本發(fā)明屬于植物分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及一種水稻抗白背飛虱的新基因Wbph9(t)及其分子標記和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

白背飛虱是水稻生產(chǎn)上的一種重要害蟲，不僅直接危害水稻，還在取食過程中傳播其他病害和病毒，嚴重威脅我國水稻的安全生產(chǎn)。發(fā)掘和鑒定新的抗蟲基因，選育抗蟲品種是最經(jīng)濟有效的防治手段。水稻抗白背飛虱基因的定位研究，僅有少數(shù)報道。McCouch等(1991)檢測到與Wbph1共分離的RFLP標記RG146和RG445，但RG146和RG445是多拷貝標記，且未檢測到其他多態(tài)性標記，Wbph1在哪條染色體上仍不清楚。劉志巖等(2001)將Wbph2定位于水稻第6染色體上，篩選到與該基因連鎖的RFLP標記RZ667、RG264和RG64，它們與抗蟲基因的遺傳圖距分別為25.6cM、36.4cM和27.8cM。Wbph6被定位到水稻第11條染色體的短臂上，與標記RM167的遺傳距離為21.2cM(Li et al.,2004)。Yamasaki等(2003)將對于殺卵反應(yīng)是必需的主效基因Ovc定位于第6條染色體短臂上，與標記RM1954連鎖。Tan等(2004)從高抗白背飛虱的藥用野生稻衍生系B5中鑒定了2個新的抗白背飛虱新基因Wbph7(t)和Wbph8(t)，這2個基因分別定位于第3條染色體R1925-G1318之間1.1cM區(qū)域和第4條染色體R288-S1118之間0.3cM區(qū)域，分別與在該材料上鑒定的2個抗褐飛虱基因Bph14和Bph15位于同一區(qū)間。

白背飛虱抗性除受主效基因控制外，在某些水稻品種中還含有微效基因控制的抗性。具有微效基因的品種通過其對主效基因的修飾，在抗蟲性中起著重要作用。國內(nèi)外科學(xué)家在不同水稻品種中已檢測到一些抗白背飛虱QTL位點。Kadirvel等(1999)比較IR64/Azueena的DH群體在白背飛虱侵染和不侵染情況下幼苗期葉片和根干重的差異，發(fā)現(xiàn)在第11條染色體RG103-RG167上有顯著的抗性QTL。在對該群體進一步的深入發(fā)掘發(fā)現(xiàn)(Geethanjali et al.,2009)，1個顯著抗白背飛虱的QTL位于第7條染色體RG511和RG477之間，另外還檢測到3個與白背飛虱抗性顯著相關(guān)的區(qū)域，分別位于第1條染色體W1和pMRF1之間、第2條染色體XLRfrI7和RG157之間以及第7條染色體RG711和CDO418之間。Kadirvel等(2003)從Basmati370和ASD16雜交后代中定位了6個抗白背飛虱的QTL位點，有3個在第7條染色體上，另外3個分別在第3、5和12條染色體上。Sogawa等(2001)利用一個雙單倍體(Doubled-haploid，DH)群體定位了2個與殺卵反應(yīng)有關(guān)的QTL，一個位于第6條染色體上的RFLP標記CT201和RZ450之間，另一個位于第11條染色體標記RG167與CT442之間。

Yamasaki等(2003)通過近等基因系(Near-isogenic lines，NILs)，重復(fù)檢測到位于第6條染色體對白背飛虱卵具有強作用力的主效基因Ovc，另外又檢測到4個QTL，分別位于第1、4、5、5條染色體上。

寒川一成等(2003b)應(yīng)用窄葉青/京系17的DH群體檢測到1個影響蜜露分泌的微效QTL，10個與殺卵作用相關(guān)QTL，其中2個殺卵主效QTL qOVC-6a和qOVC-6b分別位于第6條染色體短臂上相鄰的CT201-RZ450和CT115-CT506區(qū)間，其貢獻度分別為25.7％和29.6％。寒川一成等(2003a)發(fā)現(xiàn)粳稻品種春江06對白背飛虱同時具有拒食抗性和殺卵抗性，分析春江6號和感蟲品種TN1的DH群體，檢測到4個與遷入密度相關(guān)的QTL(qIMG)，分別位于第2、3、4和11條染色體上；5個影響蜜露分泌的QTL(qHND)，分別位于第2、3和4條染色體；4個與蟲卵堆積相關(guān)的QTL(qEGN)，分別位于第2、3和4條染色體上。在這些QTL中，qIMG-4、qHND-4和qEGN-4的貢獻度分別為78.4％、71.7％和58.7％，都定位于春江06第4條染色體RM401-RM335區(qū)域，可能指向了同一個抗性基因(Sogawa et al.,2005)。進一步精細定位將2個主效QTL qSI-4和qOVI-6分別定位在水稻第4和第6條染色體上，這分別解釋了春江06的70％和60％以上的拒食抗性和殺卵抗性(Sogawa et al.,2009)。Chen等(2010)利用東鄉(xiāng)野生稻與栽培稻構(gòu)建的一個染色體片段代換系(Chromosome segment substitution lines，CSSLs)檢測到3個抗白背飛虱的QTL，分別是：qWbph2位于第2條染色體RM1285和RM555之間，qWbph5位于第5條染色體RM3870和RZ70之間，qWbph9位于第9條染色體RG451和RM245之間，其中qWbph9表現(xiàn)最穩(wěn)定，且貢獻率最大，已適合進行分子標記輔助選擇(Marker-assisted selection，MAS)育種。

在前期研究中，我們利用小粒野生稻與栽培稻IR24雜交、回交，結(jié)合胚拯救和分子標記輔助選擇技術(shù)，構(gòu)建了一套小粒野生稻導(dǎo)入系，通過抗白背飛虱鑒定，篩選獲得了高抗白背飛虱且農(nóng)藝性狀穩(wěn)定的水稻品系K41。為了挖掘K41中的抗性基因及其緊密連鎖的分子標記，本發(fā)明分別以感蟲品種桂1025為母本，以抗蟲品系K41為父本雜交，得到的F₁再自交，從而構(gòu)建了F₂分離群體，每個F₂單株通過自交獲得相應(yīng)的F_2:3家系，300個F₂單株采用單粒傳法，通過連續(xù)自交獲得重組自交系群體(RILs，F(xiàn)₇)。用親本間有多態(tài)性的SSR標記分析F₂單株的基因型，同時結(jié)合相應(yīng)的F₃家系的的平均抗蟲級別進行QTL定位。結(jié)果表明在第6號染色體長臂RM340和RM5604間存在一個主效的QTL位點，LOD值為20.5，抗性貢獻率為33.6％，暫命名為Wbph9(t)。為了尋找與Wbph9(t)連鎖更精密的標記，用RM340和RM5604篩選了6000個F₃單株。進一步利用這些多態(tài)性引物檢測篩選獲得了52個重組單株的基因型，結(jié)合其抗性鑒定結(jié)果，最后將Wbph9(t)定位于MG11和MG32之間，并與標記MG21精密連鎖，參考日本晴基因組序列可知，MG11和MG32之間的物理距離約120kb。

在將該抗性基因雜交轉(zhuǎn)育到其它材料后，利用分子標記MG21檢測抗性基因存在的準確率均達到98％以上，因此，利用兩者之間的分子標記MG21來鑒定Wbph9(t)的存在具有非常高的效率，這樣也大大提高了抗白背飛虱水稻品種的育種進度。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對上述研究背景，利用高抗白背飛虱的品種K41與髙感白背飛虱的品種桂1025雜交獲得的F_2:3家系群體及重組自交系群體，通過抗性鑒定和遺傳分析，精細定位了水稻第6號染色體上的一個水稻抗白背飛虱基因Wbph9(t)，獲得與之緊密連鎖的基于PCR擴增的實用經(jīng)濟型分子標記。該標記可以預(yù)測水稻材料是否對白背飛虱具有抗性，提高抗白背飛虱水稻品種的選擇效率。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

一種水稻抗白背飛虱基因Wbph9(t)，在水稻基因組第6號染色體28,200,000-28,700,000bp的區(qū)間內(nèi)存在一個與水稻抗白背飛虱相關(guān)的基因位點，抗蟲品種K41在該位點上的等位基因能顯著提高水稻材料對白背飛虱的抗性。

本發(fā)明還提供了一種上述水稻抗白背飛虱基因Wbph9(t)緊密連鎖的分子標記，所述的水稻抗白背飛虱基因Wbph9(t)的分子標記為MG11、MG21和MG32。

作為優(yōu)選，分子標記MG11是由下列引物對經(jīng)PCR擴增獲得：GM11的引物對的上游引物為Seq ID No.1所示的序列，引物對的下游引物為Seq ID No.2所示的序列。

作為優(yōu)選，分子標記MG21是由下列引物對經(jīng)PCR擴增獲得：GM21的引物對的上游引物為Seq ID No.3所示的序列，引物對的下游引物為Seq ID No.4所示的序列。

作為優(yōu)選，分子標記MG32是由下列引物對經(jīng)PCR擴增獲得：GM32的引物對的上游引物為Seq ID No.5所示的序列，引物對的下游引物為Seq ID No.6所示的序列。

本發(fā)明還提供了所述的水稻抗白背飛虱基因Wbph9(t)或所述的分子標記在水稻育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了所述的水稻抗白背飛虱新基因Wbph9(t)的供體材料K41或供體材料K41攜帶抗白背飛虱新基因Wbph9(t)的衍生材料及其它具有抗白背飛虱基因Wbph9(t)的材料。

本發(fā)明還提供了所述的水稻抗白背飛虱新基因Wbph9(t)的受體材料，包括稻屬所有材料，即栽培稻和野生稻。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備如下有益效果：

(1)本發(fā)明鑒定到第6號染色體上的抗白背飛虱新基因Wbph9(t)及可以對其進行基因型鑒定的共顯性分子標記，與目前報道的影響粒重的基因Wbph1、Wbph2、Wbph3、Wbph4、Wbph5、Wbph6、Wbph7(t)、Wbph8(t)、Ovc、qSI-4、qOVI-6、qWbph2、qWbph5和qWbph9都不同，Wbph9(t)是源于小粒野生稻基因滲入系K41的一個抗白背飛虱的新基因位點。

(2)本發(fā)明通過對水稻抗白背飛虱新基因Wbph9(t)分子標記的篩選，能夠獲得對白背飛虱抗性水平顯著提高水稻新品種。

(3)本發(fā)明的水稻抗白背飛虱新基因Wbph9(t)分子標記可用于苗期育種群體的基因型選擇，有效的鑒別抗白背飛虱的個體，便于及時雜交選育，加快育種進程。

附圖說明

圖1為水稻品系K41攜帶的抗白背飛虱主效基因Wbph9(t)在第6號染色體長臂上與分子標記MG21的緊密連鎖關(guān)系(其中：A-Wbph9(t)的初步定位；垂直線表示第6號染色體；水平短線表示染色體上的分子標記；括號內(nèi)的數(shù)值表示標記間的物理距離(Mb)；B-Wbph9(t)的精細定位；Wbph9(t)定位于MG11和MG32之間120kb的區(qū)間，分子標記MG21與抗性基因緊密連鎖。n表示篩選的F₃重組單株總數(shù))；

圖2為分子標記MG21在不同水稻材料中擴增產(chǎn)物的電泳檢測帶型；其中：1-Marker；2-K41；3-桂1025；4-35為K41和桂1025雜交育種后代單株。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和本質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

以下實施例中使用的試劑、試劑盒和儀器均可由市售獲得，實施例中使用的方法如果沒有作特別說明的，與常規(guī)使用的方法一致。

實施例1：分子標記的獲得

(一)桂1025/K41 F₂家系群體和RILs的構(gòu)建及表型鑒定

1、在前期研究中，我們利用小粒野生稻與栽培稻IR24雜交、回交，結(jié)合胚拯救和分子標記輔助選擇技術(shù)，構(gòu)建了一套小粒野生稻導(dǎo)入系，通過抗白背飛虱鑒定，篩選獲得了高抗白背飛虱且農(nóng)藝性狀穩(wěn)定的水稻品系K41。為了挖掘K41中的抗性基因及其緊密連鎖的分子標記，本發(fā)明分別以感蟲品種桂1025為母本，以抗蟲品系K41為父本雜交，得到的F₁再自交，從而構(gòu)建了F₂分離群體，每個F₂單株通過自交獲得相應(yīng)的F_2:3家系，300個F₂單株采用單粒傳法，通過連續(xù)自交獲得重組自交系群體(RILs，F(xiàn)₇)。

2、采用苗期接蟲處理，對親本、F_2:3家系和RILs進行抗蟲鑒定。為確保親本、F_2:3家系和RILs中每個材料生長一致，所有供試材料在播種前分別浸種催芽。每個材料各50粒種子播于一個長45cm，寬35cm，高8cm，且盛有5cm厚營養(yǎng)土的鐵質(zhì)托盤中。每個盤每個材料播2個重復(fù)，其中隨機播種親本和TN1(感蟲對照)各2個重復(fù)。播種7天后間苗，淘汰病弱苗。待苗長到兩葉一芯期時，按8頭/苗的比例接種2-3齡白背飛虱若蟲，最后罩上尼龍紗網(wǎng)。當(dāng)感蟲對照TN1全部死亡時，參照寒川一成等(2003b)的方法對每個單株進行0、1、3、5、7或9級的抗性評價(參見表1)，對每份材料通過加權(quán)平均計算該材料的抗性級別，上述抗蟲鑒定重復(fù)兩次，取平均值作為該材料的抗性級別，并推測其基因型。

表1水稻苗期抗白背飛虱鑒定的分級標準

(二)桂1025/K41F₂群體的分子標記分析

1、利用CTAB法(Murray and Thompsom,1980)提取親本及F₂群體各單株的葉片基因組DNA。

2、根據(jù)Gramene網(wǎng)站(http://www.gramene.org/)公布的SSR標記按照較均勻的遺傳距離選擇一定數(shù)目的分子標記。另外，基于該基因最后的定位區(qū)段，參考水稻品種日本晴相應(yīng)的基因組序列，利用SSR搜索工具SSRIT (http://www.gramene.org/db/marker/ssrtool)來尋找SSR基序，并根據(jù)其側(cè)翼序列設(shè)計引物，為備選標記。其中，SSIT設(shè)置參數(shù)為：最小基序長度為3聚體，最小重復(fù)數(shù)為5，搜素所有的SSR基序。選擇所有大于15堿基(基序長度×重復(fù)數(shù))的SSR基序，最后基于該基因最后定位區(qū)段，比較該區(qū)段在水稻品系9311及日本晴相應(yīng)的基因組序列，在兩者具有差異的區(qū)段設(shè)計STS標記用于精細定位。

3、DNA提取、PCR擴增及凝膠電泳

參考Temnykh等(2000年)的DNA提取方法，對個單株分別提取基因組DNA。

PCR擴增體系采用10μL的反應(yīng)體系，模板DNA 10ng，正向、反向引物各0.8μmol，10×PCR緩沖液1μL，dNTPs 0.2mmol，Taq DNA聚合酶0.25U，用ddH2O補齊至10μL。PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃50s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物在6％聚丙烯酰胺變性凝膠和銀染顯色法進行檢測，或采取本領(lǐng)域已知的常規(guī)檢測技術(shù)。

4、根據(jù)F₂單株的抗蟲級別，分別選擇15個極端抗蟲單株和15個極端感蟲單株的葉片基因組DNA混合構(gòu)建抗、感池。利用在親本間有多態(tài)性的引物分別篩選抗感DNA池，獲得有多態(tài)性的分子標記，該類多態(tài)性標記很可能與抗性基因是連鎖的。然后，選擇連鎖標記所在染色體上在親本間有多態(tài)性引物篩選F₂分離群體的各個單株，獲得群體基因型數(shù)據(jù)。根據(jù)連鎖交換規(guī)律，通過軟件JoinMap 3.0，利用群體基因型數(shù)據(jù)構(gòu)建水稻部分遺傳圖譜，并獲得各分子標記的遺傳距離。最后，結(jié)合F₂群體各個單株的基因型數(shù)據(jù)和相應(yīng)的白背飛虱抗性鑒定的抗蟲級別，利用軟件NetWork QTL 3.0對目標染色體進行QTL位點掃描。

(三)利用分子標記篩選桂1025/K41和Lemont/K41的F₃重組單株精細定位Wbph9(t)

根據(jù)QTL的定位結(jié)果，利用初步定位兩側(cè)的SSR標記RM340和RM5604篩選F₃單株，獲得在兩標記間發(fā)生重組的單株。同時在初步定位區(qū)段內(nèi)篩選更多在親本間具有多態(tài)性的引物，結(jié)合重組單株的基因型和表型，考察標記與抗蟲表型共分離的情況。

(四)結(jié)果與分析

苗期集團法接蟲鑒定結(jié)果表明：K41和桂1025的平均抗蟲級別分別為2.9和9.0，說明K41高抗白背飛虱而桂1025高感白背飛虱。190個F_2：3家系對白背飛虱的平均抗蟲級別的頻率分布呈連續(xù)分布，最小值為1.8，最大值為9.0。重組單株的基因型和相應(yīng)家系的平均抗蟲級別見圖2。

用親本間有多態(tài)性的SSR標記分析F₂單株的基因型，同時結(jié)合相應(yīng)的F₃家系的的平均抗蟲級別進行QTL定位。結(jié)果表明在第6號染色體長臂RM340和RM5604間存在一個主效的QTL位點，LOD值為20.5，抗性貢獻率為33.6％。

分子標記RM340和RM5604在測序的粳稻品種日本晴基因組序列中的物理距離約0.5Mb，為了尋找與Wbph9(t)連鎖更精密的分子標記，本發(fā)明用RM340和RM5604篩選了6000個F₃單株。同時在初步定位區(qū)段內(nèi)篩選更多在親本間具有多態(tài)性的引物。進一步利用這些多態(tài)性引物檢測篩選獲得了52個重組單株的基因型，結(jié)合其抗性鑒定結(jié)果，最后將Wbph9(t)定位于MG11和MG32之間，并與標記MG21精密連鎖(圖1)，參考日本晴基因組序列可知，MG11和MG32之間的物理距離約120kb。在將該抗性基因雜交轉(zhuǎn)育到其它材料后，利用分子標記GM21檢測抗性基因存在的準確率均達到98％以上(圖2)，因此，利用兩者之間的分子標記GM21來鑒定Wbph9(t)的存在具有非常高的效率，這樣也大大提高了抗白背飛虱水稻品種的育種進度。

實施例2：分子標記的驗證

(一)材料與方法

陰性品種：30份，感蟲品系桂1025、Lemont、TN1均為本實驗室保存的常規(guī)水稻材料，桂1025/K41雜交組合后代中感蟲家系27份。

陽性品種：30份，抗蟲品系K41、桂1025/K41雜交組合后代中抗蟲家系29份。

GM21的引物對的上游引物為Seq ID No.3所示的序列，引物對的下游引物為Seq ID No.4所示的序列；

Seq ID No.3：AAAGAGATTTATAATCCAAATTTTGGCCA；

Seq ID No.4：GCCAAAGTAATTTAGGCCTGA。

DNA提取方法和分子標記的分析方法同實施例1。

(二)結(jié)果

用上述方法，分別對水稻品系K41、桂1025、Lemont、TN1等60份不同樣本的基因組DNA進行PCR擴增。

結(jié)果表明，在陽性樣本中均能擴增出相應(yīng)的片段，而在陰性樣本中均不能擴增出這些片段。由此說明，本發(fā)明提供的分子標記方法能夠準確篩選出含有抗白背飛虱主效基因的樣本，從而顯著提高抗白背飛虱水稻材料的選擇效率。

前述對本發(fā)明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進行很多改變和變化。對示例性實施例進行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書及其等同形式所限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所

<120> 一種水稻抗白背飛虱基因Wbph9（t）及其分子標記和應(yīng)用

<130> ZYWS

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgcagtcatc aattttatac cagcgagct 29

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cacagagtgg tagatttggg a 21

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaagagattt ataatccaaa ttttggcca 29

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gccaaagtaa tttaggcctg a 21

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccgctcgagt cctctgga 18

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atcaagcacc aaactggaca tctgaatat 29