本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種茶樹MYB轉(zhuǎn)錄因子CsAN1及其在調(diào)控花青素代謝中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：茶葉是世界上最重要的無酒精飲料之一，其富含茶多酚、茶氨酸、咖啡堿及多種類黃酮類物質(zhì)等，這些物質(zhì)賦予了茶葉醫(yī)療保健的重要功效。中國是茶葉的生產(chǎn)大國，種植茶葉是目前很多山區(qū)經(jīng)濟(jì)的重要來源，茶葉也是我國出口創(chuàng)匯的重要農(nóng)產(chǎn)品。高花青素含量的茶葉不僅能更直接的為飲茶者帶來多重的保健功效，其紫化葉片特征使其具備了極高的觀賞價(jià)值，在觀光茶園中有著大規(guī)模的應(yīng)用。茶樹紫化芽葉形成的分子機(jī)制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義及廣泛的利用價(jià)值?；ㄇ嗨厥侵参锝缰凶畲蟮乃苄陨丶易?，也是類黃酮類家族中的一員?，F(xiàn)已知的花青苷有20多種，植物中常見的有6種，即矢車菊色素（Cyanidin）、飛燕草色素（Delphidin）、天竺葵色素（Pelargonidin）、芍藥色素（Peonidin）、牽?；ㄉ兀≒etunidin）和錦葵色素（Malvidin）?；ㄇ嗨貎?chǔ)存在植物的液泡中，是根、莖、葉、花、果實(shí)和種子等這些植物組織顯示紫色、紅色及藍(lán)色的主要原因（Koesetal.，2005；Tanakaetal.，2008）?；ㄇ嗨貙χ参锏纳L代謝具有非常重要的作用，如吸引昆蟲授粉和幫助種子傳播等。在植物體內(nèi)，花青素還充當(dāng)著響應(yīng)生理和環(huán)境變化的保護(hù)機(jī)制，有利于植物應(yīng)對各種生物和非生物脅迫（Xuetal.，2015；Zhouetal.，2014）。由于花青素具有多種的生物學(xué)活性，其在人類醫(yī)療保健方面也扮演著重要的角色?；ㄇ嗨厥且环N天然的抗氧化劑，能夠保護(hù)人體免受自由基等有害物質(zhì)的傷害，在增強(qiáng)血管彈性、預(yù)防心腦血管疾病、保護(hù)肝臟等方面有著重要的作用。最新的流行病學(xué)研究數(shù)據(jù)表明：花青素可能具有持久的保健功效并且能減少慢性疾病的發(fā)病機(jī)率（Trakaetal.，2011）。Espley（2014）等用高花青素的玉米，番茄和蘋果對小動(dòng)物進(jìn)行喂養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果表明：這些高花青素的食物對小動(dòng)物的成長顯示出有益作用。此外，花青素作為一種天然無害色素，在食品色素開發(fā)中有著廣泛的應(yīng)用前景。目前，食品加工中所用的色素多為合成色素，有著不同程度的毒性，長期食用會(huì)危害人體健康。隨著人們對食品安全關(guān)注度的提高，花青素這種植物中存在的天然色素越來越引起科研領(lǐng)域的關(guān)注。因此，高花青素含量的食物選育成為植物學(xué)家研究的熱門主題。茶樹是起源于我國的一種重要的木本植物，也是目前我國大部分山區(qū)主要栽培的經(jīng)濟(jì)作物之一。在生產(chǎn)栽培上，紅紫化是茶樹葉片較為常見的性狀之一，除了某些特異茶樹資源新梢芽葉常年呈紫紅色外（如“紫娟”），其他一些茶樹品種在春秋季節(jié)受生長發(fā)育狀態(tài)、光照、溫度等因素的影響，其幼嫩芽葉也會(huì)出現(xiàn)不同程度的紫化現(xiàn)象，進(jìn)一步的理化分析表明紫色芽葉往往花青素含量較高（季鵬章等，2010；李雙伶等，2009；蕭力爭等，2009）。過去認(rèn)為，茶葉中的花青素含量的高低與茶葉品質(zhì)呈負(fù)相關(guān)，含有紫色的芽葉不宜來制作綠茶。但隨著花青素的分子組成、生物化學(xué)功能、醫(yī)學(xué)價(jià)值的發(fā)現(xiàn)，茶葉中的花青素成為一個(gè)研究熱點(diǎn)之一。Lv等（2015）對“紫娟”的花青素成分進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)：“紫娟”主要含有8種花青素，其中矢車菊-3-O-半乳糖（cyanidin-3-O-galactoside）的含量最高。高花青素的積累使“紫娟”具備了強(qiáng)抗氧化活性。馬春雷等（2012）利用基因芯片技術(shù)對紫芽和綠芽進(jìn)行分析，篩選到43個(gè)差異表達(dá)基因，這些基因主要參與能量代謝、次生代謝和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等；并且克隆了2個(gè)茶樹轉(zhuǎn)錄因子基因CsMYB1（登錄號(hào)：HQ660373）和CsMYB2（登錄號(hào)：HQ660374）的基因全長，用熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)：CsMYB2在葉片的表達(dá)量是根的100多倍，遮陰處理顯著提高茶樹花青素的含量，這時(shí)CsMYB1的表達(dá)量也增加。陳林波等（2012）利用cDNA-AFLP技術(shù)對“紫娟”幼嫩葉片和成熟葉片的基因表達(dá)進(jìn)行分析，篩選到59個(gè)差異表達(dá)基因，在幼嫩紫色部位上調(diào)表達(dá)的有26個(gè)片段，33個(gè)下調(diào)表達(dá)，這些基因主要有代謝相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)蛋白及一些假設(shè)蛋白。最近，周瓊瓊等（2015）研究發(fā)現(xiàn)：茶樹中9個(gè)花青素合成途徑關(guān)鍵酶基因PAL、C4H、CHS、CHI、F3H、F3'H、F3'5'H、DFR和ANS在幼嫩紫葉中均呈上調(diào)表達(dá)。紫外光、低溫以及缺氮的環(huán)境條件有利于茶樹花青素的積累，這主要是通過誘導(dǎo)花青素合成關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，從而影響花青素的積累（李智，2014）。目前，對“紫娟”茶樹芽、第二葉、開面葉、成熟葉四個(gè)時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組測序也已經(jīng)完成，這將為可為研究茶樹紫色基因的遺傳育種奠定基礎(chǔ)（陳林波等，2015）。上述研究雖然對茶樹花青素的代謝研究進(jìn)行了初步探討，但是茶樹花青素代謝途徑轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制及花青素合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的作用機(jī)理尚不明確，有待于進(jìn)一步研究。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種茶樹MYB轉(zhuǎn)錄因子CsAN1基因。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述茶樹MYB轉(zhuǎn)錄因子CsAN1蛋白。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一對用于擴(kuò)增茶樹MYB轉(zhuǎn)錄因子CsAN1的引物。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述茶樹MYB轉(zhuǎn)錄因子CsAN1在調(diào)控植物花青素合成過程中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種含有上述茶樹MYB轉(zhuǎn)錄因子CsAN1的重組表達(dá)載體。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種含有上述茶樹MYB轉(zhuǎn)錄因子CsAN1的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。一種茶樹MYB轉(zhuǎn)錄因子CsAN1，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，最大開放閱讀框（編碼區(qū)）為765bp。上述茶樹MYB轉(zhuǎn)錄因子CsAN1，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。該序列有254個(gè)氨基酸，具有R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子的典型結(jié)構(gòu)特征，并且具備調(diào)控花青素合成轉(zhuǎn)錄因子特有的KPRPR[S/T]F結(jié)構(gòu)域（見圖1）。一對用于擴(kuò)增茶樹MYB轉(zhuǎn)錄因子CsAN1的引物，包括上下游引物，其核苷酸序列分別如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示。bHLH、MYB、WD40這三類蛋白，是參與花青苷合成的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。它們通過DNA序列的特異結(jié)合和蛋白-蛋白的相互作用，達(dá)到激活或者抑制靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而調(diào)控植物花青苷的合成。一般來說，轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控多個(gè)花青素合成途徑結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，從而很大程度影響花青素的合成。超表達(dá)花青素合成相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（一般為MYB家族），如：擬南芥的AtMYB75/PAP1，番茄的SlANT1，蘋果的MdMYB10和MdMYB110a，花椰菜的BoMYB2以及甜菜的BvMYB1等可以顯著的提高花青素的含量。與之相反的，如果MYB基因功能缺失或表達(dá)受到抑制，將會(huì)導(dǎo)致花青素在植物體內(nèi)不能正常的積累。上述茶樹MYB轉(zhuǎn)錄因CsAN1在調(diào)控植物花青苷合成過程中的應(yīng)用。一種重組表達(dá)載體，將SEQIDNO：1所示的茶樹MYB轉(zhuǎn)錄因子CsAN1與35S啟動(dòng)子連接后，連接到表達(dá)載體上。一種轉(zhuǎn)基因植株的制備方法，將SEQIDNO：1所示的茶樹MYB轉(zhuǎn)錄因子CsAN1與35S啟動(dòng)子連接后，連接到表達(dá)載體上得到含有CsAN1的重組載體；將重組載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物，即可得到轉(zhuǎn)基因植株。優(yōu)選地，所述植株為煙草。更優(yōu)選地，將含有CsAN1的重組載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物的同時(shí)，也將CsGL3和CsTTG1基因與CsAN1一起轉(zhuǎn)化植物。一種轉(zhuǎn)基因煙草的制備方法，包括如下步驟：（1）將SEQIDNO：1所示的茶樹MYB轉(zhuǎn)錄因子CsAN1與35S啟動(dòng)子連接后，連接到表達(dá)載體上得到含有CsAN1的重組載體，將重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組農(nóng)桿菌，向重組農(nóng)桿菌中加入等體積的含0.2mmol/L的乙酰丁香酮，10mM的MgCl2和10mM的MES滲透緩沖液，制備得到CsAN1的侵染液；（2）按照步驟（1）的方法分別制備CsGL3和CsTTG1的侵染液；（3）將CsAN1、CsGL3和CsTTG1的侵染液等體積混合后，打入煙草葉片的背面，恒溫培養(yǎng)10天即得轉(zhuǎn)基因煙草。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明獲得一種茶樹MYB轉(zhuǎn)錄因子CsAN1的核苷酸序列，并對其氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CsAN1具有R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域，并具有bHLH的結(jié)合位點(diǎn)和調(diào)控花青素合成的KPRPR[S/T]F結(jié)構(gòu)域。CsAN1連接了35S啟動(dòng)子后連接到pBI121載體，利用農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草，同時(shí)將該基因以及與其能形成復(fù)合物的基因CsGL3和CsTTG1分別轉(zhuǎn)化煙草，4天后可以觀察到葉片開始出現(xiàn)花青素，煙草葉片變紅，到第10天花青素積累含量達(dá)到最大值。對煙草葉片的花青素浸提后，通過分光光度計(jì)檢測到花青素含量顯著提高，通過HPLC檢測到矢車菊色素，（cyanidin-3-O-galactoside）和飛燕草色素（delphinidin-3-O-galactoside）兩種主要色素。附圖說明圖1為CsAN1氨基酸序列分析圖。圖2為CsAN1超表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。圖3為分別轉(zhuǎn)化了CsAN1、CsAN1+CsGL3和CsAN1+CsGL3+CsTTG1的煙草葉片的顯微結(jié)構(gòu)圖。圖4為對照煙草葉片、轉(zhuǎn)化CsAN1、CsAN1+CsGL3以及轉(zhuǎn)化CsAN1+CsGL3+CsTTG1超表達(dá)煙草葉片的花青素提取液圖。圖5為對照煙草葉片、轉(zhuǎn)化CsAN1以及轉(zhuǎn)化CsAN1+CsGL3+CsTTG1超表達(dá)煙草葉片的花青素含量圖。圖6為對照煙草葉片、轉(zhuǎn)化CsAN1超表達(dá)植株煙草葉片、CsAN1+CsGL3以及轉(zhuǎn)化CsAN1+CsGL3+CsTTG1煙草葉片的花青素HPLC圖。圖7為花青素合成途徑關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因在對照以及超表達(dá)煙草中的表達(dá)量情況圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。實(shí)施例1茶樹MYB轉(zhuǎn)錄因子CsAN1分離和克隆1、引物設(shè)計(jì)：本發(fā)明前期對茶樹“紫娟”的不同發(fā)育階段葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序（安諾優(yōu)達(dá)基因科技（北京）有限公司），在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中得到了CsAN1的全長，根據(jù)已知的序列全長設(shè)計(jì)擴(kuò)增CsAN1的特異引物：F：5’-TACTTATTCAGACAAACGCACAC-3’；R：5’-ATTTCAACTCTAATTTCAACCCA-3’；2、RNA的提?。翰捎肏ipurePlantRNAMiniKit（美基，廣州）提取茶樹“紫娟”頂芽，第二葉，第三、四葉混合樣以及老葉的總RNA，用核酸蛋白儀測定OD260/OD280和OD260/OD230值，判斷RNA的質(zhì)量和產(chǎn)量，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。3、cDNA第一鏈的合成cDNA的合成使用PrimeScript?1stStrandcDNASynthesisKit（TaKaRa，大連）進(jìn)行，具體步驟如下：（1）在無菌的PCR管配制以下體系：RNA2μgcDNAsynthesisPrimer1μLSMARTⅡOligonucleotide1μLRnase-freeH2OUpto5μL（2）混合樣品，72℃保溫2min。（3）短暫離心收集樣品于管底，保持試管于室溫。（4）加入下列試劑于反應(yīng)管中：5×First-StrandBuff2μLDTT1μL50×dNTPMix1μLScriptReverseTranscriptase1μL（5）混勻，用PCR儀42℃保溫30min（6）加入30μL的TE緩沖液（7）加熱試管85℃，7min（8）貯存于-20℃冰箱備用。4、PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃30s，60℃30s，72℃1min，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物連接到PMD19-T載體（購至TaKaRa），篩選陽性克隆并測序，獲所需基因全長，將其命名為CsAN1。序列分析發(fā)現(xiàn)：CsAN1的最大開放閱讀框?yàn)?65個(gè)堿基，如SEQIDNO:1所示，編碼254個(gè)氨基酸（如SEQIDNO:2所示），具有R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域，并具有bHLH的結(jié)合位點(diǎn)和調(diào)控花青素合成的KPRPR[S/T]F結(jié)構(gòu)域（見圖1）。實(shí)施例2茶樹MYB轉(zhuǎn)錄因子CsAN1超表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化1、超表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖如圖2所示，具體步驟為：以實(shí)施列1得到的陽性克隆PMD19T-CsAN1載體為模板，設(shè)計(jì)特異引物：pBI121-CsAN1-F:5’-GGACTCTAGAGGATCCATGGACATTGTTTGTTGTGT-3’，pBI121-CsAN1-R:5’-GACCACCCGGGGATCCTCATCATTCATCACCTAACA-3’，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。同時(shí)用BamHI（TaKaRa）酶切pBI121過表達(dá)載體使其線性化后，采用ClonExpress?IIOneStepCloningKit（南京諾唯贊生物科技有限公司）進(jìn)行連接。酶切體系：BamHI1μL+Buffer1μL+pBI121質(zhì)粒3μL+H2O補(bǔ)齊到10μL。置37℃水浴鍋酶切4h，之后轉(zhuǎn)到85℃水浴鍋中滅活20min。表1ClonExpress?IIOneStepCloningKit的連接體系ddH2OUpto20μl5×CEIIBuffer4μl線性化克隆載體50～200ng插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物20～200ngExnase?II2μl體系配制完成后，用移液器上下輕輕吹打幾次混勻各組分，避免產(chǎn)生氣泡(請勿劇烈震蕩或者渦旋混勻)。置于37℃反應(yīng)30min。待反應(yīng)完成后，立即將反應(yīng)管置于冰水浴中冷卻5min。之后，反應(yīng)產(chǎn)物可直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化；也可儲(chǔ)存于-20℃，待需要時(shí)解凍轉(zhuǎn)化。2、農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備（1）挑取農(nóng)桿菌GV3101（Agrobacteriumtumefaciens）單菌落，接種于10mLYEP培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)過夜；（2）取400μL菌液置于50mLYEP培養(yǎng)液中，28℃振蕩培養(yǎng)5～6h至OD600為0.5；（3）菌液倒入50mL離心管中，6000rpm離心5min后，棄上清液；（4）將菌體重懸于10mL0.15M的NaCl中，之后6000rpm離心5min，棄上清液；（5）菌體用lmL預(yù)冷的20mMCaCl2溶液輕輕懸浮，加入預(yù)冷的15%甘油，100μL分裝，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞（1）取-80℃保存的100μL農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞置冰上，完全解凍后輕輕將細(xì)胞懸?。唬?）加入5μL質(zhì)?；靹蚝蟊戏胖?0min；（3）將離心管放入液氮中速凍5min，37℃水浴中熱激1min，迅速將轉(zhuǎn)至冰上，冰浴2min；（4）加入1mLYEP液體培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)1h；（5）4000rpm離心5min，加100μLYEP培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞；（6）將菌液涂布于含有相應(yīng)抗生素的YEP平板上，28℃培養(yǎng)32～48h；（7）挑取長出的農(nóng)桿菌菌落于YEP液體培養(yǎng)基28℃搖菌24h，再用PCR對菌落進(jìn)行檢測，結(jié)果為陽性的說明表達(dá)載體構(gòu)建成功。4、制備侵染液（1）挑取陽性單克隆菌落到5mLYEP培養(yǎng)液中（含Kan+），28oC搖床180rpm活化培養(yǎng)18h～24h，直到菌液OD值達(dá)到0.6左右；（2）取步驟（1）中的1mL菌液接種到50mL的YEP培養(yǎng)液中（含Kan+），相同的條件在搖床進(jìn)一步擴(kuò)搖，待菌液OD值達(dá)到0.6左右；（3）于離心機(jī)中3000rpm，離心10min，收集菌體，加入等體積的滲透緩沖液（含0.2mmol/L的乙酰丁香酮，10mM的MgCl2和10mMMES）重懸浮菌體。5、轉(zhuǎn)化煙草葉片（1）本氏煙草點(diǎn)播于濕潤的營養(yǎng)土上，覆膜保濕至種子萌發(fā)，萌發(fā)的本氏煙草幼苗在20℃的光照培養(yǎng)箱（14h光照/10h黑暗）中培養(yǎng)2個(gè)星期后可用于侵染；（2）用1mL的無針頭注射器將上述的侵染液打入本氏煙草葉片的背面；同樣地，將CsEGL3和CsTTG1的侵染液分別與CsAN1侵染液等體積混合，配置CsAN1+CsEGL3和CsAN1+CsEGL3+CsTTG1侵染液，以相同的方法侵染本氏煙草葉片，之后將植株置于24℃恒溫箱中培養(yǎng)48h；（3）4天后開始觀察煙草葉片的顏色變化，10天后對積累了花青素的本氏煙草葉片取樣，對其進(jìn)一步分析。實(shí)施例3茶樹MYB轉(zhuǎn)錄因子CsAN1超表達(dá)植株的花青素測量1、分別取轉(zhuǎn)化了CsAN1、CsAN1+CsGL3和CsAN1+CsGL3+CsTTG1的煙草的葉片，利用顯微鏡觀察各種轉(zhuǎn)基因煙草葉片的的顯微結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖3。2、花青素浸提：將3g的葉片鮮樣于研缽中加入液氮磨碎，之后將其轉(zhuǎn)移到試管中，加入3mL的浸提緩沖液（由18%正丙醇，1%鹽酸：81%水配制而成），沸水浴3min，室溫靜置過夜。浸提結(jié)果見圖4。3、花青素的測量：用紫外分光光度計(jì)測定浸提液在A535和A650的吸光值，最終的花青素含量用(A535～A650)g-1(FW)表示。測定結(jié)果見圖5。4、花青素成分測定：取10μL（1）的浸提液注射到XSelectHSSC-18SB管（4.6×250mm，5μm，沃特世科技有限公司），用5%甲酸（A）和100%甲醇（B）作為流動(dòng)相，在520nm檢測花青素，具體操作參照發(fā)表的文獻(xiàn)（Shanetal.2009）檢測結(jié)果如圖6。從圖6的結(jié)果可知，在轉(zhuǎn)基因煙草中檢測到矢車菊色素，（cyanidin-3-O-galactoside）和飛燕草色素（delphinidin-3-O-galactoside）兩種主要色素。實(shí)施例4為了進(jìn)一步了解茶樹MYB轉(zhuǎn)錄因子CsAN1在花青素合成中的作用機(jī)理，本實(shí)施例研究了花青素合成途徑關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因在對照以及超表達(dá)煙草中的表達(dá)量情況。具體步驟為，根據(jù)目的基因的序列設(shè)計(jì)特異引物和內(nèi)參基因Actin引物（見表2），采用HipurePlantRNAMiniKit（廣州美基）提取相應(yīng)樣品總RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA，并以該產(chǎn)物為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)設(shè)3次重復(fù)，qRT-PCR反應(yīng)體系如下：cDNA模板0.25μL，2×SYBRGreenMIX5μL，10μmolL-1正向引物0.5μL，10μmolL-1反向引物0.5μL，加水至總體積達(dá)到10μL。qRT-PCR程序：94℃,10min；94℃,10s，55℃,15s，72℃,30s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物用融解曲線分析，并用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。使用Roche公司的LightCylcer480軟件收集數(shù)據(jù)，不同轉(zhuǎn)基因煙草樣品間3種功能基因的相對表達(dá)量用CT值的2-△△CT法處理，結(jié)果見圖7。表2為qRT-PCR檢測表達(dá)量相關(guān)基因的引物序列NbF3’H-FTAAGGCTTCATCCATCCACCNbF3’H-RCAAAGTCATTTCCTCGCACANbDFR-FTTGTTGGTCCATTCCTCACGNbDFR-RCCACGGGCAAGTCCTTATCGNbLDOX-FAGTATGCTAATGACCAACCCTCNbLDOX-RAGTCCCAGCCCAATAGAAAGNbActin-FAGTCCTCTTCCAGCCATCCANbActin-RTAGGAGCCAAAGCCGTGATTSEQUENCELISTING<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種茶樹MYB轉(zhuǎn)錄因子CsAN1及其在調(diào)控花青素代謝中的應(yīng)用<130><160>14<170>PatentInversion3.3<210>1<211>765<212>DNA<213>CsAN1的ORF<400>1atggacattgtttgttgtgttccattaggagtgagaaaaggtgcatggactggagaagaa60gatagtttgctaaagaactgcattgagcaatatggagagggaatgtggcaccaaattcct120tccagagcaggattgaatagatgcagaaaaagttgtagactaagatggctgaattatctg180agaccaaacataaaaagaggcaattttacgatggatgaagttgatctcattatcaagctt240cagaagctgctaggcaatagatggtcgttgattgcgggtagacttccaggaagaacagca300aatgatgtaaaaaactattggaataccaacttacagaagaaactgatcacccaaagagaa360aaggtgaaagccaagactcaagagaagatggaaaccataattatacgacctcggcctcga420atcttctccaaaaatcaaccacggttaatggacaaaactgccattatagaaaatattcga480acaagagacaaccttagcgagccatttccactaccgctaccgctaccaccatcgcgggat540gatggaatatcatgggataacattgttgttaactccaaaattaacaatggaatcacatgg600tccgcaaatggcttgattgaggaggccaatatagggaattgggatgggaaaataagacca660ggtacacatacatcttgtggcaatttcattgatgaagaccagagtgattggagtgacatt720ttctttaataatgtgaacctttgggatctgttaggtgatgaatga765<210>2<211>254<212>PRT<213>CsAN1氨基酸序列<400>2MetAspIleValCysCysValProLeuGlyValArgLysGlyAlaTrp151015ThrGlyGluGluAspSerLeuLeuLysAsnCysIleGluGlnTyrGly202530GluGlyMetTrpHisGlnIleProSerArgAlaGlyLeuAsnArgCys354045ArgLysSerCysArgLeuArgTrpLeuAsnTyrLeuArgProAsnIle505560LysArgGlyAsnPheThrMetAspGluValAspLeuIleIleLysLeu65707580GlnLysLeuLeuGlyAsnArgTrpSerLeuIleAlaGlyArgLeuPro859095GlyArgThrAlaAsnAspValLysAsnTyrTrpAsnThrAsnLeuGln100105110LysLysLeuIleThrGlnArgGluLysValLysAlaLysThrGlnGlu115120125LysMetGluThrIleIleIleArgProArgProArgIlePheSerLys130135140AsnGlnProArgLeuMetAspLysThrAlaIleIleGluAsnIleArg145150155160ThrArgAspAsnLeuSerGluProPheProLeuProLeuProLeuPro165170175ProSerArgAspAspGlyIleSerTrpAspAsnIleValValAsnSer180185190LysIleAsnAsnGlyIleThrTrpSerAlaAsnGlyLeuIleGluGlu195200205AlaAsnIleGlyAsnTrpAspGlyLysIleArgProGlyThrHisThr210215220SerCysGlyAsnPheIleAspGluAspGlnSerAspTrpSerAspIle225230235240PhePheAsnAsnValAsnLeuTrpAspLeuLeuGlyAspGlu245250<210>3<211>23<212>DNA<213>正向引物<400>3tacttattcagacaaacgcacac23<210>4<211>23<212>DNA<213>反向引物<400>4atttcaactctaatttcaaccca23<210>5<211>36<212>DNA<213>pBI121-CsAN1-F<400>5ggactctagaggatccatggacattgtttgttgtgt36<210>6<211>36<212>DNA<213>pBI121-CsAN1-R<400>6gaccacccggggatcctcatcattcatcacctaaca36<210>7<211>20<212>DNA<213>NbF3'H-F<400>7taaggcttcatccatccacc20<210>8<211>20<212>DNA<213>NbF3'H-R<400>8caaagtcatttcctcgcaca20<210>9<211>20<212>DNA<213>NbDFR-F<400>9ttgttggtccattcctcacg20<210>10<211>20<212>DNA<213>NbDFR-R<400>10ccacgggcaagtccttatcg20<210>11<211>22<212>DNA<213>NbLDOX-F<400>11agtatgctaatgaccaaccctc22<210>12<211>20<212>DNA<213>NbLDOX-R<400>12agtcccagcccaatagaaag20<210>13<211>20<212>DNA<213>NbActin-F<400>13agtcctcttccagccatcca20<210>14<211>20<212>DNA<213>NbActin-R<400>14taggagccaaagccgtgatt20當(dāng)前第1頁1 2 3