本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黃梁木蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源基因(NcSUT2、NcSUT3、NcSUT4)的克隆方法。

背景技術(shù)：

黃梁木(Neolamarckia cadamba)，又稱團(tuán)花樹，茜草科團(tuán)花屬樹種，在食用、藥用以及工業(yè)用途等眾多方面都發(fā)揮著不容小覷的作用，是一種重要的速生經(jīng)濟(jì)樹種。而蔗糖為根部、生殖結(jié)構(gòu)、儲(chǔ)存和發(fā)育器官等的異養(yǎng)細(xì)胞提供大量的營養(yǎng)物質(zhì)，為了確保這些異樣的庫組織的生長(zhǎng)和發(fā)育接收到足夠量的蔗糖，蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在整個(gè)植物中對(duì)蔗糖的膜運(yùn)輸及分布起到關(guān)鍵作用。因此，對(duì)黃梁木的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的研究，有助于進(jìn)一步了解蔗糖在黃梁木中轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和作用機(jī)理以便充分加以利用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種黃梁木蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源基因(NcSUT2、NcSUT3、NcSUT4)的克隆方法。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種黃梁木蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源基因的克隆方法，包括以下操作步驟：應(yīng)用如SEQ ID NO：1所示的引物F，如SEQ ID NO：2所示的引物R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增NcSUT2；應(yīng)用如SEQ ID NO：3所示的引物F，如SEQ ID NO：4所示的引物R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增NcSUT3；應(yīng)用如SEQ ID NO：5所示的引物F，如SEQ ID NO：6所示的引物R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增NcSUT4。

所述PCR的反應(yīng)條件是：94℃預(yù)變性2min，98℃變性10sec，50℃退火30sec，68℃延伸2min，將變性、退火和延伸三個(gè)步驟重復(fù)40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，68℃再延伸2min，4℃冷卻10min；反應(yīng)后加3μL dNTPs、0.5μL Taq酶，72℃反應(yīng)20min。

所述PCR的體系是：

所述cDNA第一鏈模板是按照以下方法合成：

(1)基因組DNA去除：

在RNase free離心管中配配置下列溶液：

RNase free ddH₂O to 16μL

4×gDNA wiper Mix 4μL

模板RNA 1000ng

移液器吹打混勻42℃，2min。

(2)在步驟(1)中的PCR管中直接加入5×HiScriptⅡqRT super MixⅡ4μL，溶液吹打均勻，以以下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增：25℃反轉(zhuǎn)錄引物和模板RNA退火結(jié)合10min，50℃延伸30min，85℃保持5min把合成的cDNA和RNA變性打開得到cDNA，然后4℃恒溫保存。

所述RNA是按照以下提取方法得到：

(1)收集100mg研磨冰凍的黃梁木韌皮部樣品在離心管中，在組織解凍之前，加入500μL的裂解液RLT和50μL PLAN Taid混勻，用手立即劇烈震蕩20s，使樣品充分混勻；

(2)接著室溫下以速度13000rpm離心10min，從而將不能裂解的碎片和結(jié)合有多糖多酚的PLANTaid沉淀；

(3)吸取上清液并轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的centrifugal tube中，量取上清體積，加入二分之一的無水乙醇，立即吹打混勻，不要離心；

(4)立即把混合物加到一個(gè)基因組吸附柱中，以速度13000rpm，離心2min，棄廢液，若量較多則可分多次放入離心；

(5)將基因組吸附柱放在一個(gè)干凈2mL離心管中，在基因組吸附柱柱內(nèi)加500μL裂解液RLT Plus，以速度13000rpm離心30s，收集濾液，用微量移液器較精確估計(jì)濾過液體積(通常450-500μL左右)，加入二分之一體積的無水乙醇，這個(gè)時(shí)候可能會(huì)有沉淀，但是不會(huì)對(duì)提取產(chǎn)生影響，混勻，不需離心；

(6)馬上將混合物加入到一個(gè)置于收集管的吸附柱RA中，以速度13000rpm離心2min，棄廢液；

(7)加入700μL去蛋白液RW1至過濾柱，室溫放置1min，在室溫下以速度13000rpm離心30s，棄廢液；

(8)加入500μL漂洗液RW，以速度13000rpm，離心30s，棄廢液。再加入一次500μL漂洗液RW，重復(fù)一遍；

(9)將吸附柱RA放回空收集管中，以速度13000rpm離心3min；

(10)取出吸附柱RA，放入一個(gè)RNase free離心管中，根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加30-50μL RNase free H₂O(事先在70-90℃水浴中加熱可提高產(chǎn)量)，室溫放置1min，以速度12000rpm離心1min；

(11)用核酸快速測(cè)定儀和瓊脂糖凝膠電泳測(cè)濃度與純度。

一種由權(quán)利要求1所述的克隆方法獲得的黃梁木蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源基因NcSUT2，其特征在于：所述的黃梁木蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源基因NcSUT2的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。具體如下：Seq1[organism＝Neolamarckia cadamba][clone＝1569bp]sucerose transporter 2cDNA,complete CDS

ATGGAGGGTGGCAGAGTCAATGATCAAGAAAATGGCAAAACCTTATCTTCTTTTCAAGTCCAGTCTCATCAACCGCCGCCACCACCACCGCTCTCACTACCACCTCAGCCACCTCAGCCAGTTCGAAATTTAATAATGGTGGCTGCTATAGCTGCCGGAATCCAATTCGGATGGGCGTTACAGCTTTCTTTGCTGACCCCATATGTGCAGCTTTTGGGAATATCCCACAAATTGGCCCCCATAATTTGGCTATGCGGTCCTATTTCTGGGTTGCTTGTCCAACCCATGGTTGGATACTACAGTGACAACTGTACCTCCCGCTTCGGCCGCCGCCGCCCTTTCATTGCTGCCGGTGCTGGCCTTGTGGCCATCGCCGTCGTCCTCATTGGCTTTGCTGCTGACATTGGTCATATGTCTGGTGACCCTCTTGGCAAATCCAGCAAACCTCGAGCTATCGCTGTTTTCATTGTTGGCTTTGCCATTCTTGACGTAGCCAACAACATGTTACAGGGTCCATGCAGAGCTCTGTTGGCCGATCTGTCAGGTGGGAATGCGCGCAAGACGCGCATGTCATACGCAGGCTATTCTTTTTTTATGGCAGTAGGGAATGTGTTGGGTTATGCAGCCGGTTCATACAGTAAACTTTACAAATTATTCCCATTTACTGAAACAAAAGCGTGTGATATTTACTGTGCAAACCTTAAGAGCTGTTTCATTATCTCCATAGCTCTTTTATTAACCTTAACAGTGCTAGCTTTGACAATTGTTCGTGAAAAGCCCTACTCAGGAACGGAACCAGAAAGTGAGGAAGCTACAGAAGGTGAAAAGCATCATGCCAAAATTCCCTTTTTTGGGGAAATATTTGGTGCTCTTAAGGATTTGCCTAGACCCATGTGGATCCTACTTCTGGTAACATGTTTGAATTGGATTGGTTGGTTCCCTTTCTTCTTGTTCGACACTGATTGGATGGGTAGGGAGGTGTATGGAGGAAAGGTCGGTGATAAGTTGTACGACAAAGGTGTACATGCTGGTGCTTTAGGACTCATGCTTAACTCAATTGTCCTGGGTGTCGCATCGGTAGGTGTAGAGCACTCGGCGCGTTGGGTTGGTGGTGTGAAGAGGTTGTGGGGAGGTGTAAACTTCATCCTTGCAATTTGCTTTGCTTTCACTGTTTTAATCACCAAATTGGCCAAATCTACGCGTCGCTCTAATGGACTACCGGCCGAGGGTATCAAGATCGGGTCCCTAGCCCTCTTTTCTGTTTTGGGAATTCCTCTAGCGGTCACATACAGCATCCCTTTTGCTTTGGCATCCATATTTTCTACCGACTCTGGCTCAGGACAAGGTCTTTCACTAGGAGTTCTGAATCTTGCCATTGTCGTGCCACAGATGTTGGTTTCTCTCCTAAGTGGACAATTTGATGCCTTATTTGGAGGTGGTAACTTACCAGCCTTTGTTGTAGGGGCCATTGCTGCCGGTTTGAGTGGATTAATTGCAGTCACTAAATTACCATCTCCACCGGCAGATATTCCAGCGCACAAGACTCAGGCAATTGCGGCGTTCCATTAA

一種由權(quán)利要求1所述的克隆方法獲得的黃梁木蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源基因NcSUT3，其特征在于：所述的黃梁木蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源基因NcSUT3的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。具體如下：Seq2[organism＝Neolamarckia cadamba][clone＝1872bp]sucerose transporter 3cDNA,complete CDS

ATGCCGATGAGCGCCGCCACCAAGATGGATGCGGTATCGATCCGCCTGCCGTACCGGAATTTGAAGCAAGAAGTTGAGCTCATCGGCGTCGATCAAGCTCAACTACGTCGTTTACAGATCGCCGCTCAGAATCGTAACAATAGGAATTTGAATACTAGTAATGAGAATTTTAGCGGTAGCAATAATTCATCGCCGCCTTCCGCGGCGGACGGAGATGCTGAAAGTCAGCAGGAGAAGCATAGTAGTTTGTTTATGTTGATTCTCAGTTGTACGGTGGCCGCCGGAGTGCAATTCGGCTGGGCGTTGCAGCTTTCTCTTCTCACTCCTTATATTCAGACACTTGGTGTGGATCATGCTTTTTCGTCATTTATTTGGCTTTGTGGCCCCATTACAGGTCTCGTGGTACAACCTTGTGTTGGTATATGGAGTGATAAATGCACTTCAAAATATGGCAGAAGGCGACCATTTATATTTGTTGGATCTCTCATGATCTCATTTGCTGTGATAATCATCGGGTTTTCTGCAGACATAGGATACATTTTAGGAGACACAGAAGAACACTGCAGCACATTTAAAGGCACTCGCACAAGAGCAGCTATTGTATTCATTATTGGGTTTTGGATGCTGGATCTTGCAAACAACACTGTGCAGGGCCCAGCTCGTGCTCTTTTGGCTGATCTGGCTGGCCCAGATCAAAGAAACTCCGCAAATGCTGTATTTTGTTCTTGGATGGCTGTTGGAAACATTCTAGGATTTTCTTCCGGAGCCAGTGGACATTGGCACAGATGGTTTCCATTTTTGTTGAGTAGAGCTTGTTGTGAACCCTGTGGAAATCTTAAAGCAGCATTTTTGGTTGCTGTGGTGTTCCTGGCTCTATGTA CACTTGTCACGCTCTACTTTGCCAAGGAGGTTCCATTGGCCCCAAGGCAACCTGTTGGTCTATCAGATTCTGCTCCTCTCTTGGATAATCCTGGACAAATTGGCTTTGACCTTTCAAAATCAGAAGTACAAAATGATAATGCATTGGAGATCAAGTCCAAGAATGAGATTTTCATTGAGAATGATAACATGAGGAATGAAAACCAAAAAGTTGAGGAAGATGTCGTTGAGAGTTTCAACAATAGCCCTGGAGCAGTTTTGGTCCATTTATTAACTAGCTTGCGGAAGTTACCTCCAGCCATGCATTCTGTGCTAATTGTCATGGCTTTGACCTGGCTGTCCTGGTTTCCATTTTTCCTCTTTGACACTGATTGGATGGGAAGAGAAGTTTATCATGGTGATCCCAAAGGAGATGTATCTGAAGTTAAAGCTTATCATCAGGGTGTGAGAGAAGGTGCATTCGGTTTGCTATTGAATTCAGTTGTTCTTGGGATCAGTTCCTTCTTTATTGAGCCTATGTGCCGGTGGATGGGTGCCAGAATAGTTTGGGCTATGAGTAATTTCATGGTGTTTGCCTGCATGGCTGGCACTGCTATCATTAGTTTGGTTTCTGTTAGAGGATATTCAGAAGGGGTTCAACATATCGTTGGGGCGAATGGAGCAGCCAAGATTGCCTCCTTGGTTGTTTTTGGTCTTCTTGGCTTACCTTTGGCTATCACTTATAGTGTTCCTTTCTCTGTCACTGCTGAGTTAACTGCTGATTCCGGGGGTGGCCAAGGATTGGCTATTGGAGTGTTGAATCTAGCAGTTGTTGTACCCCAGATGGTTGTGTCCCTTGGTGCTGGTCCTTGGGATGCCTTATTTGGTGGAGGAAACATACCAGCGTTTGTTTTGGCATCGTTGTGTGCCCTTGCAGCTGGTGTTATTGCGACCCAAAAGTTGCCAATTCTTGCAAGCAGTTCTTATAGATCAACTGGCCTCCATTTTGGTTAA

一種黃梁木蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源基因NcSUT4，其特征在于：由權(quán)利要求1所述的克隆方法獲得，所述的黃梁木蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源基因NcSUT4的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。具體如下：Seq3[organism＝Neolamarckia cadamba][clone＝1518bp]sucerose transporter 4cDNA,complete CDS

ATGCCGGAAATCGAGAGGCACAGTAAAGACAAACCGAGAACAACAACTCGTCATCCGGTTCGCGAACCGGTTCGACCACAACGAGTTCCGTTACGCCTGCTCCTCCGAGTCTCGTCCATCGCGTGCGGAATACAATTCGGTTGGGCGTTGCAGTTGTCGTTGCTGACTCCCTACGTGCAAGAGCTCGGGATTCCGCACGCGTGGGCGAGTATAATCTGGCTATGCGGACCGGTTTCCGGTTTCTTCGTCCAGCCGCTGGTCGGTCACATGAGCGACCGCTGCAGGAGCCGGCTCGGTCGTCGCAGGCCTTTTATTATCGCCGGCGCGGCTTCGATTGTTGTCGCCGTTGTCGTCATCGGCTTCTCCGCCGACATCGGCTGGCTCTTCGGCGATCGCGGCAAAGTTAAGCTACGCGCTATTGCGGCTTTTGTTTTAGGGTTTTGGCTGCTCGATGTTGCGAATAATATGACGCAAGGTCCTTGCAGAGCTCTGCTCGCTGATCTCACCGGAAAAGATCACAGGAGGACTCGAGTAGCAAATGCATATTTTTCACTATGGATGGCAGTTGGTAATATCCTTGGCTATGCCACTGGAGCTTACAGTGGTTGGTTCAAAATTTTACCCTTTACGCGCAGTTCTGCATGCAATGTCAACTGTGCAAATCTTAAGGCTGCCTTCCTTATTGACATTATTTTTATAACAATTACGACATATATAAGCATATCAGCGGCCCATGAGCAGCCACTGGATTCCCTCCATAGTTCACCCGCCTCCATAGAAGAAAGATTTGAACACTCAAGCCACGAACAAGAAGCTTTCCTCTGGGAAATGTTTGGAACTTTTAAATATTTCACTGGTGTCATCTGGATTATCTTGCTTGCTATTGCTTTGACTTGGATTGGATGGTTTCCATTTCTTCTCTTTGATACTGATTGGATGGGGCGAGAAATTTATGGGGGG CAGCCAAATGATGGCCAGAATTACAGTGTTGGAGTCAGAATGGGTGCTTTCGGTCTAATGTTCAATTCAGTGGTCCTTGGAATAACTTCAGTGCTCATGGAGAAGCTCTGCCGCAAATGGGGGGCTGGTTTTACATGGGGAGTTTCAAACATTGTCATGTCTCTCTGTTTTGTTGCAATGCTTATAATTACTGCAGTCAGAACTCACATGGACATAGGTGACCGTCTTCCTCCAGATGGTGTCGTGATTGCTGCATTAGTAGTATTTGCCGTTCTTGGATTTCCGCTTGCAGTAACATACAGCGTTCCTTATGCCTTGATATCCTCAAGGATTGAAGCTTTAGGGCTTGGCCAGGGGTTGTCAATGGGTGTTCTCAATCTGGCAATTGTGGTCCCACAGATTTTGGTCTCTCTTGGAAGCGGACCGTGGGATGAGCTATTTGGTGGTGGCAACTCACCAGCCTTGGCAGTTGGAGCTGTTTCAGCATTTGCTAGTGGACTCATAGCCATTTTGGCAATCCCTCGAACAAGGGTGGAAAAATCAAGAATCCTCCCCTGA

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異引物和特定的PCR擴(kuò)增步驟能夠有效的克隆出黃梁木NcSUT2、NcSUT3、NcSUT4的CDS序列。

附圖說明

圖1是黃梁木NcSUT2的cDNA PCR產(chǎn)物電泳圖譜，其中1、2均為NcSUT2的cDNA PCR產(chǎn)物條帶。

圖2是黃梁木NcSUT3的cDNA PCR產(chǎn)物電泳圖譜，其中1、2均為NcSUT3的cDNA PCR產(chǎn)物條帶。

圖3是黃梁木NcSUT4的cDNA PCR產(chǎn)物電泳圖譜，其中1、2均為NcSUT4的cDNA PCR產(chǎn)物條帶。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1黃梁木NcSUT2、NcSUT3、NcSUT4的cDNA克隆。

1、黃梁木RNA提取方法：使用Aidlab公司生產(chǎn)的植物RNA提取試劑盒。

(1)收集100mg研磨冰凍的黃梁木韌皮部樣品在離心管中，在組織解凍之前，加入500μL的裂解液RLT和50μL PLAN Taid混勻，用手立即劇烈震蕩20s，使樣品充分混勻；

(2)接著室溫下以速度13000rpm離心10min，從而將不能裂解的碎片和結(jié)合有多糖多酚的PLANTaid沉淀；

(3)吸取上清液并轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的centrifugal tube中，量取上清體積，加入二分之一的無水乙醇，立即吹打混勻，不要離心；

(4)立即把混合物加到一個(gè)基因組吸附柱中，以速度13000rpm，離心2min，棄廢液，若量較多則可分多次放入離心；

(5)將基因組吸附柱放在一個(gè)干凈2mL離心管中，在基因組吸附柱柱內(nèi)加500μL裂解液RLT Plus，以速度13000rpm離心30s，收集濾液，用微量移液器較精確估計(jì)濾過液體積(通常450-500μL左右)，加入二分之一體積的無水乙醇，這個(gè)時(shí)候可能會(huì)有沉淀，但是不會(huì)對(duì)提取產(chǎn)生影響，混勻，不需離心；

(6)馬上將混合物加入到一個(gè)置于收集管的吸附柱RA中，以速度13000rpm離心2min，棄廢液；

(7)加入700μL去蛋白液RW1至過濾柱，室溫放置1min，在室溫下以速度13000rpm離心30s，棄廢液；

(8)加入500μL漂洗液RW，以速度13000rpm，離心30s，棄廢液。再加入一次500μL漂洗液RW，重復(fù)一遍；

(9)將吸附柱RA放回空收集管中，以速度13000rpm離心3min；

(10)取出吸附柱RA，放入一個(gè)RNase free離心管中，根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加30-50μL RNase free water(事先在70-90℃水浴中加熱可提高產(chǎn)量)，室溫放置1min，以速度12000rpm離心1min；

(11)將提取得到的RNA，使用濃度為1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性；用Thermo Fisher ND-1004全自動(dòng)核酸蛋白快速檢測(cè)儀檢測(cè)濃度。

2、使用vazyme公司的試劑進(jìn)行進(jìn)行cDNA第一鏈的合成

(1)基因組DNA去除：

在RNase free離心管中配配置下列溶液：

RNase free ddH2O to 16μL

4×gDNA wiper Mix 4μL

模板RNA 1000ng

移液器吹打混勻42℃，2min。

(2)在步驟(1)中的PCR管中直接加入5×HiScriptⅡqRT super MixⅡ4μL，溶液吹打均勻，以以下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增：25℃反轉(zhuǎn)錄引物和模板RNA退火結(jié)合10min，50℃延伸30min，85℃保持5min把合成的cDNA和RNA變性打開得到cDNA，然后4℃恒溫保存。

3、NcSUT2、NcSUT3、NcSUT4cDNA的擴(kuò)增：

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組序列，運(yùn)用primer5.0設(shè)計(jì)NcSUTs cDNA擴(kuò)增引物，并在上海生物工程公司合成引物。應(yīng)用如SEQ ID NO：1所示的引物F，如SEQ ID NO：2所示的引物R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增NcSUT2；應(yīng)用如SEQ ID NO：3所示的引物F，如SEQ ID NO：4所示的引物R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增NcSUT3；應(yīng)用如SEQ ID NO：5所示的引物F，如SEQ ID NO：6所示的引物R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增NcSUT4。引物序列如表1所示：

表1引物序列列表

(1)在滅菌的0.2mL離心管加入下列PCR試劑如下：

(2)PCR的反應(yīng)條件是：94℃預(yù)變性2min，98℃變性10sec，50℃退火30sec，68℃延伸2min，將變性、退火和延伸三個(gè)步驟重復(fù)40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，68℃再延伸2min，4℃冷卻10min；反應(yīng)后加3μL dNTPs、0.5μL Taq酶，72℃反應(yīng)20min。

(3)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物電泳結(jié)果：

如圖1所示，其中1、2均為NcSUT2的cDNA PCR產(chǎn)物條帶。

如圖2所示，其中1、2均為NcSUT3的cDNA PCR產(chǎn)物條帶。

如圖3所示，其中1、2均為NcSUT4的cDNA PCR產(chǎn)物條帶。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。