一種小桐子蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源基因的克隆方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種小桐子薦糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 同源基因（JcSUTl，JcSUT3，JcSUT4)的克隆方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 小桐子（Jatro地a州；Teas)又名麻瘋樹(shù)，為大戟科麻瘋樹(shù)屬植物，是一種重要的生 物能源樹(shù)種。眾所周知，綠色植物是通過(guò)光合作用合成有機(jī)物并W碳水化合物的形式運(yùn)輸 到各個(gè)組織和器官?gòu)亩瓿善渖L(zhǎng)發(fā)育的整個(gè)生命過(guò)程。薦糖作為其運(yùn)輸?shù)闹饕问皆谒] 糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用下從源組織轉(zhuǎn)運(yùn)到初皮部中，然后沿著初皮部長(zhǎng)距離運(yùn)輸，最終卸載到 植物的庫(kù)細(xì)胞中?？偠灾?，薦糖對(duì)植物生長(zhǎng)和發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。小桐子雖然屬 于高光效植物，但是其種實(shí)產(chǎn)量很低，特別是種子油含量參差不齊，運(yùn)極大地限制了生物柴 油產(chǎn)業(yè)化的應(yīng)用。因此，克隆編碼小桐子薦糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，對(duì)進(jìn)一步闡明小桐子薦糖運(yùn) 輸過(guò)程和作用機(jī)制的W及產(chǎn)量性狀的遺傳改良具有重要的理論意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種小桐子薦糖轉(zhuǎn) 運(yùn)蛋白同源基因（JcSUTl，JcSUT3，JcSUT4)的克隆方法。
[0004] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0005] -種小桐子薦糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源基因的克隆方法，包括W下操作步驟：應(yīng)用如SEQ IDN0:1所示的引物F，如SEQIDN0:2所示的引物R，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增JcSUTl;應(yīng)用如 SEQIDN0:3所示的引物F，如SEQIDN0:4所示的引物R，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增JcSUT3; 應(yīng)用如SEQIDNO:5所示的引物F，如SEQIDNO:6所示的引物R，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增 JcSUT4。
[0006] 所述PCR的反應(yīng)條件是：94°C預(yù)變性2min，98°C變性10sec，55°C退火30sec，68°C 延伸2min，將變性、退火和延伸Ξ個(gè)步驟重復(fù)35個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，68°C再延伸7min，4°C 冷卻lOmin;反應(yīng)后加 3μ1dNTPs、0. 5μ1Taq酶，72°C反應(yīng) 20min。
[0007] 所述PCR的體系是：
[0008] Buffbr 25μ1 濃巧為2.5nmol·L-1 的dNTP?ΟμΙ c.DNA第一鏈模板 1μ1 Primer-FI5μ! Primer-R 1.5μ1 KODFX 1μ! ddll]0 9μΙ。
[0009] 所述cDNA第一鏈模板是按照W下方法合成：
[0010] (1)在RNase-free的PCR管中配置下列溶液：
[0011] 5XIScriptreactionmix 4μ1
[0012]含 1μgRNA的溶液 Xμ1
[0013]IScriptreversetranscriptase 1μ1
[0014] Nuclease-free water補(bǔ)齊至 20μ1 ;所述X《15 ;
[0015] (2)將步驟（1)所得溶液吹打均勻，置于PCR中，WW下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增： 25°C反轉(zhuǎn)錄引物和模板RNA退火結(jié)合5min，42°C延伸30min，85°C保持5min把合成的cDNA 和RNA變性打開(kāi)得到cDNA，然后4°C恒溫保存。
[0016] 所述RNA是按照W下提取方法得到：
[0017] (1)收集lOOmg冰凍的小桐子樣品在離屯、管中，在組織解凍之前，加入500μ1的 BufferR化和β-琉基乙醇的混合液，滿旋震蕩30s，使樣品充分混勻；所述BufferR化和 β-琉基乙醇的體積比為1 :50 ;
[0018] (2) 55°C金屬浴1~3min;接著室溫下W速度14000巧m離屯、5min;
[001引 做將上清液轉(zhuǎn)移到含有曲NA過(guò)濾柱的2ml收集管中，并在室溫下W速度 14000巧m離屯、2min;
[0020] (4)加入相等體積的BufferRCB到下清液中，并通過(guò)移液器吸打混合液5~10 次，使之充分混勻；
[0021] (5)將步驟（4)中所得的混合液吸取一半加入到含有一個(gè)化BincfRNAMin的過(guò)濾 柱的2ml收集管中，并在室溫下W速度1000化pm離屯、Imin;離屯、后棄濾液，并將過(guò)濾柱放 回到收集管中；
[002引 （6)將步驟（4)中剩余混合液加入到過(guò)濾柱中，并在室溫下W速度1000化pm離屯、 Imin;離屯、后棄濾液，并將過(guò)濾柱放回到收集管中；
[0023] (7)加入300μ1RWCWashBuffer至過(guò)濾柱，在室溫下W速度10000巧m離屯、 Imin；
[0024] 做棄濾液，加入75μ1Dnasedigestion反應(yīng)液至過(guò)濾柱中央濾膜上；所述 Dnasedigestion是將OBIDnaselDigestionBuffer73. 5μ1 和RNase-freeDnaseI 1. 5μ1顛倒混勻而成的混合液；
[00幼 （9)室溫下，靜置15min;
[002引 （10)將過(guò)濾柱放置于干凈的2ml收集管中，加入400μ1RWCWashBuffer于室溫 下靜置5min;然后在室溫下W速度1000化pm離屯、Imin;
[0027] (11)棄濾液，將過(guò)濾柱放回到收集管內(nèi)，并加入500μ1RNAWashBufferII;然 后在室溫下W速度10000巧m離屯、Imin;所述RNAWashBufferII在使用前用48ml的無(wú)水 乙醇稀釋；
[002引重復(fù)步驟（11)操作一次，然后空轉(zhuǎn)2min;
[0029] (13)將過(guò)濾柱轉(zhuǎn)移至純凈的1. 5ml離屯、管內(nèi)，加入40μ1DEPC水溶解RNA;
[0030] (14)室溫下，靜置 5min;
[0031] (15)室溫下，10000巧m離屯、Imin，即可得到RNA，用核酸快速測(cè)定儀和瓊脂糖凝膠 電泳測(cè)濃度與純度。
[0032] -種由權(quán)利要求1所述的克隆方法獲得的小桐子薦糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源基因JcSUTl， 所述的小桐子薦糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源基因JcSUTl的核巧酸基因序列如SEQIDN0:7所示。具 體女曰下；Seql[organism=JatrophacurcasL][clone= 1590bp]sucerosetransporter IcDNA,completeCDS
[0033]
[0034] -種由權(quán)利要求1所述的克隆方法獲得的小桐子薦糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源基因JcSUT3， 其特征在于：，所述的小桐子薦糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源基因JcSUT3的核巧酸基因序列如SEQID NO:8 所示。具體如下：Seq2[organism=JatrophacurcasL][clone= 1848bp]suce;rose transporter3cDNA,completeCDS
[0035]
[0036] 一種小桐子薦糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源基因JcSUT4,其特征在于：由權(quán)利要求1所述的 克隆方法獲得，所述的小桐子薦糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源基因JCSUT4的核巧酸基因序列如SEQID NO:9 所不D具體如下：Seq3[organism二JatrophacurcasL][clone二 1503bp]sucerose transporter4cDNA，completeCDS
[0037]
[0038]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異引物和特 定的PCR擴(kuò)增步驟能夠有效的克隆出小桐子JcSUTl、JCSUT3、JCSUT4的CDS序列。
【附圖說(shuō)明】
[0039] 圖1是小桐子JcSUTl的cDNAPCR產(chǎn)物電泳圖譜，其中1、2均為JcSUTl的cDNA PCR產(chǎn)物條帶。
[0040] 圖2是小桐子JcSUT3的cDNAPCR產(chǎn)物電泳圖譜，其中1、2均為JcSUT3的cDNA PCR產(chǎn)物條帶。
[0041] 圖3是小桐子JcSUT4的cDNAPCR產(chǎn)物電泳圖譜，其中1、2均為JcSUT4的cDNA PCR產(chǎn)物條帶。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0043]實(shí)施例 1 小桐子JcSUTl,JcSUT3,JcSUT4 的cDNA克隆。
[0044] 1、小桐子RNA提取方法：使用OMEGA公司生產(chǎn)的植物RNA提取試劑盒。
[0045] (1)收集lOOmg冰凍的小桐子樣品在離屯、管中，在組織解凍之前，加入500μ1的 BufferR化和β-琉基乙醇的混合液，滿旋震蕩30s，使樣品充分混勻；所述BufferR化和β-琉基乙醇的體積比為1 :50 ;
[0046] (2) 55°C金屬浴1~3min ;接著室溫下W速度14000巧m離屯、5min ;
[0047] 0)將上清液轉(zhuǎn)移到含有曲ΝΑ過(guò)濾柱的2ml收集管中，并在室溫下W速度 14000巧m離屯、2min;
[0048] (4)加入相等體積的Buffer RCB到下清液中，并通過(guò)移液器吸打混合液5~10 次，使之充分混勻；
[0049] (5)將步驟（4)中所得的混合液吸取一半加入到含有一個(gè)化BincfRNAMin的過(guò)濾 柱的2ml收集管中，并在室溫下W速度1000化pm離屯、Imin;離屯、后棄濾液，并將過(guò)濾柱放 回到收集管中；
[0050] (6)將步驟（4)中剩余混合液加入到過(guò)濾柱中，并在室溫下W速度1000化pm離屯、 Imin;離屯、后棄濾液，并將過(guò)濾柱放回到收集管中；
[0051] (7)加入300μ1RWCWashBuffer至過(guò)濾柱，在室溫下W速度10000巧m離屯、 Imin；
[0052] (8)棄濾液，加入75μ1化ase digestion反應(yīng)液至過(guò)濾柱中央濾膜上；所述 Dnase digestion是將OBI Dnasel Digestion Buffer 73. 5μ1和RNase-free Dnase I 1. 5μ1顛倒混勻而成的混合液；
[00閲 （9)室溫下，靜置ISmin