(s,1H),7.55(s,2H),7.32–7.25(m,2H),7.09(m,3H),4.30(dd,1H),4.19(dd,1H),3.97(m,1H),3.87–3.69(m,2H),1.05(d,3H)。31PNMR(400MHz,DMSO)δ16.66。第四步：[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]苯氧基磷酰氯(1F)9-[(2R)-2-[[chloro(phenoxy)phosphoryl]methoxy]propyl]purin-6-amine將[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]苯氧基次磷酸(1E)(2g，5.5mmol)懸浮于乙腈(20mL)中，加入氯化亞砜(2.6g，22.0mmol)加熱至內(nèi)溫85℃反應(yīng)4小時，將反應(yīng)液減壓濃縮，得粗品直接用于下一步。第五步：(2S)-2-[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]苯氧基磷酰氨基丙酸硫代異丙酯(1G)(光學純Rp-1)S-isopropyl(2S)-2-[[[(1R)-2-(6-aminopurin-9-yl)-1-methyl-ethoxy]methyl-phenoxy-phosphoryl]amino]propanethioate將(S)-2-氨基丙酸硫代異丙酯三氟乙酸鹽(1C)(4g,16.2mmol)溶于干燥的二氯甲烷(20mL)中，氮氣保護下，干冰-乙醇冷卻至-50℃，滴加三乙胺(5mL，35.8mmol)攪拌10分鐘，滴加[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]苯氧基磷酰氯(1F)(2.1g，5.5mmol)的二氯甲烷(20mL)懸濁液，完成后，自然升溫至室溫反應(yīng)1小時。向反應(yīng)液中加入水(20mL)，分液，有機層用水(10mL)洗滌一次，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，將殘留物溶于乙酸乙酯(50mL)中，冰浴冷卻下用4mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至2，分液，水層用乙酸乙酯(20mL)萃取，取水層，加入二氯甲烷(50mL)，冰浴冷卻下滴加飽和碳酸氫鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至8，分液，水層用二氯甲烷(20mL)萃取，合并有機層，飽和氯化鈉(10mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，得(2S)-2-[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]苯氧基磷酰氨基丙酸硫代異丙酯(1G)的兩種非對映異構(gòu)體混合物(300mg，產(chǎn)率11％)，將該混合物采用HPLC拆分得到1G(光學純Rp-1)),化合物1G為HPLC拆分后的峰1。分離分析方法：儀器，TharanalyticalSFC；柱，ChiralPakAS-H,250×4.6mm；流動相，A為CO2以及B為Methanol(0.05％DEA)；梯度，B40％；流量，2.4mL/min；背壓，100bar；柱溫，35℃；波長，220nm。制備分離方法：儀器，MGⅡpreparativeSFC；柱，ChiralPakAS-H,250×30mmI.D.；流動相，A為CO2以及B為Methanol；梯度，B40％；流量，40mL/min；背壓，100bar；柱溫38℃；波長，220nm；周期，5.5min。樣品制備:1G的兩種非對映異構(gòu)體混合物(300mg)溶解于甲醇中，制得樣品濃度10mg/mL的溶液，進樣3mL/每針，分離后得到兩個光學異構(gòu)體化合物，其中峰1為化合物1G(保留時間：2.21min，106mg，白色固體，ee％＝100％)，峰2為化合物1G的非對映異構(gòu)體1G’(保留時間：3.82min，109mg，白色固體，ee％＝100％)?；衔?G1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.31(s,1H),8.01(s,1H),7.32(t,2H),7.21–7.11(m,3H),6.04(s,2H),4.47(dd,1H),4.21–4.13(m,1H),4.13–4.06(m,1H),4.06–3.96(m,2H),3.69(dd,1H),3.54–3.39(m,2H),1.28–1.17(m,12H)。31PNMR(162MHz,CDCl3)δ23.15。LC-MSM/Z(ESI):493.1[M+1]。化合物1G的非對映異構(gòu)體1G’1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.35(s,1H),7.97(s,1H),7.25–7.17(m,2H),7.13–7.05(m,1H),7.03–6.95(m,2H),5.90(s,2H),4.34(dd,1H),4.16–4.03(m,2H),3.99–3.89(m,2H),3.84(t,1H),3.76–3.52(m,2H),1.33–1.20(m,12H)。31PNMR(162MHz,CDCl3)δ22.12。LC-MSM/Z(ESI):493.1[M+1]。第六步：(2S)-2-[[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基-苯氧基-磷酰基]氨基]丙酸硫代異丙酯一水合物(化合物1，光學純Rp-1)S-isopropyl(2S)-2-[[[(1R)-2-(6-aminopurin-9-yl)-1-methyl-ethoxy]methyl-phenoxy-phosphoryl]amino]propanethioatehydrate取約5mg(2S)-2-[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]苯氧基磷酰氨基丙酸硫代異丙酯(1G)(光學純Rp-1))放于玻璃小瓶中，用乙腈(1.6mL)及水(0.4mL)超聲溶清，室溫下小孔揮發(fā)，得到塊狀晶體，即為(2S)-2-[[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基-苯氧基-磷?；鵠氨基]丙酸硫代異丙酯一水合物(化合物1，光學純Rp-1)。實施例2：化合物1(光學純Rp-1)單晶X-射線結(jié)晶學測量(圖1所示)1.儀器信息和檢測方法參數(shù)2單晶結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)3.化合物1(光學純Rp-1)原子坐標(x104)、等效各向同性位移參數(shù)和U(eq)U(eq)定義為正交化Uij張量軌跡的三分之一(U(eq)isdefinedasonethirdofthetraceoftheorthogonalizedUijtensor)4.化合物1(光學純Rp-1)氫原子坐標(x104)、等效各向同性位移參數(shù)和U(eq)5.化合物1(光學純Rp-1)各向異性位移參數(shù)各項異性位移因子指數(shù)采取如下形式:-2π2[h2a*2U11+...+2hka*b*U12]。生物測試例抗乙型肝炎病毒活性篩選用HepG2.2.15細胞測定化合物的抗乙肝病毒活性。使用的材料與儀器如下：HepG2.2.15細胞，RPMI1640培養(yǎng)液，胎牛血清，96孔板，DMSO，QIAamp96DNABloodKit，Cell-titerblue，酶標儀，AppliedBiosystems7900real-timePCRsystem。用DMSO將化合物1(光學純Rp-1)溶解至20mM，-20℃貯存，將化合物1(光學純Rp-1)的20mM貯存液用DMSO3倍梯度稀釋，共9個濃度。再用含2.0％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液稀釋200倍?；衔锏淖罡邷y試終濃度為100M。實驗步驟參照QIAamp96DNABloodKit(QIAGEN51161)說明書，qPCR法測定化合物抗乙肝病毒活性并計算EC50(半數(shù)有效抑制濃度)。分析數(shù)據(jù)和計算抑制百分比：應(yīng)用如下公式計算抑制百分比：抑制率(％)＝(DMSO對照組的HBV總量-受試樣品組的HBV總量)/DMSO對照組的HBV總量×100。最后使用GraphPadPrism軟件計算化合物的EC50值。Cell-titerblue法測定化合物的細胞毒性并計算CC50(致50％細胞毒性濃度)。分析數(shù)據(jù)和計算相對細胞活力：應(yīng)用如下公式計算細胞活性百分比：細胞生存率(％)＝(受試樣品的熒光數(shù)值-背景熒光數(shù)值)/(DMSO對照組的熒光數(shù)值-背景熒光數(shù)值)×100。最后使用GraphPadPrism軟件計算化合物的CC50值。結(jié)果如下表所示：化合物編號EC50(nM)CC50(μM)化合物1(光學純Rp-1)8>100當前第1頁1 2 3