本發(fā)明涉及放射性同位素¹⁴C標(biāo)記的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及¹⁴C標(biāo)記的三種雙酚F異構(gòu)體的合成和分離方法。本發(fā)明制備的雙酚F的三種異構(gòu)體可適用于環(huán)境領(lǐng)域的雙酚F歸趨研究，也適用于生物學(xué)領(lǐng)域或其他領(lǐng)域的研究應(yīng)用。

背景技術(shù)：

雙酚F是近些年來開發(fā)的一種重要的化工中間體，屬于雙酚類化合物的一種。隨著雙酚A的諸多生物毒性的暴露，許多國家和政府相繼對雙酚A的使用做出限制，雙酚F被作為雙酚A的優(yōu)良替代品廣泛使用于合成環(huán)氧樹脂、聚酯樹脂、聚碳酸酯樹脂以及作為酚醛樹脂改性劑和阻燃劑使用，其產(chǎn)量及應(yīng)用量逐年增加。工業(yè)上使用的雙酚F通常是由其三種異構(gòu)體組成，即4,4'–二羥基二苯基甲烷(4,4'-BPF)；2,2'–二羥基二苯基甲烷(2,2'-BPF)和2,4'–二羥基二苯基甲烷(2,4'-BPF)，其中備受青睞的是應(yīng)用性能最好的是4,4'-BPF。

隨著使用量的增加，雙酚F的環(huán)境濃度以及生物體的暴露濃度也隨之增加。近年來土壤，水等自然環(huán)境，食物，動植物及人體中陸續(xù)檢測到雙酚F的存在。但目前的研究表明雙酚F并不是安全的替代品，同樣具有類雌激素效應(yīng)、DNA損傷、致癌和氧化脅迫等危害。目前對于雙酚F的研究報(bào)道，主要集中在應(yīng)用量最大，應(yīng)用性能最好的4,4'-BPF，但三種雙酚F異構(gòu)體因其結(jié)構(gòu)的差別，可能具有不同的環(huán)境行為和毒性。我們需要對這三種異構(gòu)體開展進(jìn)一步的研究才能準(zhǔn)確的體現(xiàn)雙酚F的環(huán)境行為及環(huán)境影響。另外，由于環(huán)境系統(tǒng)和有機(jī)污染結(jié)構(gòu)上的復(fù)雜性，使普通分析手段在研究中具有很多局限性，難以對其進(jìn)行有效可信的分析。而同位素示蹤技術(shù)可以很好解決這一問題，同位素示蹤技術(shù)的靈敏性及特異性可以使研究在更接近環(huán)境真實(shí)情況下進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量研究測定污染物在復(fù)雜環(huán)境體系中的轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)變。因此本研究中，我們將合成¹⁴C標(biāo)記雙酚F的三種異構(gòu)體以供后續(xù)研究，這對研究雙酚F在其在環(huán)境中的轉(zhuǎn)化和結(jié)合態(tài)殘留形成機(jī)制，正確評估其環(huán)境效應(yīng)及環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)具有決定性作用。

目前有關(guān)¹⁴C標(biāo)記雙酚F的三個異構(gòu)體的微量制備方法國內(nèi)外還未見報(bào)道。非標(biāo)記雙酚F的合成主要采用苯酚和甲醛作為反應(yīng)原料，在酸性催化劑的作用下進(jìn)行縮合反應(yīng)而得，目前催化效果較好的是磷酸。JP 11269113報(bào)道了以磷酸為催化劑的合成方法，酚醛比為6-50，溫度為50-85℃。US Patent 4400554成功地研究了以磷酸為催化劑合成雙酚F的制備方法，酚醛比為4～6:1，溫度為40-50℃，該工藝使雙酚F進(jìn)入了工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的新階段。但上述兩種方法所得到的產(chǎn)物都是雙酚F三種異構(gòu)體的混合物。CN 104447217 A采用磷酸作為催化劑，在酚醛比為4～6:1的條件下實(shí)現(xiàn)了純凈4,4'-BPF的制備方法，收率達(dá)到了45.6％～75.3％，實(shí)現(xiàn)了磷酸催化得到4,4'-BPF的純凈化合物。但是對于¹⁴C標(biāo)記雙酚F的合成來說，原料14C標(biāo)記的苯酚價(jià)格昂貴，以上合成都采用較高的酚醛比，得到的產(chǎn)率雖較高但是其產(chǎn)率以甲醛來計(jì)算的，實(shí)際上苯酚的利用率較低，反應(yīng)后苯酚大量剩余且沒有得到很好的回收。另外雙酚F合成易生成副產(chǎn)物，而適用于大量合成時純化所用的重結(jié)晶方法不適用于微量14C標(biāo)記化合物的分離，且沒有文獻(xiàn)報(bào)道這三種異構(gòu)體的分離。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

1.要解決的技術(shù)問題

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中雙酚F合成時酚醛比過高、三種異構(gòu)體分離困難、反應(yīng)原料苯酚的回收等問題。本發(fā)明提供了一種同時制備¹⁴C標(biāo)記的雙酚F異構(gòu)體的方法，以¹⁴C標(biāo)記的苯酚為起始物與甲醛反應(yīng)，在雙酚F兩側(cè)苯環(huán)位置引入¹⁴C標(biāo)記，經(jīng)過后續(xù)分離步驟得到三種¹⁴C苯環(huán)標(biāo)記的雙酚F異構(gòu)體，可適用于微量的標(biāo)記合成，同時獲得雙酚F三種異構(gòu)體的¹⁴C標(biāo)記物質(zhì)，且具有很好的化學(xué)純度和放射性純度。

2.技術(shù)方案

發(fā)明原理：本發(fā)明的目的是提供一種同時制備¹⁴C標(biāo)記的雙酚F異構(gòu)體的方法，同位素的標(biāo)記位點(diǎn)在苯環(huán)上，如圖2所示，一種¹⁴C標(biāo)記的雙酚F的制備方法，合成工藝路線。

在進(jìn)行放射性標(biāo)記合成之前，首先以非標(biāo)記的苯酚合成非標(biāo)記雙酚F，優(yōu)化各反應(yīng)條件，進(jìn)而確定標(biāo)記合成反應(yīng)條件，并用高效液相色譜、核磁共振儀、質(zhì)譜等對合成的三種非標(biāo)記的雙酚F異構(gòu)體進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，確證結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。

具體合成步驟：將苯酚的二氯甲烷溶液加至5mL的梨形瓶中，再加入甲醛與催化劑磷酸的混合溶液。其中苯酚和甲醛的摩爾比為2～3:1，苯酚和磷酸的摩爾比為1～10:1。反應(yīng)溫度：40～60℃，反應(yīng)時間：2～3h。待反應(yīng)完成后，在攪拌的情況下加入二氯甲烷結(jié)束反應(yīng)，萃取濃縮以用于后續(xù)分離。分離首先采用制備硅膠色譜柱以正戊烷:二氯甲烷(30～10:70～90)洗脫分離出苯酚，以實(shí)現(xiàn)未反應(yīng)放射性原料¹⁴C苯酚的回收；其次用制備薄層硅膠板先后以正戊烷:二氯甲烷:異丙醇:乙酸(20～30:20～30:2～3:1)和正戊烷:異丙醇:乙酸(200～250:10～13:1)為展開劑實(shí)現(xiàn)三種雙酚F異構(gòu)體的分離純化。

3.有益效果

相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明首次建立了¹⁴C標(biāo)記的雙酚F三種異構(gòu)體的合成方法，原料苯酚的用量屬于微量級別，并采用略高于理論配比的低酚醛比(2～3:1)，較低的反應(yīng)溫度，使得該方法合成成本低、苯酚利用率高。

(2)本發(fā)明采用二氯甲烷作為反應(yīng)溶劑，溶劑的加入保障了微量的苯酚和甲醛的充分接觸反應(yīng)，且少量二氯甲烷作為反應(yīng)溶劑時有效的地解決了雙酚F微量合成時溶劑(甲醇，乙醇，二甲亞砜等)的加入導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)率大量下降的問題。

(3)本發(fā)明建立的硅膠柱與硅膠板的聯(lián)合分離方法即首先通過硅膠柱實(shí)現(xiàn)了易揮發(fā)原料¹⁴C標(biāo)記的苯酚的良好回收，又通過制備硅膠板分離得到雙酚F的三種異構(gòu)體，其化學(xué)純度及放射性純度都高于99％，可充分滿足后續(xù)環(huán)境領(lǐng)域，生物領(lǐng)域及其他領(lǐng)域?qū)τ谖镔|(zhì)純度的要求。

(4)利用¹⁴C標(biāo)記的雙酚F，結(jié)合放射性同位素示蹤技術(shù)，可以準(zhǔn)確研究復(fù)雜體系(如土壤體系)中的環(huán)境污染物雙酚F的環(huán)境行為，包括降解代謝產(chǎn)物分析和結(jié)合殘留物在體系中的分布及結(jié)合形式，為降解和轉(zhuǎn)化的過程及機(jī)理研究提供有效手段。

附圖說明

圖1為¹⁴C標(biāo)記雙酚F的三種異構(gòu)體結(jié)構(gòu)式；

圖2為¹⁴C標(biāo)記的雙酚F的制備方法的合成工藝路線；

圖3–5為本發(fā)明非標(biāo)記產(chǎn)物的相應(yīng)質(zhì)譜圖，其中：

圖3為2,2'-BPF的電噴霧質(zhì)譜圖；

圖4為2,4'-BPF的電噴霧質(zhì)譜圖；

圖5為4,4'-BPF的電噴霧質(zhì)譜圖；

以下圖6–11本發(fā)明非標(biāo)記產(chǎn)物的相應(yīng)核磁圖，其中：

圖6為2,2'-BPF的¹³C NMR圖；

圖7為2,4'-BPF的¹³C NMR圖；

圖8為4,4'-BPF的¹³C NMR圖；

圖9為2,2'-BPF的¹H NMR圖；

圖10為2,4'-BPF的¹H NMR圖；

圖11為4,4'-BPF的¹H NMR圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例，對本發(fā)明作詳細(xì)描述。

實(shí)施例1(對比實(shí)施例)：

取非標(biāo)記的苯酚(5mg，0.053mmol)置于5mL梨形瓶中，加入1.5μL的甲醛溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)wt 37％)與4μL磷酸溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)wt 85％)，并加入100μL甲醇作為反應(yīng)溶劑。45℃下攪拌回流3h后結(jié)束反應(yīng)。加入少量無水Na₂SO₄除水，用甲醇(5×3mL)萃取，合并萃取液，萃取液濃縮后經(jīng)高效液相色譜進(jìn)行定量測定。結(jié)果顯示，三種雙酚F的產(chǎn)率(以苯酚計(jì))分別為4,4'-BPF，3.4％；2,4'-BPF，1.5％；2,2'-BPF，0.6％。

實(shí)施例2(對比實(shí)施例)：

取非標(biāo)記的苯酚(5mg，0.053mmol)置于5mL梨形瓶中，加入1.5μL的37％甲醛溶液與4μL 85％磷酸溶液，并加入200μL二氯甲烷作為反應(yīng)溶劑。45℃下攪拌回流3h后結(jié)束反應(yīng)。加入少量無水Na₂SO₄除水，用甲醇(5×3mL)萃取，合并萃取液，萃取液濃縮后經(jīng)高效液相色譜進(jìn)行定量測定。結(jié)果顯示，三種雙酚F的產(chǎn)率(以苯酚計(jì))分別為4,4'-BPF，8.4％；2,4'-BPF，5.3％；2,2'-BPF，1.7％。

實(shí)施例3：

取非標(biāo)記的苯酚(5mg，0.053mmol)置于5mL梨形瓶中，加入1.5μL的37％甲醛溶液與4μL 85％磷酸溶液，并加入100μL二氯甲烷作為反應(yīng)溶劑。45℃下攪拌回流3h，此時，反應(yīng)產(chǎn)物呈橘黃色粘稠狀，然后在攪拌的情況下加入3mL二氯甲烷結(jié)束反應(yīng)。加入少量無水Na₂SO₄除水，用二氯甲烷(5×3mL)萃取，合并萃取液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至200μL。濃縮物經(jīng)Agela中壓硅膠制備色譜初次分離以回收未反應(yīng)完的苯酚，具體操作如下：先用正戊烷:二氯甲烷＝30:70(v/v)作為洗脫劑洗脫20min，以除去反應(yīng)體系中極性較小的副產(chǎn)物；接著用正戊烷:二氯甲烷＝20:80的比例將苯酚洗脫出來；然后用純甲醇將目標(biāo)物雙酚F及其它副產(chǎn)物的混合物一并沖出。將甲醇洗脫的混合物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后用制備硅膠板(GF254，180mm×200mm×1mm，Duran)分離提純。展開劑選用正戊烷:二氯甲烷:異丙醇:乙酸(90:70:5:3)，展開三次。其中4,4'-BPF的R_f值為0.23，2,4'-BPF的R_f值為0.35。但R_f＝0.74的2,2'-BPF仍然是混合物，需要再次純化。將此條帶硅膠刮下，用甲醇萃取(5×10mL)濃縮后再次用制備硅膠板分離，展開劑選用正戊烷:異丙醇:乙酸(100:5:0.4)，其中2,2'-BPF的R_f＝0.46。將三個雙酚F異構(gòu)體的硅膠條帶刮下，用甲醇萃取5次(5×10mL)。萃取液及回收的苯酚濃縮后經(jīng)高效液相色譜進(jìn)行定量和純度測定。結(jié)果顯示，三種雙酚F的產(chǎn)率(以苯酚計(jì))分別為4,4'-BPF，24.8％；2,4'-BPF，12.9％；2,2'-BPF，4.8％。苯酚的回收率為投入苯酚量的34.6％。三個雙酚F異構(gòu)體和苯酚的化學(xué)純度均大于99％。

實(shí)施例4.

取非標(biāo)記的苯酚(5mg，0.053mmol)置于5mL梨形瓶中，加入1.5μL的37％甲醛溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)wt 37％)與4μL磷酸溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)wt 85％)，并加入70μL二氯甲烷作為反應(yīng)溶劑。45℃下攪拌回流2h。此時，反應(yīng)產(chǎn)物呈白色粘稠狀，在攪拌的情況下加入3mL二氯甲烷結(jié)束反應(yīng)。加入少量無水Na₂SO₄除水，用二氯甲烷(5×3mL)萃取，合并萃取液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至200μL。濃縮物經(jīng)Agela中壓硅膠制備色譜初次分離以回收未反應(yīng)完的苯酚，具體操作如下：先用正戊烷:二氯甲烷＝30:70(v/v)作為洗脫劑洗脫，以除去反應(yīng)體系中極性較小的副產(chǎn)物；接著用二氯甲烷將苯酚洗脫出來；然后用純甲醇將目標(biāo)物雙酚F及其副產(chǎn)物的混合物一并沖出。將甲醇洗脫的混合物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后用制備硅膠板(GF254，180mm×200mm×1mm，Duran)分離提純。展開劑選用正戊烷:二氯甲烷:異丙醇:乙酸(80:70:6:3)，展開三次。其中4,4'-BPF的R_f值為0.25，2,4'-BPF的R_f值為0.38。但R_f＝0.75的2,2'-BPF仍然是混合物，需要再次純化。將此條帶硅膠刮下，用甲醇萃取(5×10mL)濃縮后再次用制備硅膠板分離，展開劑選用正戊烷:異丙醇:乙酸(200:10:1)，其中2,2'-BPF的R_f＝0.48。將三個雙酚F異構(gòu)體的硅膠條帶刮下，用甲醇萃取5次(5×10mL)。萃取液及回收的苯酚濃縮后經(jīng)高效液相色譜進(jìn)行定量和純度測定。結(jié)果顯示，三種雙酚F的產(chǎn)率(以苯酚計(jì))分別為4,4'-BPF，25.4％；2,4'-BPF，13.3％；2,2'-BPF，4.7％。苯酚的回收率為投入苯酚量的37％。三個雙酚F異構(gòu)體和苯酚的化學(xué)純度均大于99％。

實(shí)施例5：

取保存在二氯甲烷中的¹⁴C標(biāo)記苯酚(2mCi，80mCi/mmol)及非標(biāo)記苯酚(2.637mg，0.028mmol)置于5mL梨形瓶中，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將溶劑二氯甲烷的體積濃縮至約50μL，然后加入1.5μL的37％甲醛溶液與4μL 85％磷酸溶液，45℃下攪拌回流2h，此時，反應(yīng)產(chǎn)物呈橘黃色粘稠狀。在攪拌的情況下加入200μL二氯甲烷結(jié)束反應(yīng)。反應(yīng)后的產(chǎn)物不經(jīng)萃取直接經(jīng)Agela中壓正相制備色譜分離以回收未反應(yīng)完的苯酚，具體操作如下：先用正戊烷:二氯甲烷＝30:70作為洗脫劑洗脫20min，以除去反應(yīng)體系中極性較小的副產(chǎn)物；接著用正戊烷:二氯甲烷＝10:90的比例將苯酚洗脫出來；然后用純甲醇將目標(biāo)物雙酚F及其副產(chǎn)物的混合物一并沖出。將甲醇洗脫的混合物旋轉(zhuǎn)濃縮后用制備硅膠板(GF254，180mm×200mm×1mm，Duran)分離提純。展開劑選用正戊烷:二氯甲烷:異丙醇:乙酸(80:70:6:3)，展開三次。其中4,4'-BPF的R_f值為0.25，2,4'-BPF的R_f值為0.38。但R_f＝0.75的2,2'-BPF仍然是混合物，需要再次純化。將此條帶硅膠刮下，用甲醇萃取(5×10mL)濃縮后再次用制備硅膠板分離，展開劑選用正戊烷:異丙醇:乙酸(100:5:0.4)，其中2,2'-BPF的R_f＝0.46。將三個雙酚F異構(gòu)體的硅膠條帶刮下，用甲醇萃取5次(5×10mL)。萃取液及回收的苯酚濃縮后經(jīng)高效液相色譜和高效液相色譜-液體閃爍計(jì)數(shù)儀進(jìn)行定量和化學(xué)純度和放射性純度測定。結(jié)果顯示，三種雙酚F的產(chǎn)率(以苯酚計(jì))分別為4,4'-BPF，23.2％；2,4'-BPF，10.7％；2,2'-BPF，2.6％。苯酚的回收率為投入苯酚量的22.4％。4,4'-BPF，2,4'-BPF和2,2'-BPF的放射性純度分別為99.3％，99％和99.8％；苯酚的放射性純度為99.9％。另外三個雙酚F異構(gòu)體和苯酚的化學(xué)純度均大于99％。

附產(chǎn)物分析方法：

附1)高效液相色譜-液體閃爍計(jì)數(shù)儀：高效液相色譜儀為Agilent 1100(Agilent Technologies)，流動相流速1mL/min，流動相為甲醇:水＝50:50，等度洗脫，時間為7min。UV檢測器波長為270nm。液體閃爍計(jì)數(shù)儀(LS6500，Beckman，Coulter)，閃爍液為Gold Star multipurpose(Meridian Biotechnologies，UK)。

附2)高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-QTOF-MS)：液相色譜為Agilent 1250型(Agilent Technologies)，流動相為甲醇，流動相速度為0.2mL/min。質(zhì)譜檢測器為高分辨的四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(Triple TOF5600System，AB SCIEX)，裝備電噴霧離子源(ESI)。全掃模式的質(zhì)譜條件為負(fù)離子模式，質(zhì)譜掃描范圍為m/z 80～800。

附3)核磁共振(NMR)：DPX-500MHZ核磁共振儀(Bruker，瑞士)，以TMS為內(nèi)標(biāo)，CD₄O為溶劑。