專利名稱：構(gòu)象動(dòng)力肽的制作方法
構(gòu)象動(dòng)力肽對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2009年1月30日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 61/148，659的在35U. S. C. § 119(e)下的權(quán)益，通過(guò)提及而將其完整收入本文。背景1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明提供了可用于例如檢測(cè)具有特定構(gòu)象的靶蛋白(包括錯(cuò)折疊蛋白質(zhì)或具有可與疾病有關(guān)的β-片層二級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì))的構(gòu)象動(dòng)力肽(conformational Iy dynamic ρ印tide)。還提供了檢測(cè)此類靶蛋白、診斷與此類靶蛋白有關(guān)的疾病或其風(fēng)險(xiǎn)、和治療與此類靶蛋白有關(guān)的疾病的方法。2.背景錯(cuò)折疊蛋白質(zhì)病癥的發(fā)病機(jī)制的特征在于正常的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成傾向于聚集的富含片層的構(gòu)象。在阿耳茨海默氏病(AD)的病例中，淀粉樣β (Αβ)蛋白自組裝成神經(jīng)毒性寡聚物和原纖維作為疾病的成因得到充分支持。與疾病有關(guān)的其它錯(cuò)折疊蛋白質(zhì)包括傳染性海綿狀腦病(transmissible spongiform enc印halopathy，TSE)、腦淀粉樣血管病(cerebral amyloid angiopathy, CAA)、和腦血管疾病(CVD)中的朊病毒；帕金森病(Parkinson’ s disease)的Lewy小體中的α -突觸核蛋白沉積物、額顳癡呆(frontal temporal dementia)禾口皮克氏病(Pick's disease)中神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle)中的τ ；促淀粉樣性側(cè)索硬化(amylotrophic lateral sclerosis)中的超氧化物歧化酶；和亨延頓氏病(Huntington's disease)中的亨延頓蛋白。參見(jiàn)例如Glenner等， J. Neurol. Sci. 94 :1-28,1989 ；Haan 等，Clin. Neurol. Neurosurg. 92(4) :305-310,1990。美國(guó)專利No. 7，166，471、US 2006/0286672,US 2005/0026165,US 2008/0171341、 US 2006/0057671和US 2008/0095706描述了可用于檢測(cè)例如錯(cuò)折疊蛋白質(zhì)、具有主要為 β-片層的二級(jí)結(jié)構(gòu)的靶蛋白、和處于特定自我聚集狀態(tài)的靶蛋白的肽?？梢栽谶@些專利文件的任一篇(通過(guò)提及而將每篇的內(nèi)容完整收入本文)中所描述的方法中使用本文中所描述的肽。發(fā)明概述依照一些實(shí)施方案，提供了針對(duì)能夠展現(xiàn)出與淀粉樣蛋白生成性疾病 (amyloidogenic disease)有關(guān)的β -片層構(gòu)象的靶蛋白的肽探針，其中所述肽探針(i) 由10至50個(gè)氨基酸殘基組成，其包含作為參照序列變體的氨基酸序列，所述參照序列由所述靶蛋白的片層形成區(qū)的氨基酸序列組成，(ii)能夠采用無(wú)規(guī)卷曲/α-螺旋構(gòu)象和 β-片層構(gòu)象兩者，并(iii)在結(jié)合展現(xiàn)出片層構(gòu)象的靶蛋白后采用片層構(gòu)象或者在結(jié)合靶蛋白后經(jīng)歷產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的構(gòu)象變化。所述變體序列相對(duì)于所述參照序列包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、替代或刪除，使得(A)所述變體序列的無(wú)規(guī)卷曲/α-螺旋構(gòu)象比由所述參照氨基酸序列組成的探針在氧化環(huán)境中更穩(wěn)定和/或(B)無(wú)規(guī)卷曲/ α -螺旋構(gòu)象的所述變體序列的N端與C端之間的距離與β-片層構(gòu)象的所述變體序列的N端與C端之間的距離不同和/或(C)所述變體序列在結(jié)合展現(xiàn)出片層構(gòu)象的靶蛋白后比所述參照序列更有效地采用片層構(gòu)象和/或(D)所述變體序列在結(jié)合展現(xiàn)出片層構(gòu)象的靶蛋白后采用不太有序的構(gòu)象和/或(E)所述變體序列的片層結(jié)構(gòu)在熱力學(xué)上沒(méi)有所述參照序列的片層結(jié)構(gòu)強(qiáng)和/或(F)所述變體序列比所述參照序列具有升高的穩(wěn)定性和/或降低的反應(yīng)性和/或(G)所述變體序列比所述參照序列具有升高的親水性和/或在水溶液中的溶解度和/或(H)所述變體序列比所述參照序列具有額外的Aβ結(jié)合基序和/ 或(I)所述變體序列具有增強(qiáng)的形成聚集體的能力。在一些實(shí)施方案中，變體序列進(jìn)一步包含在C端添加的賴氨酸殘基。在一些實(shí)施方案中，所述肽探針在N端、C端、這兩端、或者在所述肽采用β-片層構(gòu)象或者在結(jié)合靶蛋白后經(jīng)歷構(gòu)象變化時(shí)產(chǎn)生信號(hào)的一個(gè)或多個(gè)位置處用可檢測(cè)標(biāo)記物， 諸如熒光標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，所述肽探針用兩種或更多種標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記，其中在所述肽探針結(jié)合靶蛋白時(shí)所述肽探針上的兩種或更多種標(biāo)記物間的距離與在所述肽探針未結(jié)合靶蛋白時(shí)的所述距離不同。在一些實(shí)施方案中，在所述肽探針結(jié)合靶蛋白時(shí)由所述可檢測(cè)標(biāo)記物產(chǎn)生的所述信號(hào)與在所述肽探針未結(jié)合靶蛋白時(shí)產(chǎn)生的所述信號(hào)不同， 諸如在肽探針展現(xiàn)出β-片層構(gòu)象時(shí)的信號(hào)大于在肽探針展現(xiàn)出無(wú)規(guī)卷曲/ α -螺旋構(gòu)象時(shí)產(chǎn)生的信號(hào)。在這些中任一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述肽探針可以用可檢測(cè)標(biāo)記物對(duì)來(lái)標(biāo)記，所述可檢測(cè)標(biāo)記物對(duì)選自受激子對(duì)、FRET對(duì)和熒光團(tuán)/猝滅劑對(duì)。在肽探針用受激子對(duì)諸如芘對(duì)來(lái)標(biāo)記時(shí)，它可以在肽探針展現(xiàn)出片層構(gòu)象時(shí)發(fā)射受激子信號(hào)。在肽探針用FRET 對(duì)諸如DACIA-I/NBD、Marina藍(lán)/NBD、丹酰/TrpJP EDANS/FAM來(lái)標(biāo)記時(shí)，它可以在肽探針展現(xiàn)出片層構(gòu)象時(shí)發(fā)射熒光共振轉(zhuǎn)移(FRET)信號(hào)。在肽探針用熒光團(tuán)/猝滅劑對(duì)， 諸如芘/Dabcyl、EDANS/Dabcyl和FAM/Dabcyl來(lái)標(biāo)記時(shí)，熒光團(tuán)信號(hào)可以在肽探針展現(xiàn)出 β-片層構(gòu)象時(shí)被猝滅。在一些實(shí)施方案中，肽探針中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、替代或刪除是在參照序列的內(nèi)部部分做出的，或者在參照序列的N端或C端，或者在這兩端，或者在內(nèi)部和末端做出的。在一些實(shí)施方案中，所述變體序列包含用抗氧化的殘基，諸如丙氨酸殘基替換甲硫氨酸殘基。在一些實(shí)施方案中，所述變體序列包含用丙氨酸殘基替換參照序列的至少3 個(gè)連續(xù)的殘基。另外/或者，在一些實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、替代或刪除在兩個(gè)殘基間，諸如谷氨酸殘基和組氨酸殘基、谷氨酸殘基和精氨酸殘基、和/或谷氨酸殘基和賴氨酸殘基間引入鹽橋。另外/或者，在一些實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、替代或刪除將Αβ 結(jié)合基序引入所述肽探針中，諸如GXXEG基序(SEQ ID NO :25)。另外/或者，在一些實(shí)施方案中，所述變體序列在結(jié)合展現(xiàn)出β -片層構(gòu)象的靶蛋白后采用不太有序的構(gòu)象。在具體的實(shí)施方案中，靶蛋白是Αβ蛋白，而所述變體序列包含一處或多處選自下組的替代G^H、G29R, 6四1(、和G33E。另外/或者，所述變體序列的 β -片層結(jié)構(gòu)在熱力學(xué)上沒(méi)有所述參照序列的β -片層結(jié)構(gòu)強(qiáng)。在具體的實(shí)施方案中，所述變體序列包含一處或多處選自下組的替代I32S、F19S、S26D、H29D、I31D、L34D、和L34P。另外/或者，在一些實(shí)施方案中，所述變體序列比所述參照序列具有升高的親水性和/或在水溶液中的溶解度。在具體的實(shí)施方案中，所述變體序列包含引入谷氨酸殘基和/或d-精氨酸殘基的一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加或替代。另外/或者，所述變體序列可以與親水性模塊(moiety)，諸如可溶性聚乙二醇模塊綴合。依照前述中任一項(xiàng)實(shí)施方案，可檢測(cè)標(biāo)記物可以與所述肽探針的末端賴氨酸殘基的側(cè)鏈綴合，和/或與所述肽探針的內(nèi)部賴氨酸殘基的側(cè)鏈綴合。依照前述中任一項(xiàng)實(shí)施方案，所述肽探針可以諸如經(jīng)由肽接頭與生物素模塊綴合。在具體的實(shí)施方案中，所述肽接頭選自下組柔性(flexible)接頭、螺旋接頭、凝血酶位點(diǎn)接頭和扭結(jié)接頭。在更具體的實(shí)施方案中，所述接頭包含選自由SEQ ID NO :56-60組成的組的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，所述肽探針經(jīng)由內(nèi)部賴氨酸殘基的側(cè)鏈與生物素模塊綴合。依照一些實(shí)施方案，所述肽探針是肽或肽模擬物，其(i)由10至50個(gè)氨基酸殘基組成，其包含作為參照序列變體的氨基酸序列，所述參照序列由所述靶蛋白的β -片層形成區(qū)的氨基酸序列組成，(ii)能夠采用無(wú)規(guī)卷曲/α-螺旋構(gòu)象和片層構(gòu)象兩者，并 (iii)在結(jié)合靶蛋白后采用不太有序的構(gòu)象。在別的實(shí)施方案中，此類肽探針在N端、C端、 這兩端、或者在所述肽在結(jié)合靶蛋白后經(jīng)歷構(gòu)象變化時(shí)產(chǎn)生信號(hào)的一個(gè)或多個(gè)位置處用可檢測(cè)標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記，諸如用選自受激子對(duì)、FRET對(duì)和熒光團(tuán)/猝滅劑對(duì)的可檢測(cè)標(biāo)記物對(duì)來(lái)標(biāo)記。在具體的實(shí)施方案中，所述肽探針用受激子對(duì)(諸如兩個(gè)芘模塊)來(lái)標(biāo)記，并在所述肽探針未結(jié)合靶蛋白時(shí)發(fā)射升高的受激子信號(hào)，且在所述肽探針結(jié)合靶蛋白時(shí)發(fā)射升高的自身信號(hào)。在其它具體的實(shí)施方案中，所述肽探針用FRET對(duì)來(lái)標(biāo)記，并在所述肽探針未結(jié)合靶蛋白時(shí)發(fā)射升高的熒光共振轉(zhuǎn)移(FRET)信號(hào)，而在所述肽探針結(jié)合靶蛋白時(shí)發(fā)射非FRET熒光團(tuán)信號(hào)。在其它具體的實(shí)施方案中，所述肽探針用熒光團(tuán)/猝滅劑對(duì)來(lái)標(biāo)記， 并在所述肽探針未結(jié)合靶蛋白時(shí)發(fā)射降低或猝滅的信號(hào)，而在所述肽探針結(jié)合靶蛋白時(shí)發(fā)射熒光團(tuán)信號(hào)。依照本文中所描述的任何實(shí)施方案，變體序列可以包含選自SEQ ID NO :2_55的氨基酸序列或由選自SEQ ID NO :2-55的氨基酸序列組成。在具體的實(shí)施方案中，變體序列包含氨基酸序列SEQ ID N0:2(肽2 或者由氨基酸序列SEQ ID N0:2(肽2 組成。在一些實(shí)施方案中，變體序列包含用谷氨酸殘基替換至少一個(gè)殘基。在一些實(shí)施方案中，變體序列包含用組氨酸殘基替換至少一個(gè)殘基。在一些實(shí)施方案中，變體序列包含一處或多處選自下組的替代用絲氨酸殘基替換異亮氨酸殘基；用脯氨酸殘基、甘氨酸殘基、谷氨酰胺殘基或賴氨酸殘基替換谷氨酸殘基；用絲氨酸殘基替換苯丙氨酸殘基；用脯氨酸殘基替換亮氨酸殘基；用甘氨酸殘基替換丙氨酸殘基；和用天冬酰胺殘基替換天冬氨酸殘基。在一些實(shí)施方案中，變體序列包含在C端添加的賴氨酸殘基。在一些實(shí)施方案中， 肽探針包含選自由SEQ ID NO 2-8組成的組的氨基酸序列。依照其它實(shí)施方案，提供了用于檢測(cè)測(cè)試樣品中的靶蛋白的方法，其中所述靶蛋白展現(xiàn)出與淀粉樣蛋白生成性疾病有關(guān)的片層構(gòu)象，包括(i)使所述樣品與本文中所描述的任何肽探針接觸以形成測(cè)試混合物；并(ii)檢測(cè)所述肽探針與存在的任何靶蛋白間的任何結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，步驟(ii)包括檢測(cè)由展現(xiàn)出片層構(gòu)象或者結(jié)合靶蛋白后經(jīng)歷構(gòu)象變化的肽探針的熒光標(biāo)記物產(chǎn)生的任何信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，步驟(ii)包括檢測(cè)包含所述肽探針和靶蛋白的復(fù)合物，其通過(guò)檢測(cè)由所述復(fù)合物中存在的任何可檢測(cè)標(biāo)記物(諸如熒光標(biāo)記物)產(chǎn)生的任何信號(hào)來(lái)進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，所述復(fù)合物是不溶性復(fù)合物(諸如淀粉樣蛋白β原纖維)，且步驟(ii)包括檢測(cè)由所述不溶性復(fù)合物中存在的任何可檢測(cè)標(biāo)記物(諸如熒光標(biāo)記物)產(chǎn)生的任何信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，所述復(fù)合物是可溶性復(fù)合物(諸如淀粉樣蛋白β寡聚物)，且步驟(ii)包括檢測(cè)由所述可溶性復(fù)合物中存在的任何可檢測(cè)標(biāo)記物(諸如熒光標(biāo)記物)產(chǎn)生的任何信號(hào)。在一些實(shí)施方案中， 方法進(jìn)一步包括在步驟(ii)前通過(guò)選自離心、大小排阻層析、和親和層析的方法來(lái)分開所述復(fù)合物與所述測(cè)試混合物。依照其它實(shí)施方案，提供了一種用于檢測(cè)與淀粉樣蛋白生成性疾病有關(guān)的靶蛋白的方法，其中肽探針在來(lái)自受試者的生理學(xué)樣品中，包括(A)使所述樣品與肽探針接觸，所述肽探針是肽或肽模擬物，其(i)由10至50個(gè)氨基酸殘基組成，其包含作為參照序列變體的氨基酸序列，所述參照序列由所述靶蛋白的β-片層形成區(qū)的氨基酸序列組成，(ii)能夠采用無(wú)規(guī)卷曲/α-螺旋構(gòu)象和β-片層構(gòu)象兩者，并(iii)在結(jié)合靶蛋白后采用不太有序的構(gòu)象；并(B)檢測(cè)所述探針與所述樣品中存在的任何靶蛋白間的任何結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，所述肽探針在N端、C端、這兩端、或者在所述肽在結(jié)合靶蛋白后經(jīng)歷構(gòu)象變化時(shí)產(chǎn)生信號(hào)的一個(gè)或多個(gè)位置處用可檢測(cè)標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記。在具體的實(shí)施方案中，所述肽探針用受激子對(duì)來(lái)標(biāo)記，且步驟(ii)包括檢測(cè)任何升高的自身信號(hào)或降低的受激子信號(hào)。在其它實(shí)施方案中，所述肽探針用FRET對(duì)來(lái)標(biāo)記，且步驟(ii)包括檢測(cè)任何升高的非-FRET熒光團(tuán)信號(hào)或降低的FRET信號(hào)。在其它實(shí)施方案中，所述肽探針用熒光團(tuán)/猝滅劑對(duì)來(lái)標(biāo)記， 且步驟(ii)包括檢測(cè)任何升高的熒光團(tuán)信號(hào)。在其它實(shí)施方案中，提供了一種用于在受試者中檢測(cè)與淀粉樣蛋白生成性疾病有關(guān)的靶蛋白的體內(nèi)方法，包括(A)對(duì)所述受試者施用如本文中所描述的任何肽探針，其中所述探針用在所述探針結(jié)合靶蛋白時(shí)產(chǎn)生信號(hào)的可檢測(cè)標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記，并(B)檢測(cè)所述信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，使用成像技術(shù)，諸如正電子發(fā)射斷層攝影(PET)、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)(SPECT)、磁共振成像(MRI)、放射照相術(shù)、斷層攝影術(shù)、熒光術(shù)、核醫(yī)學(xué)、光學(xué)成像、腦照相術(shù)和超聲波掃描術(shù)來(lái)檢測(cè)信號(hào)。在其它實(shí)施方案中，提供了一種治療患有或有風(fēng)險(xiǎn)形成淀粉樣蛋白生成性疾病的受試者的方法，包括對(duì)所述受試者施用本文中所描述的任何肽探針。在一些實(shí)施方案中，所述探針與針對(duì)所述淀粉樣蛋白生成性疾病的別的治療劑綴合。依照本文中所描述的任何實(shí)施方案，靶蛋白可以選自下組淀粉樣胰島多肽前體蛋白、淀粉樣β蛋白、Αβ肽、血清淀粉樣蛋白Α、胰島素、amylin、非淀粉樣蛋白β組分、朊病毒、血紅蛋白、免疫球蛋白或其片段、β2_微球蛋白、α-突觸核蛋白、視紫紅質(zhì)、α -抗胰凝乳蛋白酶、晶體蛋白、τ、ρ53、早老蛋白、低密度脂蛋白受體、載脂蛋白、超氧化物歧化酶、神經(jīng)絲蛋白、運(yùn)甲狀腺素蛋白、原降鈣素或降鈣素、心房鈉尿因子、凝溶膠蛋白、囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)物、亨延頓氏病蛋白、血纖蛋白原α-鏈、苯丙氨酸羥化酶、膠原、β-氨基己糖苷酶、和半胱氨酸蛋白酶抑制劑C蛋白。依照具體的實(shí)施方案，靶蛋白可以是Αβ蛋白。附圖簡(jiǎn)述圖IA顯示了芘的芘間距離隨芘化(pyrenate)肽的溶劑環(huán)境的分布的計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè) (左側(cè)小圖水，右側(cè)小圖40% TFE)，所述芘與對(duì)應(yīng)于Aβ肽區(qū)的肽的每個(gè)末端綴合。圖IB顯示了在肽為片層構(gòu)象時(shí)與肽的N和C端綴合的芘模塊極其物理接近。
圖IC顯示了在肽為無(wú)規(guī)卷曲/ α -螺旋構(gòu)象時(shí)與肽的N和C端綴合的芘模塊間的距離。圖2列出了本文中所描述的肽(SEQ ID NO 2_13)及其相對(duì)于野生型參照序列 (SEQ ID NO 1)的氨基酸添加和/或替代的具體實(shí)施方案，所述野生型參照序列基于“野生型”Αβ蛋白中具有供綴合熒光標(biāo)記物用的C端添加的賴氨酸的氨基酸16-35。圖3顯示了使用肽探針(SEQ ID NO 1)來(lái)檢測(cè)不溶性A β 42靶蛋白纖維的基于離心的體外相互作用測(cè)定法的結(jié)果。圖4Α和圖4Β顯示了使用經(jīng)標(biāo)記的肽探針(SEQ ID NO 4)來(lái)檢測(cè)可溶性A β 42革巴蛋白寡聚物的基于大小排阻層析的體外相互作用測(cè)定法，其中圖4Β中顯示了結(jié)果，其顯示了在存在寡聚物的情況中回收經(jīng)熒光標(biāo)記的肽，指示肽探針結(jié)合靶蛋白寡聚物。用SEQ ID NO 1的經(jīng)標(biāo)記的肽探針獲得相似的結(jié)果，如

圖14中所顯示的。圖5Α和圖5Β顯示了使用經(jīng)標(biāo)記的肽探針(SEQ ID NO 2)來(lái)檢測(cè)經(jīng)生物素標(biāo)記的可溶性Αβ42靶蛋白寡聚物的基于親和層析的體外相互作用測(cè)定法，圖5Β中顯示了結(jié)果， 其顯示了僅在存在高分子量寡聚物的情況中在捕捉材料中檢測(cè)出經(jīng)標(biāo)記的肽探針，指示肽探針結(jié)合靶蛋白寡聚物。用SEQ ID NO 1的經(jīng)標(biāo)記的肽探針獲得相似的結(jié)果，如圖15中所顯示的。圖6Α顯示了與參照肽(SEQ ID NO 1)相比與本文中所描述的肽(肽22 ；SEQ ID NO 2)的溶劑誘導(dǎo)的構(gòu)象變化有關(guān)的最大信號(hào)獲得的測(cè)定。圖6Β報(bào)告了與參照肽相比在存在原纖維淀粉樣靶蛋白的情況中的肽構(gòu)象變化有關(guān)的最大信號(hào)獲得的測(cè)定結(jié)果。圖7顯示了 ρΗ和鹽濃度對(duì)肽38 (SEQ ID NO 3)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，如通過(guò)圓二色性旋光分光法(CD)分析所測(cè)定的。圖8顯示了 A β 42寡聚物(靶蛋白)的相互作用對(duì)肽38 (SEQ ID NO 3)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，如通過(guò)CD分析所測(cè)定的。圖9Α和圖9Β顯示了 A β 42寡聚物(靶蛋白)的相互作用對(duì)肽45 (SEQ ID NO 4) 的芘熒光特性的影響。圖9Α顯示了肽-靶物復(fù)合物的熒光發(fā)射。圖9Β顯示了單獨(dú)的肽的熒光發(fā)射。圖10顯示了本文中所描述的肽探針在結(jié)合不同底物后的構(gòu)象變化。頂部小圖在每個(gè)末端用芘標(biāo)記的肽探針(諸如SEQ ID NO 1)在結(jié)合40% TFE中的Αβ纖維后采用增加的片層構(gòu)象，如通過(guò)升高的芘受激子信號(hào)所檢測(cè)的。底部小圖A 在每個(gè)末端用芘標(biāo)記的肽探針(諸如肽22，SEQ ID NO 2)在結(jié)合水中的A β寡聚物后采用不太有序(例如減少的β_片層)構(gòu)象，如通過(guò)升高的芘單體(“自身”)信號(hào)所檢測(cè)的。底部小圖B 在每個(gè)末端用FRET標(biāo)記物標(biāo)記的肽探針在結(jié)合水中的A β寡聚物后采用增加的β-片層構(gòu)象，如通過(guò)FRET信號(hào)所檢測(cè)的。肽探針 AD^3 (SEQ ID NO :52)、AD292 (SE ID NO :53)、AD 291 (SEQ ID NO 54)和AD 290 (SEQ ID NO :55)已經(jīng)展現(xiàn)出與此類構(gòu)象變化一致的熒光行為。圖11顯示了在沒(méi)有(左側(cè))和存在(右側(cè))可溶性Αβ寡聚物的情況中在每個(gè)末端用芘標(biāo)記的肽22 (SEQ ID NO 2)的原始熒光譜。肽22的熒光在沒(méi)有寡聚物的情況中隨時(shí)間是穩(wěn)定的(沒(méi)有單體或受激子熒光的升高)，但是在與可溶性Αβ寡聚物一起溫育時(shí)展現(xiàn)出芘單體信號(hào)的升高。(實(shí)線=時(shí)間0 ；虛線=3小時(shí)；點(diǎn)線=18小時(shí))。圖12顯示了肽22(SEQ ID NO 2)對(duì)可溶性Αβ寡聚物的特異性。前兩幅小圖顯示了在將肽22與通過(guò)兩種不同方法制備的可溶性Αβ寡聚物一起溫育時(shí)的芘單體信號(hào)的劑量依賴性升高。接著的兩幅小圖顯示了在將肽22與A β 40單體和A β 42單體一起溫育時(shí)沒(méi)有熒光變化。接著的小圖顯示了在將肽22與Αβ 40纖維一起溫育時(shí)沒(méi)有熒光變化，而接著的小圖顯示了在將肽22與Αβ 42纖維一起溫育時(shí)單體熒光的某些劑量依賴性升高。最后兩幅小圖顯示了在將肽22與對(duì)照溶液(BSA或脫水酶)一起溫育時(shí)沒(méi)有熒光變化。數(shù)據(jù)顯示了單體熒光面積隨時(shí)間的自然對(duì)數(shù)(Ln)。(點(diǎn)線=0.3uM底物；虛線=0. IuM;虛線/ 點(diǎn)線=0. 03uM ；實(shí)線=單獨(dú)的p22)。圖13A和圖1 顯示了肽22 (SEQ ID NO 2)在與可溶性A β 42寡聚物相互作用后的構(gòu)象變化。圖13Α顯示了肽22在與可溶性A β 42寡聚物相互作用后的熒光變化，從受激子轉(zhuǎn)變成單體熒光。(實(shí)線沒(méi)有A β 42寡聚物；虛線/點(diǎn)線30ηΝΑβ 42寡聚物；大虛線 IOOnNA β 42寡聚物；小虛線300ηΝΑβ 42寡聚物)。圖1 顯示了肽22的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如通過(guò)CD分析所測(cè)定的，所述CD分析在存在A β 42寡聚物的情況中沒(méi)有檢測(cè)到通過(guò)芘熒光變化可檢測(cè)的構(gòu)象變化。(實(shí)線肽22 ；虛線/點(diǎn)線Αβ 42寡聚物；大虛線個(gè)別樣品的結(jié)果的算術(shù)和；小虛線肽22和A β 42寡聚物的混合物)。圖14Α和圖14Β顯示了使用經(jīng)標(biāo)記的肽探針(SEQ ID NO 1)來(lái)檢測(cè)可溶性A β 42 靶蛋白寡聚物的基于大小排阻層析的體外相互作用測(cè)定法，圖14Β中顯示了結(jié)果，其顯示了在存在寡聚物的情況中回收經(jīng)熒光標(biāo)記的肽，指示肽探針結(jié)合靶蛋白寡聚物。圖15Α和圖15Β顯示了使用經(jīng)標(biāo)記的肽探針(SEQ ID NO 1)來(lái)檢測(cè)經(jīng)生物素標(biāo)記的可溶性Αβ 42靶蛋白寡聚物的基于親和層析的體外相互作用測(cè)定法，圖15Β中顯示了結(jié)果，其顯示了僅在存在高分子量寡聚物的情況中在捕捉材料中檢測(cè)出經(jīng)標(biāo)記的肽探針，指示肽探針結(jié)合靶蛋白寡聚物。發(fā)明詳述1.定義如本文中所使用的，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”、和“所述/該”指單數(shù)和復(fù)數(shù)兩者， 除非明確規(guī)定僅指單數(shù)。術(shù)語(yǔ)“約”及一般的范圍使用(無(wú)論是否通過(guò)術(shù)語(yǔ)約來(lái)量化)意為所理解的數(shù)目不限于本文中所列的精確數(shù)目，而且意圖指基本上在所引用的范圍內(nèi)同時(shí)不背離發(fā)明范圍的范圍。如本文中所使用的，“約”會(huì)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解的，而且會(huì)隨使用其的上下文而在一定程度上變化。若使用該術(shù)語(yǔ)之處本領(lǐng)域技術(shù)人員鑒于使用其的上下文無(wú)法清楚其含義，則“約”會(huì)指具體項(xiàng)的多至士 10%。如本文中所使用的，“受試者”表示需要檢測(cè)或治療性處理的任何動(dòng)物，包括人和馴養(yǎng)動(dòng)物，諸如貓、犬、豬、牛、綿羊、山羊、馬、家兔，等等?！笆茉囌摺边€包括研究背景中所使用的動(dòng)物，包括小鼠和其它小哺乳動(dòng)物。典型的受試者可以有狀況、疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)或者被懷疑為患有此類狀況，或者可以渴望測(cè)定在具體狀況，諸如與靶蛋白有關(guān)的狀況、疾病或病癥方面的風(fēng)險(xiǎn)或狀態(tài)。如本文中所使用的，“治療性”處理包括施用治療劑以治療現(xiàn)有的狀況，預(yù)防受試者有風(fēng)險(xiǎn)或形成的狀況，或者用于健康維持。如本文中所使用的，“構(gòu)象”指蛋白質(zhì)或肽的特定二級(jí)結(jié)構(gòu)，例如α-螺旋、無(wú)規(guī)卷曲或片層二級(jí)結(jié)構(gòu)?！皹?gòu)象變化”指從一種構(gòu)象改變成另一種?！半貌《尽敝概c基于朊病毒的疾病有關(guān)的蛋白質(zhì)?！癙rP蛋白”、“PrP”、等等在本文中可互換使用，意為已知在人和動(dòng)物中引起疾病(諸如海綿狀腦病)的感染性顆粒形式 ("PrPsc")和在合適的條件下轉(zhuǎn)化成感染性形式的非感染性形式(“ft~PG”)。朊病毒顆粒主要(若不僅)由PrP基因編碼的分子組成。如本文中所使用的，“朊病毒”包括在所使用的任何動(dòng)物中，且特別是在人和馴養(yǎng)家畜中引起所有或任何這些疾病或其它疾病的所有形式的朊病毒。如本文中所描述的，“淀粉樣蛋白生成性疾病”指在身體中形成淀粉樣斑或淀粉樣沉積物的疾病。在多種病癥，諸如糖尿病、AD、瘙癢病、BSE、CJD、慢性萎縮病(CWD)、相關(guān)傳染性海綿狀腦病(TSE)、和本文中所公開的其它疾病中找到淀粉樣蛋白形成。然而，本發(fā)明不限于淀粉樣蛋白生成性疾病，而且可用于診斷和治療與蛋白質(zhì)的特定構(gòu)象或聚集狀態(tài)有關(guān)的任何疾病或狀況。術(shù)語(yǔ)“Αβ蛋白”在本文中用于指所有形式的Αβ蛋白，包括AB4tl和ΑΒ42?！唉ˇ隆?蛋白還包括所有天然存在的突變體，包括已知抑制形成聚集體的趨勢(shì)升高的天然存在的突變體。此類突變體是本領(lǐng)域中已知的，諸如那些披露于Murakami等，J. Biol. Chem. 46 46179-46187,2003的，通過(guò)提及而將其完整收入本文。“靶蛋白”在本文中用于指適合于通過(guò)本發(fā)明來(lái)靶向、檢測(cè)或鑒定的任何蛋白質(zhì)， 諸如那些能夠構(gòu)象變化的蛋白質(zhì)。如本文中所描述的，靶蛋白可以與以片層構(gòu)象表征的疾病狀態(tài)有關(guān)。靶蛋白可以是天然存在的蛋白質(zhì)?！疤烊坏摹被颉疤烊淮嬖诘摹钡鞍踪|(zhì)指自自然界中存在的來(lái)源回收的蛋白質(zhì)。天然蛋白質(zhì)會(huì)包括翻譯后修飾，包括但不限于乙?；Ⅳ然?、糖基化、磷酸化、脂質(zhì)化、酰化、和切害I]?！暗鞍踪|(zhì)”、“肽”和“多肽”可互換使用。“肽模擬物”又稱為擬肽(p^tidomimic)或模擬肽(ρ印tidomimetic)，并且指模擬肽特性的任何分子。肽模擬物包括模擬特定肽的折疊和/或二級(jí)結(jié)構(gòu)的聚合分子，及那些模擬肽的生物學(xué)或化學(xué)特性的。肽模擬物可以具有氨基酸主鏈，而且含有非天然的化學(xué)或氨基酸替代。或者，肽模擬物可以具有不同的化學(xué)主鏈，諸如3-肽、鄰氨基苯甲酰胺寡聚物、低聚(間亞苯基亞乙炔基)、寡聚尿素、OligopynolinonesJzatides和N-取代的甘氨酸寡聚物。肽模擬物可以具有不同的化學(xué)特性，諸如對(duì)蛋白酶的抗性，而保留肽特征，諸如肽折疊和肽-肽相互作用(包括例如經(jīng)由氫鍵結(jié)合等的相互作用)。可以在本發(fā)明中使用任何合適的肽模擬物，并且包括那些設(shè)計(jì)和/或構(gòu)建的，如記載于ChongsiriwatamN. P 等Proc Natl Acad Sci USA 2008，105，(8)，2794-9 ；Kirshenbaum,K.等 Current Opinion in Structural Biology 1999,9, (4), 530-535 ；Lee, B. c.等，Journal of the American Chemical Society 2005,127, (31)，10999-11009的，在此通過(guò)提及而完整收錄每篇。通過(guò)比較一種多肽的氨基酸序列與第二種多肽的序列來(lái)確定兩種多肽間的“相似性”。若一種多肽的某個(gè)氨基酸與第二種多肽的相應(yīng)氨基酸相同或者是其保守氨基酸替代， 則它與第二種多肽的相應(yīng)氨基酸是相似的。保守替代包括那些記載于Dayhoff，M. 0.編， The Atlas of Protein Sequence and Structure 5, National Biomedical Research Foundation, Washington, D. C. (1978)，及于 Argos，P. (1989)EMBO J. 8 :779-785 的。例如， 屬于下列各組之一的氨基酸代表保守變化或替代-Ala、Pro、Gly、Gin、Asn、Ser> Thr ；-Cys、Ser、Tyr、Thr ；
-Val、lie、Leu、Met、Ala、Phe ；-Lys、Arg、His ；-Phe、Tyr、Trp、Hi s ；禾口-Asp、Glu?！巴葱浴?、“...的同源物”、“同源”、“同一性”、或“相似性”指兩個(gè)多肽之間的序
列相似性，其中同一性是更嚴(yán)格的比較。同源性和同一性可以各自通過(guò)比較每種序列(其可以為了比較目的而加以比對(duì))中的位置來(lái)確定。在比較序列中的某個(gè)位置被相同氨基酸占據(jù)時(shí)，則分子在所述位置處相同。氨基酸序列的同一性程度是由氨基酸序列共享的位置處的相同氨基酸的數(shù)目的函數(shù)。氨基酸序列的同源性或相似性的程度是由氨基酸序列共享的位置處的氨基酸(即結(jié)構(gòu)相關(guān)的)的數(shù)目的函數(shù)?！盁o(wú)關(guān)的”或“非同源”序列與本文中所描述的序列之一共享10%或更小的同一性。相關(guān)序列共享超過(guò)10%序列同一性，諸如至少約15%序列同一性、至少約20%序列同一性、至少約30%序列同一性、至少約40%序列同一性、至少約50%序列同一性、至少約60%序列同一性、至少約70%序列同一性、至少約 80%序列同一性、至少約90%序列同一性、至少約95%序列同一性、或至少約99%序列同一性。術(shù)語(yǔ)“百分比同一性”指兩種氨基酸序列之間的序列同一性?？梢酝ㄟ^(guò)比較每個(gè)為了比較目的而比對(duì)的序列中的位置來(lái)確定同一性。在一個(gè)比較序列中的等同位置在另一個(gè)序列中的相同位置上被相同氨基酸占據(jù)時(shí)，則分子在所述位置處是相同的；在等同位置被相同或相似氨基酸殘基(例如在立體和/或電子性質(zhì)上相似)占據(jù)時(shí)，則分子在所述位置處可以稱為同源的(相似的)。同源性、相似性、或同一性百分比的表述指由比較序列共享的位置處的相同或相似氨基酸殘基的數(shù)目的函數(shù)?？梢允褂枚喾N比對(duì)算法和/或程序，包括FASTA、BLAST、或ENTREZ。FASTA和BLAST作為GCG序列分析包(威斯康辛大學(xué)， Madison, Wis.)的一部分可獲得，而且可以與例如缺省設(shè)置一起使用。ENTREZ經(jīng)由國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology ^formation)，國(guó)家醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室， NIH,Bethesda,Md.可獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)GCG程序用1的缺口加權(quán)來(lái)確定兩個(gè)序列的百分比同一性，例如，對(duì)每個(gè)氨基酸缺口加權(quán)，就像它是兩個(gè)序列之間的單個(gè)氨基酸錯(cuò)配一樣。用于確定序列同一性的其它技術(shù)是本領(lǐng)域中公知的并有描述的。2.靶蛋白和疾病在它們采用特定構(gòu)象或自我聚集狀態(tài)時(shí)與人或動(dòng)物疾病有關(guān)的蛋白質(zhì)是本領(lǐng)域中已知的。此類疾病的例子包括淀粉樣蛋白生成性疾病，包括阿耳茨海默氏病(AD)、腦淀粉樣血管病(CAA)、和腦血管疾病(CVD)。如本文中所使用的，“淀粉樣蛋白生成性疾病”指在身體中形成淀粉樣斑或淀粉樣沉積物的疾病。在多種病癥，諸如糖尿病、AD、瘙癢病、牛海綿狀腦病(BSE)、克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病(CJD)、慢性萎縮病(CWD)、相關(guān)傳染性海綿狀腦病(TSE)中找到淀粉樣蛋白形成。多種疾病與蛋白質(zhì)的特定結(jié)構(gòu)形式(例如“錯(cuò)折疊蛋白質(zhì)”或自我聚集的蛋白質(zhì)) 有關(guān)，而不同結(jié)構(gòu)形式的蛋白質(zhì)(例如“正常的蛋白質(zhì)“)是無(wú)害的。如此，對(duì)于這些狀況， β -片層構(gòu)象可以是一種用于檢測(cè)疾病的目標(biāo)結(jié)構(gòu)狀態(tài)，而α -螺旋和/或無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)象可以是一種確認(rèn)缺乏疾病，或者鑒定缺乏疾病的進(jìn)行性狀態(tài)的目標(biāo)結(jié)構(gòu)狀態(tài)。在許多情況中， 正常的蛋白質(zhì)是可溶的，而錯(cuò)折疊的蛋白質(zhì)形成不溶性聚集體。
以下是與特定結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)狀態(tài)有關(guān)的疾病的非限制性列表，其后面圓括號(hào)中有牽涉的蛋白質(zhì)阿耳茨海默氏病(ΑΡΡ、Αβ肽、α 1-抗胰凝乳蛋白酶、τ、非Αβ組分、早老蛋白1、早老蛋白2、apoE)；朊病毒病、CJD、瘙癢病、和BSEO^PSc) ；ALS(SOD和神經(jīng)絲)；皮克氏病(Pick小體)；帕金森病(Lewy小體中的α-突觸核蛋白)；額顳癡呆(原纖維中的 τ)；糖尿病II型(amylin)；多發(fā)性骨髓瘤-漿細(xì)胞體液不調(diào)(IgGL鏈)；家族性淀粉樣多神經(jīng)病(amyloidotic polyneuropathy)(運(yùn)甲狀腺素蛋白)；甲狀腺髓樣癌(原降鈣素)； 慢性腎衰竭(β 2-微球蛋白)；充血性心力衰竭(心房鈉尿因子)；老年性心臟和系統(tǒng)淀粉樣變(運(yùn)甲狀腺素蛋白)；慢性炎(血清淀粉樣蛋白Α)；動(dòng)脈粥樣硬化(ApoAl)；家族性淀粉樣變(凝溶膠蛋白)；和亨延頓氏病(亨延頓氏病蛋白)。還有，傳染性海綿狀腦病(TSE)； 腦淀粉樣血管病(CAA)、和腦血管疾病(CVD)中的朊病毒；和促淀粉樣性側(cè)索硬化中的超氧化物歧化酶。參見(jiàn)例如 Glenner 等，J. Neurol. Sci. 94 :1-28,1989 ；Haan 等，Clin. Neurol. Neurosurg. 92(4) :305_310，1990。經(jīng)常，這些不溶性蛋白質(zhì)形成由具有折疊片構(gòu)象的共同特征的非分枝原纖維構(gòu)成的聚集體。在CNS中，淀粉樣蛋白可以存在于腦和腦膜血管(腦血管沉積物)中及在腦實(shí)質(zhì)(斑)中。在人和動(dòng)物模型中的神經(jīng)病理學(xué)研究指示淀粉樣蛋白沉積物近端的細(xì)胞在其正常的功能上受到擾亂。參見(jiàn)例如Mandybur，Acta Neuropathol. 78 :329-331， 1989 ；Kawai 等，Brain Res. 623 142-146，1993 ；Martin 等，Am. J. Pathol. 145 1348-1381， 1994 ；Kalaria 等，Neuroi^port 6 :477-80,1995 ；Masliah 等，J. Neurosci. 16 :5795-5811, 1996。另外，其它研究指示淀粉樣蛋白原纖維實(shí)際上可以啟動(dòng)神經(jīng)變性。參見(jiàn)例如Lendon 等，J. Am. Med. Assoc. 277 :825-831，1997 ；Yankner, Nat. Med. 2 :850-852,1996 ；Selkoe, J.Biol. Chem. 271 :18295-18298,1996 ；Hardy,Trends Neurosci. 20 :154-159,1997。雖然導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯(cuò)折疊的根本分子機(jī)制沒(méi)有得到充分了解，但是所有上文所提及的神經(jīng)學(xué)病癥的共同特征是形成原纖維，其聚集在一起而形成β片層結(jié)構(gòu)。原纖維形成和隨后與斑沉積物有關(guān)的β -片層二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成經(jīng)由復(fù)雜的機(jī)制而發(fā)生，所述機(jī)制牽涉成核階段，其中蛋白質(zhì)的單體聯(lián)合以形成原纖維，接著原纖維在每個(gè)末端延伸。如此，能夠破壞原纖維形成的肽、蛋白質(zhì)或抗體探針會(huì)阻止疾病進(jìn)展，而且如此是有治療意義的。另外， 能夠與患病蛋白質(zhì)的特定自我結(jié)合狀態(tài)結(jié)合的藥劑是可用于檢測(cè)并量化特定形式的錯(cuò)折疊蛋白質(zhì)，及了解疾病進(jìn)展的診斷工具。如此，能夠與特定自我聚集狀態(tài)的特定蛋白質(zhì)結(jié)合的高度選擇性肽藥劑作為檢測(cè)劑及供治療性應(yīng)用都是有用的。本發(fā)明提供了用于檢測(cè)與疾病有關(guān)的錯(cuò)折疊靶蛋白的肽探針和方法。此類錯(cuò)折疊蛋白質(zhì)可以展現(xiàn)并增加片層二級(jí)結(jié)構(gòu)或構(gòu)象，而且可以形成不溶性聚集體、原纖維或沉積物，諸如作為此類疾病的標(biāo)志的斑。(i)淀粉樣蛋白生成性疾病淀粉樣β蛋白(Αβ )是淀粉樣蛋白生成性疾病諸如阿耳茨海默氏病(AD)、腦淀粉樣血管病(CAA)、和腦血管疾病(CVD)的主要成因劑。在健康個(gè)體的血漿和腦脊液中找到可溶性Αβ，而且疾病表現(xiàn)為與形成在患病個(gè)體中找到的斑或聚集體的不溶性原纖維關(guān)聯(lián)。Αβ是通過(guò)在數(shù)個(gè)位點(diǎn)之任一處切割淀粉樣β前體蛋白(APP)，產(chǎn)生數(shù)種形式的 A β而生成的。在淀粉樣斑中找到的兩種豐富的形式是A β H0 (又稱為A β 40)和A β卜42 (又稱為A β 42)，其是通過(guò)APP的備選羧基端截短而生成的。參見(jiàn)例如klkoe等，PNAS USA 85:7341-7345，1988 ；Selkoe, Trends Neurosci. 16 :403-409,1993。Aβ 40 禾口 Aβ 42 具有相同的氨基酸序列，其中Αβ 42具有兩個(gè)額外的殘基(lie和Ala)和其C端。雖然Αβ 40更豐富，但是A β 42更具原纖維生成性，而且是AD和CAA兩者的淀粉樣沉積物中的兩種的主要組分。參見(jiàn)例如mirth等，J.Mol.Biol.319 :1279-9(Κ2002)。如上文所記錄的，Αβ蛋白的所有天然存在的突變體可以是靶蛋白或者充當(dāng)本發(fā)明背景中的參照序列的基礎(chǔ)。A β 42的血漿水平升高已經(jīng)與AD及與AD的風(fēng)險(xiǎn)升高聯(lián)系起來(lái)。還有，已經(jīng)顯示了八0 42/^0 40水平的比率的量級(jí)對(duì)于々0、CAA、和其它狀況，諸如老年抑郁(late-life depression, LLMD)具有臨床意義。參見(jiàn)例如 Pomara 等.Neurochem. Res. Q006)。通常使用單克隆抗體來(lái)測(cè)定Αβ 42和Αβ 40的血漿水平。在上文所描述的AD病例中的淀粉樣沉積物外，大多數(shù)AD病例還與血管壁中的淀粉樣蛋白沉積物有關(guān)。參見(jiàn)例如Vinters H. V.， Stroke Mar-Apr ； 18 (2) :311-324,1987 ； Itoh Y.等，Neurosci. Lett. 155 (2) 144-147， 1993年6月11日。(ii)朊病毒病和傳染性海綿狀腦病朊病毒是在人和動(dòng)物中引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)海綿狀腦病的感染性病原體。潛在的朊病毒前體是一種稱為I^rP 27-30的蛋白質(zhì)，即一種聚合(聚集)成在受感染的腦中以斑塊找到的桿樣細(xì)絲的觀千道爾頓疏水性糖蛋白。正常的朊病毒蛋白(I^Pg)是一種主要具有 α螺旋和卷曲-環(huán)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞表面金屬糖蛋白。異常的形式(PrPse)是一種對(duì)蛋白酶有抗性，而且具有主要含有片層的二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象異構(gòu)體。認(rèn)為二級(jí)結(jié)構(gòu)的此構(gòu)象變化導(dǎo)致聚集和最終的在朊病毒病過(guò)程中的神經(jīng)毒性斑塊沉積物。朊病毒有關(guān)的疾病(又稱為傳染性海綿狀腦病或“TSE”)包括綿羊和山羊的瘙癢病、鹿和麋的慢性萎縮病、和牛的牛海綿狀腦病(BSE)。參見(jiàn)例如Wilesmith和 Wells, Microbiol. Immunol. 172 :21_38，1991。已經(jīng)鑒定出人的四種朊病毒病(1)庫(kù)魯病(kuru)、(2)克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)、(3) Gerstmann-Strassler-Scheinker 病(GSS)、和(4)致命性家族性失眠(fatal familial insomnia，F(xiàn)FI)。參見(jiàn)例如Gajdusek，D. C. ,Science 197 :943-969,1977 ；Medori 等N. Engl. J. Med. 326 :444-449,1992。TSE是致命性神經(jīng)變性性疾病。這些疾病以正常的蛋白酶_敏感性、宿主編碼的朊病毒蛋白(PrP-sen)的異常蛋白酶K抗性同等型(PrP-res)在腦中的形成和積累表征。PrP-res是通過(guò)翻譯后過(guò)程自PrP-sen形成的，所述翻譯后過(guò)程牽涉將 PrP-sen轉(zhuǎn)化成具有更高β -片層含量的PrP-res分子聚集體的構(gòu)象變化。PrP-res的這些大分子聚集體的形成與TSE-介導(dǎo)的腦病理學(xué)緊密相關(guān)，其中在腦中形成ft~P-res的淀粉樣沉積物，其最終變?yōu)椤昂＞d狀”(充滿孔)。細(xì)胞蛋白質(zhì)I^rP-sen是一種由在人中位于染色體20上的基因編碼的唾液酸糖蛋白。PrP基因在神經(jīng)和非神經(jīng)組織兩者中表達(dá)，在神經(jīng)元中找到其mRNA的最高濃度。Prp 基因的序列披露于美國(guó)專利No. 5，565，186，通過(guò)提及而將其收入本文。3.構(gòu)象動(dòng)力肽本文中描述了可用于例如檢測(cè)具有特定構(gòu)象的靶蛋白，包括錯(cuò)折疊蛋白質(zhì)或具有可與疾病有關(guān)的片層二級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的構(gòu)象動(dòng)力肽。所述肽在診斷與此類靶蛋白有關(guān)的疾病或其風(fēng)險(xiǎn)，及治療與此類靶蛋白有關(guān)的疾病的方法中也是有用的。所述肽作為針對(duì)靶蛋白的探針是有用的，所述靶蛋白能夠展現(xiàn)出或展現(xiàn)出與淀粉樣蛋白生成性疾病有關(guān)的片層構(gòu)象。所述肽能夠采用無(wú)規(guī)卷曲/α-螺旋構(gòu)象和β-片層構(gòu)象兩者。在一些實(shí)施方案中，所述肽在結(jié)合展現(xiàn)出片層構(gòu)象的靶蛋白后采用片層構(gòu)象。在其它實(shí)施方案中，所述肽在結(jié)合展現(xiàn)出片層構(gòu)象的靶蛋白后采用不太有序 (例如減少的β片層)構(gòu)象。先前已經(jīng)描述了包含A β蛋白序列(SEQ ID NO 1)的氨基酸殘基16_35的肽探針。 此類探針含有負(fù)責(zé)分子內(nèi)片層形成和蛋白質(zhì)聚集兩者的疏水核心。雖然此“野生型”肽如在有機(jī)溶劑中的基于纖維的測(cè)定法中所預(yù)期的那樣運(yùn)行(例如，其在沒(méi)有底物的情況中在40%TFE中具有α螺旋結(jié)構(gòu)，而且在引入Αβ原纖維底物后轉(zhuǎn)變成β-片層結(jié)構(gòu))，但是其它特性使其在體外測(cè)定法中使用不太理想。例如，它在水溶液中具有低溶解度，而且其 β -片層結(jié)構(gòu)在熱力學(xué)上較強(qiáng)，并對(duì)構(gòu)象變化有抗性。如此，已經(jīng)設(shè)計(jì)出具有更期望的特征以改善在體外測(cè)定法和體內(nèi)應(yīng)用中的性能的肽探針。如本文中更為詳細(xì)地描述的，在一些實(shí)施方案中，肽探針具有相對(duì)于參照序列包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、替代或刪除的變體序列，使得(A)所述變體序列的無(wú)規(guī)卷曲/ α-螺旋構(gòu)象比由所述參照氨基酸序列組成的探針在氧化環(huán)境中更穩(wěn)定和/或(B)無(wú)規(guī)卷曲/ α -螺旋構(gòu)象的所述變體序列的N端與C端之間的距離與β-片層構(gòu)象的所述變體序列的N端與C端之間的距離不同和/或(C)所述變體序列在結(jié)合展現(xiàn)出β-片層構(gòu)象的靶蛋白后比所述參照序列更有效地采用片層構(gòu)象。另外/或者(特別關(guān)于上述實(shí)施方案(C))，肽探針可以具有相對(duì)于參照序列包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、替代或刪除的變體序列，使得(D)所述變體序列在結(jié)合展現(xiàn)出 β-片層構(gòu)象的靶蛋白后采用不太有序或減少的片層構(gòu)象。在一些更具體的實(shí)施方案中，(E)所述變體序列的片層結(jié)構(gòu)在熱力學(xué)上沒(méi)有由所述參照序列組成的探針的片層結(jié)構(gòu)強(qiáng)。另外/或者，肽探針可以具有相對(duì)于參照序列包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、替代或刪除的變體序列，使得(F)變體序列比由參照序列組成的探針具有升高的穩(wěn)定性和/或降低的反應(yīng)性；(G)變體序列比由參照序列組成的探針具有升高的親水性和/或在水溶液中的溶解度和/或(H)變體序列比由參照序列組成的探針具有額外的Αβ結(jié)合基序。另外/或者，變體序列相對(duì)于參照序列包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、替代或刪除， 使得(I)變體序列具有增強(qiáng)的形成聚集體的能力。在更具體的方面，變體序列可以包含天然存在的突變體的截短形式。還描述了用于使用和篩選肽的方法和試劑盒。依照一些實(shí)施方案，肽以構(gòu)象依賴性方式結(jié)合靶蛋白，而且經(jīng)歷自主要為無(wú)規(guī)卷曲(未結(jié)構(gòu)化的)或α-螺旋構(gòu)象向富含β-片層的構(gòu)象的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，諸如在結(jié)合展現(xiàn)出 β-片層構(gòu)象的靶蛋白后。在這些實(shí)施方案中，一般地，肽從不太有序的構(gòu)象改變成較為有序的構(gòu)象。報(bào)告模塊與這些肽的綴合可以提供用于監(jiān)測(cè)構(gòu)象轉(zhuǎn)化(諸如使用經(jīng)熒光標(biāo)記的肽經(jīng)由熒光譜的變化)的簡(jiǎn)單機(jī)制。依照其它實(shí)施方案，肽以構(gòu)象依賴性方式結(jié)合靶蛋白，而且在結(jié)合展現(xiàn)出β-片層構(gòu)象的靶蛋白后經(jīng)歷自主要為富含片層的構(gòu)象向不太有序或減少的片層構(gòu)象或增加的無(wú)規(guī)卷曲(未結(jié)構(gòu)化的)或α-螺旋構(gòu)象的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。在這些實(shí)施方案中，一般地， 肽從較為有序的構(gòu)象改變成不太有序的構(gòu)象。報(bào)告模塊與這些肽的綴合可以提供用于監(jiān)測(cè)構(gòu)象轉(zhuǎn)化(諸如使用經(jīng)熒光標(biāo)記的肽經(jīng)由熒光譜的變化)的簡(jiǎn)單機(jī)制。依照一些實(shí)施方案，將肽設(shè)計(jì)為(諸如例如通過(guò)選擇特定的氨基酸刪除、替代或添加)改善其在不同測(cè)定條件(諸如在不同PH和/或鹽條件等等下在水對(duì)有機(jī)溶劑中使用)中的性能。在描述并公開本發(fā)明的具體實(shí)施方案前，應(yīng)當(dāng)理解本文中所描述的具體材料、方法和組合物僅作為例子呈現(xiàn)，而并不限制本發(fā)明的范圍。除非另有定義，本文中所使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的意義。通過(guò)提及而將提及的列出已知方法的出版物和其它材料完整收入本文，就像以全文列出一樣。可以通過(guò)任何方法，諸如直接合成或以重組方式生成本文中所描述的肽。列出重組DNA技術(shù)的一般原則的標(biāo)準(zhǔn)參考著作包括Sambrook，J.等(1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual, 第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, N. Y. ；McPherson, Μ. J.編(1991)Directed Mutagenesis :A Practical Approach, IRL Press, Oxford ；Jones, J. (1992)Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford Science Publications, Oxford ；Austen, B. M.禾口 Westwood, 0. M. R. (1991)Protein Targeting and Secretion, IRL Press, Oxford?？梢栽趯?shí)施本發(fā)明中利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何合適的材料和/或方法。然而，描述了例示性的材料和方法。除非另有記錄，在以下描述和例子中所提及的材料、 試劑等自商業(yè)來(lái)源可獲得。如上文所記錄的，本文中所描述的構(gòu)象動(dòng)力肽可用于例如檢測(cè)具有特定構(gòu)象的靶蛋白，包括錯(cuò)折疊蛋白質(zhì)或具有可與疾病有關(guān)的片層二級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。例如，所述肽作為針對(duì)靶蛋白的探針是有用的，所述靶蛋白能夠展現(xiàn)出或展現(xiàn)出與淀粉樣蛋白生成性疾病有關(guān)的片層構(gòu)象。所述肽在診斷和治療方法中，及在篩選藥物候選物的方法中也可以是有用的。為了方便，所述肽在不減損其在其它背景中的效用的情況中在本文中稱為“探針”。在一些實(shí)施方案中，肽探針包含作為參照序列的變體的氨基酸序列，其中參照序列由經(jīng)歷構(gòu)象轉(zhuǎn)變，諸如從α-螺旋/無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)象轉(zhuǎn)變成β-片層構(gòu)象的靶蛋白的氨基酸序列組成。此類區(qū)在本文中稱為靶蛋白的“β-片層形成區(qū)”。例如，已知Αβ蛋白的氨基酸16-35包含β-片層形成區(qū)。如此，參照序列可以包含A β蛋白的氨基酸16-35或17-35。 因此，可以基于現(xiàn)有的序列和構(gòu)象信息自靶蛋白序列設(shè)計(jì)或者備選地可以憑實(shí)驗(yàn)容易地確定肽的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，參照序列由靶蛋白的天然存在的突變體，諸如已知展現(xiàn)出升高的采用片層構(gòu)象和/或形成聚集體的趨勢(shì)的突變體的片層形成區(qū)的氨基酸序列組成。Αβ突變體的例子記載于Murakami，見(jiàn)上文，并且包括替代A21G、E22G、 E22Q、E22K、和 D23N。參照序列可以包含靶蛋白的最小數(shù)目的連續(xù)氨基酸，諸如靶蛋白序列的至少約5、 至少約6、至少約7、至少約8、至少約9、至少約10、至少約11、至少約12、至少約13、至少約 14、至少約15、至少約16、至少約17、至少約18、至少約19、至少約20、至少約21、至少約22、 至少約23、至少約24、至少約25、至少約30、至少約35、至少約40、至少約45、或至少約50 個(gè)連續(xù)的氨基酸，或者這些數(shù)目間的任何范圍，諸如靶蛋白序列的約10至約25個(gè)連續(xù)的氨基酸。
肽探針自身包含至少約5個(gè)氨基酸，并且可以包括多達(dá)約300至約400個(gè)氨基酸， 或者更多，或者中間的任何大小，諸如長(zhǎng)約10個(gè)氨基酸至約50個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，肽由約5至約100、約10至約50、約10至約25、約15至約25、或約20至約25個(gè)氨基酸組成。在別的實(shí)施方案中，肽包含約17至約34個(gè)氨基酸，包括約20個(gè)氨基酸、約21個(gè)氨基酸、約22個(gè)氨基酸、約23個(gè)氨基酸、約M個(gè)氨基酸、或約25個(gè)氨基酸。不同長(zhǎng)度的肽可以展現(xiàn)出不同程度的與靶蛋白的相互作用和結(jié)合，而且得到本文中的教導(dǎo)指導(dǎo)的熟練技術(shù)人員可以選擇合適的長(zhǎng)度。在一些實(shí)施方案中，肽經(jīng)歷與靶蛋白的結(jié)構(gòu)變化相似的結(jié)構(gòu)變化。例如，在一些實(shí)施方案中，肽能夠采用無(wú)規(guī)卷曲/ α -螺旋構(gòu)象和β -片層構(gòu)象兩者，而且在結(jié)合展現(xiàn)出 β-片層構(gòu)象的靶蛋白后采用片層構(gòu)象。在其它實(shí)施方案中，肽探針以片層構(gòu)象提供，而且在與β-片層構(gòu)象的靶蛋白接觸、結(jié)合和/或相互作用后經(jīng)歷向不太有序的或減少的β-片層構(gòu)象/增加的α-螺旋構(gòu)象的構(gòu)象變化。肽可以在溶液，諸如具有約4和約10之間，諸如約5和約8之間的ρΗ，具有約0. 05 和約0.5之間的離子強(qiáng)度(在通常用氯化鹽，諸如氯化鈉或氯化鉀制備時(shí))的水溶液中提供。溶液還可以以約30%至約70% (按體積計(jì))之間，諸如約45%至約60%之間的量包含水可混合的有機(jī)材料，諸如三氟乙醇?？梢杂煤线m的緩沖系統(tǒng)諸如乙酸鹽/乙酸、Tris, 或磷酸鹽來(lái)制備溶劑。如下文更為詳細(xì)地討論的，可以使用本文中所公開的肽探針來(lái)檢測(cè)體外或體內(nèi)的靶蛋白。肽探針也可用于鑒定治療劑，諸如依照US 2008/0095706(對(duì)應(yīng)于美國(guó)專利申請(qǐng) 11/8 ，953)(通過(guò)提及而將其全部?jī)?nèi)容完整收入本文)中所描述的方法來(lái)進(jìn)行。(i)變體序列如上文所記錄的，在一些實(shí)施方案中，肽探針包含相對(duì)于參照序列包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、替代或刪除的參照序列變體的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，肽由變體序列組成。如上文所記錄的，參照序列由靶蛋白的β-片層形成區(qū)的氨基酸序列組成。在一些實(shí)施方案中，將變體序列設(shè)計(jì)為改善肽在用于檢測(cè)靶蛋白的測(cè)定法中的性能。例如，在一些實(shí)施方案中，將變體設(shè)計(jì)為使得變體序列的無(wú)規(guī)卷曲/ α -螺旋構(gòu)象比由參照氨基酸序列組成的探針在氧化環(huán)境中更穩(wěn)定。另外/或者，將變體序列設(shè)計(jì)為使得無(wú)規(guī)卷曲/ α -螺旋構(gòu)象的所述變體序列的N端與C端之間的距離與β-片層構(gòu)象的所述變體序列的N端與 C端之間的距離不同(例如大于)。另外/或者，將變體序列設(shè)計(jì)為使得所述變體序列在結(jié)合展現(xiàn)出片層構(gòu)象的靶蛋白后比所述參照序列更有效地采用片層構(gòu)象。另外/或者，將變體序列設(shè)計(jì)為使得所述變體序列在結(jié)合展現(xiàn)出β-片層構(gòu)象的靶蛋白后采用不太有序或減少的片層構(gòu)象，而且可以具有在熱力學(xué)上沒(méi)有所述參照序列的片層結(jié)構(gòu)強(qiáng)的片層結(jié)構(gòu)。另外/或者，將變體序列設(shè)計(jì)為使得變體序列具有升高的穩(wěn)定性和/ 或降低的反應(yīng)性、升高的親水性和/或溶解度、和/或額外的Αβ結(jié)合基序。另外/或者， 變體序列相對(duì)于參照序列可以包含一處或多處氨基酸刪除，使得變體序列具有增強(qiáng)的形成聚集體的能力。在一些實(shí)施方案中，將變體序列設(shè)計(jì)為提高與未結(jié)合靶蛋白的肽有關(guān)的任何信號(hào)和與結(jié)合靶蛋白的肽有關(guān)的信號(hào)之間的信號(hào)差異，諸如通過(guò)提高與肽的隨機(jī)/α-螺旋構(gòu)象有關(guān)的任何信號(hào)(例如背景信號(hào))和與肽的片層構(gòu)象有關(guān)的信號(hào)之間的信號(hào)差異來(lái)進(jìn)行。這可以通過(guò)例如降低與肽的隨機(jī)/ α -螺旋構(gòu)象有關(guān)的任何背景信號(hào)和/或提高與肽的片層構(gòu)象有關(guān)的信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些相同的設(shè)計(jì)基本原理對(duì)于肽探針也是有用的， 所述肽探針以片層構(gòu)象提供，而且在結(jié)合靶蛋白后采用不太有序或減少的片層構(gòu)象/增加的α-螺旋構(gòu)象，盡管背景信號(hào)會(huì)與探針的β-片層構(gòu)象有關(guān)。例如，可以在其N和C端之每端處或附近標(biāo)記肽探針，使得通過(guò)在各模塊彼此物理接近時(shí)，諸如在肽展現(xiàn)出使N和C端物理接近的β-片層構(gòu)象時(shí)發(fā)生的在標(biāo)記模塊間的相互作用來(lái)產(chǎn)生信號(hào)。此類信號(hào)會(huì)與肽的片層構(gòu)象有關(guān)。類似地，在肽為片層構(gòu)象時(shí)物理接近的及在肽為無(wú)規(guī)卷曲/α-螺旋構(gòu)型時(shí)遠(yuǎn)離的任何一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處標(biāo)記肽， 使得標(biāo)記物相互作用以在肽為片層構(gòu)象時(shí)發(fā)射信號(hào)。與片層構(gòu)象有關(guān)的信號(hào)可以不同于與無(wú)規(guī)卷曲/α-螺旋構(gòu)象有關(guān)的任何信號(hào)，諸如具有更大的量級(jí)和/或處于不同頻率或波長(zhǎng)。在肽探針在與靶蛋白結(jié)合后從不太有序的構(gòu)象改變成較為有序的構(gòu)象的實(shí)施方案中，例如若無(wú)規(guī)卷曲/ α -螺旋構(gòu)象容許標(biāo)記物變得足夠的物理接近以產(chǎn)生信號(hào)和/或若肽探針采用與靶蛋白的接觸、結(jié)合或相互作用(諸如可以在溶液中發(fā)生)無(wú)關(guān)的片層構(gòu)象，則可以觀察到背景信號(hào)?？梢岳缤ㄟ^(guò)使無(wú)規(guī)卷曲/α-螺旋構(gòu)象穩(wěn)定化以使與靶蛋白接觸、結(jié)合或相互作用無(wú)關(guān)的片層構(gòu)象的形成最小化來(lái)降低與肽的無(wú)規(guī)卷曲/ α-螺旋構(gòu)象有關(guān)的背景信號(hào)。例如，可以將肽探針設(shè)計(jì)為使得未結(jié)合的肽探針的無(wú)規(guī)卷曲 /α -螺旋構(gòu)象展現(xiàn)出升高的穩(wěn)定性。例如，用形成α -螺旋的殘基(諸如丙氨酸)和/或形成鹽橋的殘基(諸如組氨酸和谷氨酸)的替代可以使未結(jié)合的肽探針的無(wú)規(guī)卷曲/α-螺旋構(gòu)象穩(wěn)定化。此類升高的穩(wěn)定性通過(guò)降低標(biāo)記物會(huì)足夠的物理接近以產(chǎn)生信號(hào)的可能性來(lái)降低背景信號(hào)。如此，在一些實(shí)施方案中，肽的變體序列包含提高無(wú)規(guī)卷曲/α-螺旋構(gòu)象的穩(wěn)定性的氨基酸替代、添加和/或刪除。另外/或者，在肽為無(wú)規(guī)卷曲/ α -螺旋構(gòu)象時(shí)增加N與C端間(或者標(biāo)記物位點(diǎn)間)的距離會(huì)降低與隨機(jī)/α-螺旋構(gòu)象有關(guān)的任何信號(hào)。另外/或者，例如在肽為β-片層構(gòu)象時(shí)可以通過(guò)縮短N(yùn)與C端間(或者標(biāo)記物位點(diǎn)間)的距離來(lái)提高與肽的片層構(gòu)象有關(guān)的信號(hào)?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)建模方法來(lái)對(duì)無(wú)規(guī)卷曲/α-螺旋構(gòu)象對(duì)β-片層構(gòu)象的肽的末端間(或標(biāo)記物位點(diǎn)間)的距離計(jì)算機(jī)建模。在下文的討論中，基于Αβ蛋白的氨基酸序列來(lái)對(duì)點(diǎn)突變編號(hào)，所述Αβ蛋白的殘基16-35在圖2中列出(具有添加的C端賴氨酸殘基)。α螺旋形成和穩(wěn)定性在一些實(shí)施方案中，變體序列包含添加一個(gè)或多個(gè)具有形成α螺旋的傾向的氨基酸殘基，諸如丙氨酸(A)，或者用一個(gè)或多個(gè)具有形成α螺旋的傾向的氨基酸殘基，諸如丙氨酸(A)的替代。可以將此類氨基酸殘基引入?yún)⒄招蛄械膬?nèi)部位點(diǎn)中，或者在參照序列的任一或兩個(gè)末端處引入。在一些實(shí)施方案中，參照序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多個(gè)此類氨基酸殘基，其作為額外的殘基或替換靶蛋白的殘基(替代)。在靶蛋白是Αβ蛋白的具體實(shí)施方案中，肽探針包含變體序列SEQ ID Ν0:3(肽38)或SEQ ID Ν0:4(肽45)。 在具體的實(shí)施方案中，肽探針由SEQ ID NO :3或SEQ ID Ν0:4組成。以帶互補(bǔ)電荷的殘基引入點(diǎn)突變也可以提高形成α螺旋的傾向，諸如Αβ肽探針中的突變G29H和G33E。這些特定的替代也提高親水性和在水溶液中的溶解度。如此，在靶蛋白是Αβ蛋白的具體實(shí)施方案中，肽探針包含變體序列SEQ ID NO :2(肽22)，或者由SEQ ID NO 2 組成。在其它實(shí)施方案中，可以進(jìn)一步修飾本文中所描述的任何其它變體以包括丙氨酸殘基或帶互補(bǔ)電荷的殘基，從而增強(qiáng)α螺旋形成。鹽橋在一些實(shí)施方案中，變體序列包含一處或多處氨基酸替代或添加，其引起能夠形成鹽橋的氨基酸或者引入能夠與目前存在于參照序列中的氨基酸形成鹽橋的氨基酸。鹽橋是帶負(fù)電荷與帶正電荷的氨基酸間的弱離子相互作用。在一些實(shí)施方案中，氨基酸替代或添加在能夠與序列中的另一個(gè)氨基酸形成鹽橋的位置中引入一個(gè)或多個(gè)正電氨基酸殘基， 諸如精氨酸或賴氨酸。在一些實(shí)施方案中，氨基酸替代或添加在能夠與序列中的另一個(gè)氨基酸形成鹽橋的位置中引入一個(gè)或多個(gè)負(fù)電氨基酸殘基，諸如天冬氨酸或谷氨酸。在一些實(shí)施方案中，氨基酸替代或添加在能夠彼此或與序列中的其它氨基酸形成一個(gè)或多個(gè)鹽橋的位置中引入一個(gè)或多個(gè)正電和一個(gè)或多個(gè)負(fù)電氨基酸殘基兩者。在其它實(shí)施方案中，鹽橋包含一個(gè)或多個(gè)可離子化的殘基諸如組氨酸、酪氨酸或絲氨酸。在具體的實(shí)施方案中，變體序列包含在能夠形成一個(gè)或多個(gè)鹽橋的位置中引入一個(gè)或多個(gè)組氨酸殘基和/或精氨酸殘基和/或賴氨酸殘基和/或谷氨酸和/或天冬氨酸殘基和/或酪氨酸殘基和/或絲氨酸殘基的氨基酸替代或添加。在靶蛋白是Αβ蛋白的具體實(shí)施方案中，肽探針包含SEQ ID Ν0:2_4之一的變體序列(肽22、肽38、或肽45)。在具體的實(shí)施方案中，肽探針由SEQ ID Ν0:2_4之一組成。 在其它具體的實(shí)施方案中，肽包含SEQ ID NO :14-17之一的變體序列(肽22變異1 ；肽22 變異2、肽59、肽77)。在具體的實(shí)施方案中，肽由SEQ ID NO 14-17之一組成。在其它實(shí)施方案中，本文中所描述的任何其它變體可以進(jìn)一步修飾為包括鹽橋。如上文所記錄的，可以將鹽橋設(shè)計(jì)為使肽的α-螺旋構(gòu)象穩(wěn)定化。另外/或者，鹽橋的存在提供了關(guān)于使用肽來(lái)控制測(cè)定法中產(chǎn)生的信號(hào)的機(jī)制。例如，測(cè)定緩沖液的鹽和 /或PH可以選擇或調(diào)節(jié)為加強(qiáng)或減弱鹽橋，并且如此控制α-螺旋構(gòu)象的穩(wěn)定性和β-片層構(gòu)象的形成。β-片層形成和穩(wěn)定性在一些實(shí)施方案中，變體序列包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、刪除和/或替代，其便于在與靶蛋白接觸、結(jié)合或相互作用后(或者在其它有助于片層形成的條件下)采用
片層構(gòu)象，使得變體序列(或包含其的肽)在與靶蛋白接觸、結(jié)合或相互作用后(或者在其它有助于片層形成的條件下)比參照序列更有效地采用片層構(gòu)象。此類肽探針可以比參照序列展現(xiàn)出升高的對(duì)檢測(cè)具有片層構(gòu)象的靶蛋白的靈敏性。在一些實(shí)施方案中，變體序列包含天然存在的突變體，諸如展現(xiàn)出升高的采用片層構(gòu)象和 /或形成聚集體的趨勢(shì)的突變體的片層形成區(qū)中找到的一處或多處氨基酸替代。例如，包含一處或多處替代I32S或Ε22Ρ的變體在此背景中是有用的，諸如SEQ ID NO 5或 7。其它例子包括包含替代E22Q( “Dutch”)或E2I( "Italian")的變體，諸如SEQ ID NO :11或12。在另一個(gè)實(shí)施方案中，變體替代包含一處或多處替代F19S和L34P，諸如SEQ ID NO :8。其它變體可以自本領(lǐng)域中已知的突變體，諸如那些披露于Murakami等，J. Biol. Chem. 46 :46179-46187,2003的突變體衍生。例如，變體可以包含一處或多處替代A21G、E22G( “Arctic”)、和D23N。此類變體的例子包括SEQ ID N0:9、10或13。另外，本文中所描述的任何變體可以進(jìn)一步包含基于這些或其它已知突變的一處或多處點(diǎn)突變。例如，基于肽22變體的變體可以進(jìn)一步包含一處或多處點(diǎn)突變，諸如E22K、E22Q、或E22G。此類變體的例子包括SEQ ID N0:19-21。在靶蛋白是Αβ蛋白的具體實(shí)施方案中，肽探針包含SEQ ID NO :5、7-13或18-21之任一項(xiàng)的變體序列。在具體的實(shí)施方案中，肽探針由SEQ ID NO: 5、7-13、或18-21之任一項(xiàng)組成。在其它實(shí)施方案中，肽探針具有相對(duì)于參照序列包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、替代或刪除的變體序列，使得變體序列在結(jié)合展現(xiàn)出β -片層構(gòu)象的靶蛋白后采用不太有序的或減少的β-片層構(gòu)象和/或增加的α-螺旋構(gòu)象。此類變體的例子包括SEQ ID NO 2(肽 22)、SEQ ID N0:3(肽 38)、SEQ ID N0:4(肽 45)、SEQ ID NO :14(肽 22 變異 1)、和 SEQ ID N0:15(肽22變異2)。在靶蛋白是Αβ蛋白的具體實(shí)施方案中，肽探針包含SEQ ID NO 2-4或14-15之任一項(xiàng)的變體序列。在具體的實(shí)施方案中，肽探針由SEQ ID NO :2_4或 14-15之任一項(xiàng)組成。在更具體的實(shí)施方案中，變體序列相對(duì)于參照序列包含一處或多處別的氨基酸添加、替代或刪除，使得變體序列的片層結(jié)構(gòu)在熱力學(xué)上沒(méi)有由參照序列組成的探針的 β-片層結(jié)構(gòu)穩(wěn)定或強(qiáng)。例如，變體序列SEQ ID NO :2相對(duì)于編號(hào)的野生型序列可以包含一處或多處別的替代諸如？195、5260、擬90、1310丄340、和1^34 。參見(jiàn)例如，下文表中的肽 AD323(SEQ ID NO 28) ；AD325(SEQ ID NO 29) ；AD330(SEQ ID NO 30) ；AD329(SEQ ID NO: 31) ；AD328 (SEQ ID NO 32) ；AD327 (SEQ ID NO 33) ；GM6 (SEQ ID NO 34) ；GM6 變異 1 (SEQ ID N0:35)。肽I32S(SEQ ID NO 5)也可以落入此種類中。在靶蛋白是A β蛋白的具體實(shí)施方案中，肽探針可以包含SEQ ID NO :5或觀-35之任一項(xiàng)的變體序列，或者可以由SEQ ID NO :5或沘-；35之任一項(xiàng)組成。升高的穩(wěn)定性和/或降低的反應(yīng)性在一些實(shí)施方案中，變體序列包含一處或多處使變體(或包含其的肽)比參照序列在氧化環(huán)境中更穩(wěn)定的氨基酸添加、刪除和/或替代。在一些實(shí)施方案中，用抗氧化的殘基，諸如丙氨酸殘基替換一個(gè)或多個(gè)甲硫氨酸殘基，諸如C端甲硫氨酸殘基。在靶蛋白是 Αβ蛋白的具體實(shí)施方案中，肽包含變體序列SEQ ID Ν0:6(肽AD250)。在具體的實(shí)施方案中，肽由SEQ ID Ν0:6組成。在其它實(shí)施方案中，可以通過(guò)用對(duì)氧化更具抗性的殘基，諸如丙氨酸殘基替換甲硫氨酸殘基，諸如C端甲硫氨酸殘基來(lái)進(jìn)一步修飾本文中所描述的任何其它變體。溶解度和/或親水性在一些實(shí)施方案中，變體序列包含一處或多處使變體(或包含其的肽)更親水和/ 或在水環(huán)境中更可溶的氨基酸添加、刪除和/或替代。例如，在C和/或N端處或附近包含一個(gè)或多個(gè)帶電荷的殘基(諸如谷氨酸和/或d-精氨酸)的變體展現(xiàn)出升高的親水性和在水溶液中的溶解度。例如，變體序列可以包含1、2、3或更多個(gè)N端、C端、或內(nèi)部谷氨酸和/ 或d-精氨酸殘基。在靶蛋白是Αβ蛋白的具體實(shí)施方案中，肽探針可以包含變體AD272 (SEQ ID NO :22)、AD316(SEQ ID NO :23)、AD305 (SEQ ID NO :24)、和 AD271 (SEQ ID NO :26)，或者可以由這些序列組成。在其它實(shí)施方案中，可以通過(guò)在N端或C端處或附近添加1、2、3或更多個(gè)谷氨酸和/或d-精氨酸殘基來(lái)進(jìn)一步修飾本文中所描述的任何其它變體。
另外/或者，可以將肽探針與親水性模塊，諸如水溶性聚乙二醇(PEG)，諸如具有約1、5、6、10、12、15、20、25、30或35kDa的分子量的PEG，包括具有約IOkDa的分子量的 PEG( “PEG10”)綴合。在表1中在下文的例子(AD274)中描述了包含野生型β -片層形成序列(SEQ ID NO 1)的此類肽探針的例子?？梢詫⒈疚闹兴枋龅娜魏巫凅w或肽探針與親水性模塊綴合。AB結(jié)合基序在一些實(shí)施方案中，變體序列包含一處或多處提供額外的Αβ結(jié)合基序，諸如包含氨基酸殘基toxEG(SEQ ID NO :2 (其中“X”代表任何氨基酸殘基)的基序的氨基酸添加、刪除和/或替代。此類變體序列的例子包括P59 (SEQ ID NO :17)和P77(SEQ ID NO: 16)。在靶蛋白是Αβ蛋白的具體實(shí)施方案中，肽探針可以包含SEQ ID Ν0:16或17之任一項(xiàng)的變體序列，或者可以由SEQ ID Ν0:16或17之任一項(xiàng)組成。在其它實(shí)施方案中，本文中所描述的任何其它變體可以進(jìn)一步修飾為包括GxxEG基序。應(yīng)當(dāng)理解，本文中所描述的肽可以包含上文所描述的添加、替代和刪除的一種或多種任意組合。在一些實(shí)施方案中，在上文所描述的氨基酸添加和替代外，肽可以包含一個(gè)或多個(gè)便于標(biāo)記的氨基酸殘基的添加或替代。在一些實(shí)施方案中，肽包含一個(gè)或多個(gè)賴氨酸殘基以便于標(biāo)記，諸如用芘模塊標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，肽在其C端、N端、或這兩端處或附近包含賴氨酸殘基。例如，肽可以在其C端、N端、或這兩端包含賴氨酸殘基。在其它實(shí)施方案中，賴氨酸殘基在肽中的其它位點(diǎn)，正如可適用于標(biāo)記的，如上文所討論的。在參照序列包含Αβ蛋白的氨基酸16(賴氨酸)的實(shí)施方案中，可以使用該賴氨酸殘基進(jìn)行標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)由C端賴氨酸上的側(cè)鏈來(lái)標(biāo)記肽探針。在一些實(shí)施方案中，肽探針具有替換C端羧基基團(tuán)的C端酰胺基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，變體序列相對(duì)于參照序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10處氨基酸添加、替代或刪除。在其它實(shí)施方案中，變體序列由長(zhǎng)約10至約25個(gè)氨基酸組成，并且變體序列相對(duì)于參照序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10處氨基酸添加、替代或刪除。在另一個(gè)實(shí)施方案中，變體序列與參照序列具有約99 %、約98 %、約97 %、約96 %、約95 %、 約 90%、約 85%、約 80%、約 75%、約 70%、約 66%、約 65%、約 60%、約 55%、約 50%、約 45%、約40%、約35%、約30%、約25%、約20%、約15%、或約10%同一性。在一些實(shí)施方案中，變體序列與參照序列具有約66%至約97%同一性?？梢酝ㄟ^(guò)在下文實(shí)施例中所描述并例示的方法來(lái)評(píng)估任何給定肽的適合性。例如，可以如實(shí)施例1和實(shí)施例5中所例示的那樣評(píng)估肽采用β-片層構(gòu)象的能力?？梢匀鐚?shí)施例3-5中所例示的那樣確認(rèn)肽結(jié)合靶蛋白并發(fā)射信號(hào)的能力。(ii)標(biāo)記物本文中所公開的探針可以包含一種或多種可檢測(cè)標(biāo)記物。例如，可以將探針與標(biāo)記物共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)或融合。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記物選擇為容許檢測(cè)探針的特定構(gòu)象，諸如在探針與靶蛋白結(jié)合時(shí)采用的構(gòu)象。在此情況中，標(biāo)記物在探針為第一、未結(jié)合構(gòu)象(諸如主要為無(wú)規(guī)卷曲/α-螺旋構(gòu)象或不太有組織的或不太密的形式)時(shí)可以發(fā)射第一信號(hào)(或無(wú)信號(hào))，而在探針在與靶蛋白結(jié)合后經(jīng)歷構(gòu)象轉(zhuǎn)變(諸如主要為片層構(gòu)象或較有組織的或較密的形式)時(shí)可以發(fā)射第二信號(hào)，或者無(wú)信號(hào)(即探針被猝滅)。互補(bǔ)的一般原則適用于如下的肽探針，其在與靶蛋白結(jié)合后從較為有序的構(gòu)象改變成不太有序的構(gòu)象，其中第一信號(hào)與探針的第一、未結(jié)合的構(gòu)象(諸如片層構(gòu)象或較有組織的或較密的形式)有關(guān)，而在探針在與靶蛋白結(jié)合后經(jīng)歷構(gòu)象轉(zhuǎn)變(諸如主要為無(wú)規(guī)卷曲/α-螺旋構(gòu)象或不太有組織的或不太密的形式)時(shí)發(fā)射第二信號(hào)或無(wú)信號(hào)。第一信號(hào)和第二信號(hào)可以在一種或多種屬性，諸如強(qiáng)度、波長(zhǎng)等方面不同。在信號(hào)包括發(fā)射光的實(shí)施方案中，第一信號(hào)和第二信號(hào)可以在激發(fā)波長(zhǎng)和/或發(fā)射波長(zhǎng)方面不同。在探針經(jīng)歷構(gòu)象轉(zhuǎn)變時(shí)產(chǎn)生的信號(hào)可以源自結(jié)合同一探針的標(biāo)記物間的相互作用或者可以源自結(jié)合不同探針的標(biāo)記物間的相互作用。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記物和標(biāo)記位點(diǎn)選擇為使得標(biāo)記物基于探針的構(gòu)象而確實(shí)相互作用或不相互作用，例如使得標(biāo)記物在探針為其未結(jié)合構(gòu)象時(shí)不相互作用，而在探針在與靶蛋白結(jié)合后經(jīng)歷構(gòu)象轉(zhuǎn)變時(shí)確實(shí)相互作用，以產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)(包括猝滅)，或者反之亦然。根據(jù)探針的結(jié)合狀態(tài)，例如根據(jù)探針在與靶蛋白結(jié)合后是否已經(jīng)經(jīng)歷構(gòu)象轉(zhuǎn)變，這可以通過(guò)選擇離得更遠(yuǎn)或更接近地在一起的標(biāo)記位點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，與結(jié)合的探針有關(guān)的信號(hào)的量級(jí)與所檢測(cè)的靶蛋白的量正相關(guān)。如此，本發(fā)明的方法容許檢測(cè)并量化靶蛋白。例如，可以使用熒光標(biāo)記物(包括受激子、FRET或熒光團(tuán)/猝滅劑標(biāo)記物對(duì))以容許檢測(cè)探針的特定構(gòu)象，諸如在探針與靶蛋白諸如錯(cuò)折疊的Αβ蛋白結(jié)合時(shí)采用的構(gòu)象。 在這些實(shí)施方案中，用第一標(biāo)記物和第二標(biāo)記物(每個(gè)是受激子、FRET或熒光團(tuán)/猝滅劑對(duì)的互補(bǔ)成員)在分開的位點(diǎn)處標(biāo)記探針。例如，形成受激子的標(biāo)記物在探針為其未結(jié)合狀態(tài)時(shí)可以發(fā)射其單體信號(hào)，而可以在探針在與靶蛋白結(jié)合后經(jīng)歷使標(biāo)記物更為物理接近的構(gòu)象轉(zhuǎn)變時(shí)發(fā)射其受激子信號(hào)。這在圖10，頂部小圖中示意性顯示。類似地，F(xiàn)RET標(biāo)記物可以在探針經(jīng)歷使標(biāo)記物更為物理接近的構(gòu)象轉(zhuǎn)變時(shí)發(fā)射其FRET信號(hào)。這在圖10，底部小圖B中示意性顯示。另一方面，熒光團(tuán)/猝滅劑標(biāo)記物對(duì)可以在探針為其未結(jié)合狀態(tài)時(shí)發(fā)射熒光團(tuán)信號(hào)，并可以在探針經(jīng)歷使標(biāo)記物更為物理接近的構(gòu)象轉(zhuǎn)變時(shí)猝滅所述信號(hào)。如上文所記錄的，可以將標(biāo)記物定位為使得在探針在與靶蛋白結(jié)合后經(jīng)歷構(gòu)象轉(zhuǎn)變時(shí)發(fā)生信號(hào)的相反變化?；蛘撸瑢?duì)于在與靶蛋白聯(lián)合或結(jié)合后從較為有序的構(gòu)象改變成不太有序的構(gòu)象的探針，形成受激子的標(biāo)記物可以在探針為其未結(jié)合狀態(tài)時(shí)發(fā)射其受激子信號(hào)，并在探針在與靶蛋白結(jié)合后經(jīng)歷降低標(biāo)記物的物理接近性的構(gòu)象轉(zhuǎn)變時(shí)發(fā)射其單體信號(hào)。這在圖10， 底部小圖A中示意性顯示。同樣地，F(xiàn)RET標(biāo)記物可以在探針為其未結(jié)合狀態(tài)時(shí)發(fā)射其FRET 信號(hào)，并在探針經(jīng)歷降低標(biāo)記物的物理接近性的構(gòu)象轉(zhuǎn)變時(shí)發(fā)射不同信號(hào)或無(wú)信號(hào)。另一方面，熒光團(tuán)/猝滅劑標(biāo)記物對(duì)可以在探針為其未結(jié)合狀態(tài)(其中各標(biāo)記物極其物理接近) 時(shí)被猝滅，而且可以在探針為其未結(jié)合狀態(tài)(其降低標(biāo)記物的物理接近性)時(shí)發(fā)射熒光團(tuán)信號(hào)。再次，可以將標(biāo)記物定位為使得在探針在與靶蛋白結(jié)合后經(jīng)歷構(gòu)象轉(zhuǎn)變時(shí)發(fā)生信號(hào)的相反變化。在一些實(shí)施方案中，用可檢測(cè)標(biāo)記物對(duì)探針末端加帽(在肽的一個(gè)或兩個(gè)末端)。 在一些實(shí)施方案中，探針在其C端、N端、或這兩端處或附近包含可檢測(cè)標(biāo)記物。例如，探針在其C端、N端、或這兩端、或在探針在與靶蛋白有關(guān)的Αβ蛋白聚集體結(jié)合后經(jīng)歷構(gòu)象轉(zhuǎn)變時(shí)產(chǎn)生信號(hào)的任何其它位點(diǎn)處可以包含可檢測(cè)標(biāo)記物。如此，例如，標(biāo)記物位點(diǎn)可以選自 (i) N端和C端；(ii) N端和與C端不同的(other than)分開位點(diǎn)；(iii) C端和與N端不同的分開位點(diǎn)；和(iv)與N端和C端不同的兩個(gè)位點(diǎn)。與N端或C端不同的標(biāo)記物位點(diǎn)可以是肽探針內(nèi)的任何位點(diǎn)，包括離末端殘基為1、2、3、4、5、或更多個(gè)殘基。下文表1中的肽探針 AD272(SEQ ID NO :22)、AD316 (SEQ ID NO :23)、AD305 (SEQ ID NO :24)、AD271 (SEQ ID N0:26)JPAD273(SEQ ID NO :27)是肽探針的例子，其中標(biāo)記物之一在末端附近而不是在末端。在這些探針中，標(biāo)記物位點(diǎn)離N端或C端為2或3個(gè)殘基。在一些實(shí)施方案中，在N端氨基酸殘基的胺基團(tuán)上提供N端標(biāo)記物。在其它實(shí)施方案中，在N端處或附近的氨基酸殘基的側(cè)鏈上，諸如在N端處或附近的賴氨酸(K)殘基的側(cè)鏈上提供N端標(biāo)記物。標(biāo)記物位點(diǎn)可以選擇為改變肽探針的熒光特性，并改善或優(yōu)化信噪比。下文表1中描繪的肽探針AD266(SEQ ID NO :36)和A擬68 (SEQ ID NO :37)是具有在第一個(gè)N端賴氨酸殘基的側(cè)鏈上提供的N端標(biāo)記物的肽探針的例子。在一些實(shí)施方案中，在N端胺上提供N端標(biāo)記物，并在C端賴氨酸殘基的側(cè)鏈上提供C端標(biāo)記物。在其它實(shí)施方案中，在N端賴氨酸殘基的側(cè)鏈上提供N端標(biāo)記物，并在C端賴氨酸殘基的側(cè)鏈上提供C端標(biāo)記物。在一個(gè)實(shí)施方案中，芘模塊存在于探針的每個(gè)末端處或附近，并且芘單體信號(hào)與芘受激子信號(hào)的比率取決于探針的構(gòu)象。例如，單體信號(hào)可以在探針為其未結(jié)合狀態(tài)時(shí)占優(yōu)勢(shì)，并且受激子信號(hào)可以在探針在與靶蛋白結(jié)合后經(jīng)歷構(gòu)象轉(zhuǎn)變時(shí)占優(yōu)勢(shì)(或者受激子信號(hào)可以升高，而不必要變得占優(yōu)勢(shì))，或者反之亦然。如此，可以測(cè)量芘單體信號(hào)與芘受激子信號(hào)的比率。存在于探針上的其它位點(diǎn)處的芘模塊在此背景中也可以是有用的，只要受激子形成是構(gòu)象依賴性的，其基于肽探針的結(jié)合或未結(jié)合狀態(tài)。表1包括在N端和C端之每端處或附近用芘(“ (PBA) ”)標(biāo)記的許多肽探針?？梢酝ㄟ^(guò)光學(xué)特性的變化來(lái)檢測(cè)受激子的形成。根據(jù)熒光團(tuán)標(biāo)記物，通過(guò)已知的熒光測(cè)定技術(shù)，包括UV、1R、CD、NMR、或熒光等來(lái)測(cè)量此類變化。光學(xué)特性的這些變化的量級(jí)與已經(jīng)采用與信號(hào)有關(guān)的構(gòu)象的探針的量成正比，并且因此與存在的靶蛋白或結(jié)構(gòu)的量成正比。雖然這些實(shí)施方案已經(jīng)在受激子對(duì)方面更為詳細(xì)地進(jìn)行了描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，相似的考慮因素適用于FRET和熒光團(tuán)/猝滅劑對(duì)。表1包括在N端和C端之每端處或附近用FRET或熒光團(tuán)/猝滅劑對(duì)標(biāo)記物標(biāo)記的許多肽探針。例如，可以在一端用芘而在另一端用猝滅劑諸如Dabcyl熒光猝滅劑(4_ 二甲基氨基苯基)二氮烯基苯甲酸)標(biāo)記肽探針，如以AD326(SEQ ID NO :43)所例示的?；蛘?，可以在一端用熒光團(tuán) EDANS (5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸)而在另一端用猝滅劑諸如Dabcyl標(biāo)記肽探針， 如以 AD309(SEQ ID NO :44)、AD306 (SEQ ID NO :45)、AD303 (SEQ ID NO :46)、AD302 (SEQ ID NO 47)、AD301(SEQ ID NO :48)、和 AD300 (SEQ ID NO :49)例示的?；蛘撸梢栽谝欢擞玫?biāo)記物(5-二甲基氨基萘-1-磺?；?而在另一端用色氨酸殘基(Trp，W)來(lái)標(biāo)記肽探針， 以提供FRET對(duì)標(biāo)記，如以A^95 (SEQ ID NO :50)例示的。或者，可以在一端用5 (6)羧基熒光素(FAM)而在另一端用EDANS來(lái)標(biāo)記肽探針，如以AD^4 (SEQ ID NO 51) ,AD293 (SEQ ID NO 52)、AD292 (SEQ ID NO :53)、AD291 (SEQ ID NO :54)、和 AD290 (SEQ ID NO :55)所例示的。這些例示性的肽探針包含本文中別的地方所描述的野生型和變體序列，而且表明本文中所描述的任何肽探針可以在多個(gè)標(biāo)記物位點(diǎn)處用任何標(biāo)記物對(duì)來(lái)標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，將標(biāo)記物與賴氨酸殘基，包括N端、C端或內(nèi)部賴氨酸殘基綴合。在其它實(shí)施方案中，將標(biāo)記物與谷氨酸殘基，包括N端、C端或內(nèi)部谷氨酸殘基綴合。在一些實(shí)施方案中，將一個(gè)標(biāo)記物與賴氨酸殘基綴合，而將另一個(gè)標(biāo)記物與谷氨酸殘基綴合。熟練技術(shù)人員會(huì)容易地認(rèn)可標(biāo)記物位點(diǎn)的其它組合和排列，而且其包含在本發(fā)明中。此外，雖然這些實(shí)施方案已經(jīng)參照每個(gè)肽探針使用兩個(gè)標(biāo)記物進(jìn)行了描述，但是應(yīng)當(dāng)理解，可以使用多個(gè)標(biāo)記物。例如，一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物可以存在于每個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)處，或者多個(gè)標(biāo)記物可以各自存在于探針上的不同標(biāo)記位點(diǎn)處。在這些實(shí)施方案中，標(biāo)記物可以產(chǎn)生獨(dú)立的信號(hào)，或者可以敘述為受激子對(duì)、FRET對(duì)、信號(hào)/猝滅劑等。例如，一個(gè)位點(diǎn)可以包含1、2、3、4或更多個(gè)芘模塊，而另一個(gè)位點(diǎn)可以包含相應(yīng)的猝滅劑。如上文所記錄的，本文中所公開的探針可以包含可檢測(cè)標(biāo)記物。例如，探針可以包含與標(biāo)記物共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)或融合的肽探針。在一些實(shí)施方案中，用可檢測(cè)標(biāo)記物來(lái)對(duì)肽探針末端加帽(在肽的一個(gè)或兩個(gè)末端)。在一些實(shí)施方案中，肽在其C端、N端、或這兩端處或附近包含可檢測(cè)標(biāo)記物。例如，肽在其C端、N端、或這兩端、或在肽采用β-片層構(gòu)象，或與其結(jié)合狀態(tài)有關(guān)的其它構(gòu)象時(shí)產(chǎn)生信號(hào)的任何其它位點(diǎn)處可以包含可檢測(cè)標(biāo)記物。在一些實(shí)施方案中，用大小范圍為約1至約5個(gè)氨基酸的小的疏水性肽來(lái)對(duì)C端和 N端兩者末端加帽。這些肽可以是天然的或合成的，但是優(yōu)選的是天然的(即自靶蛋白衍生)。在肽采用片層構(gòu)象(或其它靶蛋白有關(guān)的構(gòu)象)時(shí)產(chǎn)生的信號(hào)可以源自結(jié)合同一肽的標(biāo)記物間(肽內(nèi))的相互作用和/或可以源自結(jié)合不同肽的標(biāo)記物間(肽間)的相互作用。例如，片層構(gòu)象的肽可以自我結(jié)合，使得結(jié)合不同肽分子的標(biāo)記物在物理上足夠接近以產(chǎn)生肽間信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，使用標(biāo)記物來(lái)檢測(cè)肽的特定構(gòu)象，諸如片層構(gòu)象或其它靶蛋白有關(guān)的構(gòu)象。在此情況中，標(biāo)記物可以在肽為第一構(gòu)象(諸如無(wú)規(guī)卷曲/α-螺旋構(gòu)象)時(shí)發(fā)射第一信號(hào)(或無(wú)信號(hào))，而在肽為第二構(gòu)象(諸如片層構(gòu)象)時(shí)發(fā)射第二信號(hào)。如上文所討論的，互補(bǔ)原則適用于如下的肽探針，其在與靶蛋白結(jié)合后從較為有序的構(gòu)象改變成不太有序的構(gòu)象，其中第一信號(hào)與探針的第一、未結(jié)合的構(gòu)象(諸如片層構(gòu)象或較有組織的或較密的形式)有關(guān)，而在探針在與靶蛋白結(jié)合后經(jīng)歷構(gòu)象轉(zhuǎn)變(諸如主要為無(wú)規(guī)卷曲/α-螺旋構(gòu)象或不太有組織的或不太密的形式)時(shí)發(fā)射第二信號(hào)或無(wú)信號(hào)。 第一信號(hào)和第二信號(hào)可以強(qiáng)度、波長(zhǎng)等的一項(xiàng)或多項(xiàng)中不同。在信號(hào)包括發(fā)射光的實(shí)施方案中，第一信號(hào)和第二信號(hào)可以在激發(fā)波長(zhǎng)和/或發(fā)射波長(zhǎng)方面不同。例示性的標(biāo)記物包括熒光劑(例如熒光團(tuán)、熒光蛋白、熒光半導(dǎo)體納米晶體)、磷光劑、化學(xué)發(fā)光劑、顯色劑、猝滅劑、染料、放射性核素、金屬離子、金屬溶膠、配體(例如生物素、鏈霉親合素半抗原，等等)、酶(例如半乳糖苷酶、辣根過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酶，等等)、酶底物、酶輔因子(例如NADPH)、酶抑制劑、閃爍劑、抑制劑、磁性顆粒、寡核苷酸、和本領(lǐng)域中已知的其它模塊。在標(biāo)記物是熒光團(tuán)的情況中，可以使用熒光團(tuán)的一項(xiàng)或多項(xiàng)特征來(lái)評(píng)估經(jīng)標(biāo)記的探針的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。例如，熒光團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)可以隨經(jīng)標(biāo)記的探針的結(jié)構(gòu)狀態(tài)而不同。在一些實(shí)施方案中，熒光的發(fā)射波長(zhǎng)、強(qiáng)度、或偏振 (polarization)可以隨經(jīng)標(biāo)記的探針的結(jié)構(gòu)狀態(tài)而變化。如本文中所使用的，“熒光團(tuán)”指可以被光激發(fā)而發(fā)射熒光或磷光的化學(xué)基團(tuán)?！扳鐒敝改軌蜮鐏?lái)自熒光供體的熒光信號(hào)的試劑。第一熒光團(tuán)可以發(fā)射熒光信號(hào)，其激發(fā)第二熒光團(tuán)。第一熒光團(tuán)可以發(fā)射被第二熒光團(tuán)猝滅的信號(hào)。本文中所公開的探針可以經(jīng)歷熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。 熒光團(tuán)和猝滅劑可以包括下列試劑(或以下列商品名稱出售的熒光團(tuán)和猝滅劑)1，5IAEDANS ;1，8-ANS ；傘形酮(例如4-甲基傘形酮)；吖啶酯、5-羧基-2，7-二氯熒光素；5-羧基熒光素(5-FAM) ；5-羧基四甲基羅丹明(5-TAMRA) ；5_FAM(5_羧基熒光素)；5-HAT (羥色胺)；5_羥色胺(HAT) ；5-R0X(羧基_X_羅丹明)；5-TAMRA(5-羧基四甲基羅丹明)；6_羧基羅丹明6G ；6-CR 6G ；6-J0E ；7-氨基-4-甲基香豆素；7-氨基放線菌素D (7-AAD) ； 7-羥基-4-甲基香豆素；9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶；ABQ ； 酸性品紅；ACMA (9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶)；吖啶橙；吖啶紅；吖啶黃；錐蟲黃 (Acriflavin)；錐蟲黃福爾根SITSA ;Alexa Fluor 350 ；Alexa Fluor 430 ；Alexa Fluor 488 ；Alexa Fluor 532 ；Alexa Fluor 546 ；Alexa Fluor 568 ；Alexa Fluor 594 ； Alexa Fluor 633 ；Alexa Fluor 647 ；Alexa Fluor 660 ；Alexa Fluor 680 ；菌素絡(luò)合酮；茜素紅；別藻藍(lán)蛋白(APC) ； AMC; AMCA-S ;AMCA (氨基甲基香豆素)；AMCA-X ；氨基放線菌素D ；氨基香豆素；氨甲基香豆素(AMCA)；苯胺藍(lán)；蒽基硬脂酸酯；APC(別藻藍(lán)蛋白)；APC-Cy7 ；APTS ；Astrazon 亮紅 4G ；Astrazon 橙 R ；Astrazon 紅 6B ；Astrazon 黃 7GLL ；阿的平(Atabrine) ；ATTO-TAG CBQCA ；ATTO-TAG FQ ；金胺(Auramine)； Aurophosphine G ；Aurophosphine ；BAO 9 ( 二氨基苯基 P惡二唑)；硫酸小檗堿；β 內(nèi)酰胺酶；BFP藍(lán)移GFP (Υ66Η)；藍(lán)色熒光蛋白；BFP/GFP FRET ；Bimane ；雙苯甲酰胺 (Bisbenzamide)；雙苯甲酰胺(Hoechst) ；Blancophor FFG ；Blancophor SV ；BOBOtm-I ； Β0Β0 -3 ；Bodipy 492/515 ；Bodipy 493/503 ；Bodipy 500/510 ；Bodipy 505/515 ；Bodipy 530/550 ；Bodipy 542/563 ；Bodipy 558/568 ；Bodipy 564/570 ；Bodipy 576/589 ；Bodipy 581/591 ；Bodipy 630/650-Χ ；Bodipy 650/665-Χ ；Bodipy 665/676 ；Bodipy FL ；Bodipy FL ATP ；Bodipy Fl-神經(jīng)酰胺；Bodipy R6G SE ；Bodipy TMR ；Bodipy TMR-X 綴合物； Bodipy TMR-X, SE ；Bodipy TR ；Bodipy TR ATP ；Bodipy TR-X SE ；BO-PROtm-I ；B0-PR0 -3 ； 亮硫黃素(Sulphoflavin)FF ；鈣黃綠素；鈣黃綠素藍(lán)；鈣深紅(Calcium Crimson )；鈣綠；鈣橙；Calcof Iuor白；羧基-X-羅丹明(5-R0X)；級(jí)聯(lián)藍(lán)(Cascade Blue )；級(jí)聯(lián)黃；兒茶酚胺；CCF2 (GeneBlazer) ；CFDA ；CFP-青色熒光蛋白；CFP/YFP FRET ；葉綠素； 色霉素 A ;CL-NERF(比率染料，pH) ；CMFDA ；腔腸素(Coelenterazine) f ；腔腸素 fcp ；腔腸素h;腔腸素hep;腔腸素ip;腔腸素η;腔腸素O ；香豆素鬼筆毒環(huán)肽；C-藻藍(lán)蛋白 (phycocyanine) ；CPM 甲基香豆素；CTC ；CTC 甲月替；Cy2 ；Cy3. 18 ；Cy3. 5 ；Cy3 ；Cy5. 18 ； Cy5. 5 ；Cy5 ；Cy7 ；Cyan GFP ；環(huán) AMP 熒光傳感器(Fluorosensor) (FiCRhR) ；Dabcyl ；丹酰；丹酰胺；丹酰尸胺；丹酰氯；丹酰DHPE ；丹酰氟；DAPI ；Dapoxyl ；Dapoxyl 2 ；Dapoxyl 3 ；DCFDA ；DCFH( 二氯二氫熒光素二乙酸酯)；DDAO ；DHR( 二氫羅丹明 123) ；Di-4-ANEPPS ； Di-8-ANEPPS (非比率型)；DiAG-Di-16-ASP) ；二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH) ；DiD-親脂性示蹤劑；DiD(DiIC18(5)) ；DIDS ； 二氫羅丹明 123 (DHR) ；DiI (DiIC18 (3)) ； 二硝基酚；DiO(DiOC18(3)) ;DiR ;DiR(DiIC18(7)) ;DNP ；多巴胺；DsRed ;DTAF ;DY-630_NHS ； DY-635-NHS ；EBFP ；ECFP ；EGFP ；ELF 97 ；曙紅；藻紅；藻紅ITC ；溴化乙啶；乙啶同二聚體-I(EthD-I)；吖啶橙(Euchrysin) ；EukoLight ；氯化銪(III) ；EYFP ；快藍(lán)(Fast Blue)； FDA ；福爾根(堿性副品紅(Pararosaniline)) ；FITC ；Flazo 橙；Fluo-3 ；Fluo-4 ；熒光素(FITC)；熒光素二乙酸酯；熒光-祖母綠(Fluoro-Emerald)；熒光-金(Fluoro-Gold)(羥芪巴脒)；熒光-紅寶石(Fluor-Ruby) ；FluorX ；FM 1-43 ；FM 4-46 ；Fura 紅 ；Fura 紅 /Fluo-3 ；Fura-2 ；Fura-2/BCECF ；Genacryl 亮紅 B ；Genacryl 亮黃 IOGF ；Genacryl 粉紅 3G ；Genacryl 黃 5GF ；GeneBlazer (CCF2)；熒光蛋白(例如 GFP(S65T) ；GFP 紅移 (rsGFP) ；GFP 野生型、非 UV 激發(fā)(wtGFP) ；GFP 野生型、UV 激發(fā)(wtGFP)；和 GFPuv)；乙醛酸；粒狀藍(lán)；血卟啉；Hoechst 33258 ；Hoechst 33342 ；Hoechst 34580 ;HPTS ；羥基香豆素；羥芪巴脒(FluoroGold)；羥色胺Jndo-I ；吲哚二碳花青(Indodicarbocyanine) (DiD)；吲哚三碳花青(DiR)；內(nèi)白 antrawhite)Cf JC-I J0-J0-1 J0-PR0-1 ；Laurodan ； LDS 751 (DNA) ；LDS 751 (RNA) ；Leucophor PAF ；Leucophor SF ；Leucophor WS ；麗絲胺羅丹明；麗絲胺羅丹明B ；鈣黃綠素/乙啶同二聚體；L0L0-1 ；L0-PR0-1 ；螢光黃；魯米諾、Lyso Tracker 藍(lán)；Lyso Tracker 藍(lán)—白；Lyso Tracker M- ；Lyso Tracker 紅；Lyso Tracker ； LysoSensor 藍(lán)；LysoSensor 綠；LysoSensor 黃 / 藍(lán)；Mag 綠；蘇丹紅(根皮紅 B) ；Mag-Fura 紅；Mag-Fura-2 ；Mag-Fura-5 ；Mag-Indo-I ；鎂綠；鎂橙；孔雀石綠；Marina 藍(lán)；Maxilon 亮黃素 IOGFF ;MaxiIon 亮黃素 8GFF ；部花青(Merocyanin)；甲氧基香豆素；Mitotracker 綠 FM ；Mitotracker 澄；Mitotracker 紅；光神霉素(Mitramycin) ；Monobromobimane ； Monobromobimane (mBBr-GSH) ；Monochlorobimane ；MPS( ^ ^^ ^ -) -NBD ；
NBD 胺；尼羅紅；NED ；Nitrobenzoxadidole ；去甲腎上腺素；核快紅(Nuclear Fast Red)； 核黃(Nuclear Yellow) ；Nylosan 亮 Iavin E8G ;0regon 綠；Oregon 綠 488-X ;0regon 綠 ； Oregon 綠 488 ；Oregon 綠 500 ；Oregon 綠 514 ；和平藍(lán)(Pacific Blue)；堿性副品紅 (福爾根)；PBFI ；PE-Cy5 ；PE-Cy7 ；PerCP ；PerCP-Cy5. 5 ；PE-德克薩斯紅[紅 613]；根皮紅 B(蘇丹紅)；Phorwite AR ；Phorwite BKL ；Phorwite Rev ；Phorwite RPA;膦 3R;藻紅蛋白 B[PE]；藻紅蛋白 R[PE] ；PKH26(Sigma) ；PKH67 ；PMIA ；Pontochrome 藍(lán)黑；POPO-I ；P0P0-3 ； PO-PRO-I ;P0-PR0-3 ；報(bào)春花靈(Primuline)；普施安黃(Procion Yellow)；碘化丙啶 (Propidium Iodid,PI) ；PyMPO ；芘；派若寧(Pyronine)；派若寧B ;Pyrozal 亮黃素 7GF ;QSY 7 ；芥奎吖因(Quinacrine Mustard)；紅 613[ΡΕ-德克薩斯紅]；試鹵靈(Resorufin) ；RH 414 ；Rhod-2 ；羅丹明；羅丹明110 ；羅丹明123 ；羅丹明5GLD ；羅丹明6G ；羅丹明B ；羅丹明 B 200 ；羅丹明B Extra ；羅丹明BB ；羅丹明BG ；羅丹明綠；羅丹明Wiallicidine ；羅丹明鬼筆毒環(huán)肽；羅丹明紅；羅丹明WT;玫瑰紅；R-藻青蛋白(phycocyanine) ；R-藻紅蛋白(PE)； RsGFP ；S65A ；S65C ；S65L ；S65T ；藍(lán)寶石 GFP ；SBFI ；血清素；Sevron 亮紅 2B ；Sevron 亮紅 4G ；Sevron 亮紅 B ；Sevron 橙；Sevron 黃 L ；sgBFP ；sgBFP (super glow BFP) ；sgGFP ； sgGFP (super glow GFP) ；SITS ;SITS(報(bào)春花靈)；SITS(均二苯乙烯異硫代磺酸)；SNAFL 鈣黃綠素；SNAFL-I ；SNAFL-2 ；SNARF 鈣黃綠素；SNARFl ；鈉綠；譜淺綠(SpectrumAqua)； 譜綠(SpectrumGreen)；譜橙(SpectrumOrange)；譜紅(Spectrum Red) ；SPQ(6-甲氧基-N-(3-磺丙基)喹啉銨)；均二苯乙烯(Stilbene)；磺基羅丹明(Sulphorhodamine) B can C;磺基羅丹明 G Extra ；SYTO 11 ；SYTO 12 ；SYTO 13 ；SYTO 14 ；SYTO 15 ；SYTO 16; SYTO 17 ； SYTO 18 ； SYTO 20 ； SYTO 21 ；SYTO 22 ； SYTO 23 ； SYTO 24 ； SYTO 25 ； SYTO 40 ； SYTO 41 ； SYTO 42 ； SYTO 43 ； SYTO 44 ； SYTO 45 ； SYTO 59 ； SYTO 60 ； SYTO 61 ；SYTO 62 ； SYTO 63 ；SYTO 64 ； SYTO 80 ；SYTO 81 ； SYTO 82 ； SYTO 83 ； SYTO 84 ； SYTO 85 ； SYTOX 藍(lán)； SYTOX綠；SYTOX橙；ΤΕΤ ；四環(huán)素；四甲基羅丹明(TRITC)；德克薩斯紅 ；德克薩斯紅_Χ 綴合物；Thiadicarbocyanine (DiSO)；噻嗪紅R ；噻唑橙；硫黃素5 ；硫黃素S ；硫黃素TCN ；Thiolyte ；噻唑橙；Tinopol CBS(CalcofIuor 白)；TMR ；TO-PRO-1 ；T0-PR0-3 ；T0-PR0-5 ； TOTO-I ；T0T0-3 ；Tricolor (PE-Cy5) ；TRITC 四甲基羅丹明異硫氰酸酯；真藍(lán)(True Blue)； 真紅(TruRed) ；Ultralite ；熒光素鈉(Uranine)B ;Uvitex SFC;VIC ;wt GFP ；Wff 781 ； X-羅丹明；XRITC ；二甲苯橙；Y66F ；Y66H ；Y66W ；黃 GFP ；YFP ；Y0-PR0-1 ；Y0-PR0-3 ；Y0Y0-1 ； Y0Y0-3 ；及其鹽。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記物是芘模塊。如本文中所使用的，芘模塊包括芘，其包含四個(gè)融合的苯環(huán)或芘的衍生物。芘衍生物意為包含芘的四個(gè)融合的苯環(huán)的分子，其中將一個(gè)或多個(gè)芘碳原子取代或與別的模塊綴合。例示性的芘衍生物包括烷基化的芘，其中用線性或分枝的、取代的或未取代的烴基、烯基、炔基或?；鶊F(tuán)，諸如C1-C2tl、線性或分枝的、取代的或未取代的烴基、烯基、炔基或?；鶊F(tuán)(其中可以用例如包括O、N或S原子的模塊 (例如羰基、胺、硫氫基)或者用鹵素取代該基團(tuán))取代一個(gè)或多個(gè)芘碳原子。在一些實(shí)施方案中，芘衍生物包括一個(gè)或多個(gè)游離的羧基基團(tuán)和/或一個(gè)或多個(gè)游離的胺基，它們各自可以直接附著于芘碳原子或者附著于如上文所描述的線性或分枝的、取代的或未取代的烴基、烯基、炔基或?；鶊F(tuán)上的任何位置，諸如附著于與芘碳分開1或更多個(gè)，諸如1至 3、1至5、或更多個(gè)原子的碳原子。在一些實(shí)施方案中，用一個(gè)或多個(gè)乙酸模塊和/或一個(gè)或多個(gè)乙胺模塊取代芘。在一些實(shí)施方案中，用單個(gè)甲基、乙基、丙基或丁基基團(tuán)取代芘衍生物。在一些實(shí)施方案中，用短鏈脂肪酸，諸如芘丁酸酯取代芘。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將芘與清蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白或抗體的Fc片段綴合。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)由碳-碳連接、氨基基團(tuán)、肽鍵、醚、硫醚、二硫化物、或酯連接來(lái)將取代基附著于芘。在其它實(shí)施方案中，芘衍生物是PEG化的芘，即與聚乙二醇(PEG)綴合的芘。此類芘衍生物可以展現(xiàn)出更長(zhǎng)的體內(nèi)循環(huán)半衰期。在其它實(shí)施方案中，芘衍生物是與清蛋白綴合的芘。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記物包含作為融合蛋白的一部分摻入肽探針中的熒光蛋白。熒光蛋白可以包括綠色熒光蛋白(例如GFP、eGFP、AcGFP, TurboGFP, Emerald、Azami Green、和ZsGreen)、藍(lán)色熒光蛋白(例如EBFP、Sapphire、和T-Sapphire)、青色熒光蛋白(例如 ECFP、mCFP、Cerulean、CyPet, AmCyanl、和 Midoriishi Cyan)、黃色熒光蛋白 (例如 EYFP、Topaz、Venus、mCitrine、YPet, PhiYFP, ZsYellowl、和 mBanana)、和橙色及紅色焚光蛋白(例如 Kusabira 澄、mOrange、dTomato、dTomato—Tandem、DsRecU DsRed2、 DsRed-Express (Tl)、DsREd-單體、mTangerine、mStrawberry、AsRed2、mRFPl、JRecU mCherry、HcRedl、mRaspberry、HcRed-Tandem、mPlum 禾口 AQ143)。本領(lǐng)域中描述了其它熒光蛋白(Tsien，R. Y. ,Annual. Rev. Biochem. 67 :509-544(1998)；及 Lippincott-Schwartz 等， Science 300 :87-91(2003))。如上文所記錄的，探針可以包含在如下的融合蛋白中，所述融合蛋白還包括在探針的N端或C端處偶聯(lián)的熒光蛋白。可以經(jīng)由肽接頭來(lái)偶聯(lián)熒光蛋白，如本領(lǐng)域中所描述的(U. S. 6，448，087 ； Wurth 等，J. Mol. Biol. 319 :1279-1290(2002)；及 Kim 等，J.Biol. Chem. 280 =35059-35076 (2005)，通過(guò)提及而將其完整收入本文)。在一些實(shí)施方案中，合適的接頭可以長(zhǎng)約8-12個(gè)氨基酸。在別的實(shí)施方案中，接頭的大于約75 %的氨基酸殘基選自絲氨酸、甘氨酸、和丙氨酸殘基。在包含體內(nèi)檢測(cè)或成像的實(shí)施方案中，可以使用可用于體內(nèi)成像的標(biāo)記物。例如， 可以使用可用于磁共振成像的標(biāo)記物，諸如氟-18，也可以使用化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用放射性標(biāo)記物標(biāo)記探針。例如，標(biāo)記物可以提供具有足以被目前為此目的而采用的儀器檢測(cè)到的能量的正電子發(fā)射。此類實(shí)體的一個(gè)例子包含氧-15(即一種通過(guò)正電子發(fā)射來(lái)衰變的氧同位素)或其它放射性核素。另一個(gè)例子是碳-11?？梢詫?duì)患者施用經(jīng)此類標(biāo)記物標(biāo)記的探針，容許其定位于靶蛋白，并可以對(duì)患者成像(掃描)以檢測(cè)定位的探針，并且如此鑒定定位的靶蛋白的位置?？梢酝ㄟ^(guò)會(huì)容許定位于靶蛋白位置的任何合適的手段，諸如通過(guò)直接注射、鼻內(nèi)或口服來(lái)施用經(jīng)標(biāo)記的探針。在一些實(shí)施方案中，可以將經(jīng)放射性標(biāo)記的探針注射入患者中，并在外部監(jiān)測(cè)探針對(duì)蛋白質(zhì)靶物的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記物包含寡核苷酸。例如，肽探針可以與寡核苷酸標(biāo)簽偶聯(lián)，所述寡核苷酸標(biāo)簽可以通過(guò)本領(lǐng)域中的已知方法(例如擴(kuò)增測(cè)定法諸如PCR、TMA, b-DNA、NASBA,等等)來(lái)檢測(cè)。4.方法本文中所描述的肽探針與靶蛋白選擇性結(jié)合，而且在與靶蛋白結(jié)合后經(jīng)歷構(gòu)象轉(zhuǎn)變。例如，在一些實(shí)施方案中，本文中所描述的探針結(jié)合與靶蛋白有關(guān)的Αβ蛋白聚集體， 而且在此類結(jié)合后經(jīng)歷構(gòu)象轉(zhuǎn)變。如上文所記錄的，構(gòu)象轉(zhuǎn)變可以包含探針的N與C端間 (或者任何其它兩點(diǎn)間)的距離變化、緊密程度不同地折疊、采用較為有序或不太有序的構(gòu)象、從主要為一種二級(jí)結(jié)構(gòu)改變成主要為另一種二級(jí)結(jié)構(gòu)、或不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)量的任何變化。如上文所記錄的，“構(gòu)象轉(zhuǎn)變”包括可以通過(guò)間接的手段，諸如經(jīng)由下文所討論的標(biāo)記物信號(hào)傳導(dǎo)(即使構(gòu)象的更直接的測(cè)量，諸如CD未揭示構(gòu)象變化)來(lái)檢測(cè)的那些轉(zhuǎn)變。在一些實(shí)施方案中，探針經(jīng)歷與靶蛋白的構(gòu)象變化相似的構(gòu)象變化。例如，在一些實(shí)施方案中，探針能夠采用主要為無(wú)規(guī)卷曲/ α -螺旋構(gòu)象和主要為β -片層構(gòu)象兩者，并且在結(jié)合展現(xiàn)出主要為片層構(gòu)象的靶蛋白后采用主要為片層構(gòu)象。在一些實(shí)施方案中，探針以主要為α-螺旋/無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)象提供，并且在與主要為β-片層構(gòu)象的靶蛋白接觸、結(jié)合、聯(lián)合和/或相互作用后經(jīng)歷向主要為片層構(gòu)象的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。在其它實(shí)施方案中，探針通過(guò)變得更壓縮、更彌散、或者采用任何不同構(gòu)型來(lái)轉(zhuǎn)變構(gòu)象。在一些實(shí)施方案中，探針更緊密地采用Αβ蛋白聚集體的構(gòu)象。在其它實(shí)施方案中，探針能夠采用主要為無(wú)規(guī)卷曲/α-螺旋構(gòu)象和主要為片層構(gòu)象兩者，并且在結(jié)合展現(xiàn)出主要為片層構(gòu)象的靶蛋白后采用不太有序的或減少的片層構(gòu)象。在這些實(shí)施方案中，探針可以以主要為片層構(gòu)象提供，并且在與主要為片層構(gòu)象的靶蛋白接觸、結(jié)合、聯(lián)合和/或相互作用后經(jīng)歷向不太有序的或減少的β -片層構(gòu)象/增加的無(wú)規(guī)卷曲/ α -螺旋構(gòu)象的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。在一些實(shí)施方案中，肽探針優(yōu)先結(jié)合自我聚集的特定狀態(tài)，諸如單體、二聚體、可溶性寡聚物(例如4-12聚體)、不溶性聚集體和原纖維(例如100-1000聚體或更大)的靶蛋白。一般地，這記載于US 2008/0095706 (對(duì)應(yīng)于美國(guó)專利申請(qǐng)11/擬8，953)，通過(guò)提及而將其全部?jī)?nèi)容完整收入本文。這通過(guò)用肽22(SEQ ID NO 2)完成的工作來(lái)例示。圖12顯示了肽22(SEQ ID NO 2)對(duì)可溶性Αβ寡聚物的特異性。前兩幅小圖顯示了在將肽22與通過(guò)兩種不同方法制備的可溶性Αβ寡聚物一起溫育時(shí)的芘單體信號(hào)的劑量依賴性升高。接著的兩幅小圖顯示了在將肽22與Αβ 40單體和Αβ 42單體一起溫育時(shí)沒(méi)有熒光變化。接著的小圖顯示了在將肽22與Αβ 40纖維一起溫育時(shí)沒(méi)有熒光變化，而接著的小圖顯示了在將肽22與Αβ 42纖維一起溫育時(shí)單體熒光的某些劑量依賴性升高。最后兩幅小圖顯示了在將肽22與對(duì)照溶液(BSA或脫水酶)一起溫育時(shí)沒(méi)有熒光變化。如此，肽22優(yōu)先結(jié)合可溶性A β寡聚物形式的Αβ蛋白。已經(jīng)對(duì)肽38(SEQ ID NO 3)獲得了相似的數(shù)據(jù)，這顯示了它也優(yōu)先結(jié)合可溶性Aβ寡聚物形式的Αβ蛋白。因?yàn)檎J(rèn)為可溶性寡聚物是Αβ蛋白的活性病原性形式，所以檢測(cè)可溶性Αβ寡聚物的能力可以具有特別的臨床意義。此外，檢測(cè)可溶性Αβ寡聚物的能力可以在疾病進(jìn)展的過(guò)程期間比通過(guò)檢測(cè)Aβ原纖維所容許更早地容許檢測(cè)、診斷和治療。如此，依照一些實(shí)施方案，提供了一種用于在測(cè)試樣品中檢測(cè)靶蛋白的方法，其中靶蛋白展現(xiàn)出與淀粉樣蛋白生成性疾病有關(guān)的片層構(gòu)象，所述方法包括(i)使樣品與肽探針接觸以形成測(cè)試混合物；并(ii)檢測(cè)肽探針與存在的任何靶蛋白間的任何結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，在體外實(shí)現(xiàn)該方法。“測(cè)試樣品”指要測(cè)試的任何樣品，并且可以是來(lái)自人或動(dòng)物組織、血液、腦脊液、 尿液、糞便、毛發(fā)、唾液或患者的任何其它部分等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品可以來(lái)自可含有含感興趣的靶蛋白的生物學(xué)材料的任何來(lái)源，包括藥物產(chǎn)品、食物產(chǎn)品、衣服或其它動(dòng)物來(lái)源的材料或環(huán)境樣品。可以以與本方法相容的任何方式，例如均質(zhì)化、細(xì)胞破壞、稀釋、澄清等來(lái)制備測(cè)試樣品以在本方法中使用。應(yīng)當(dāng)注意不使測(cè)試樣品中的蛋白質(zhì)變性，從而靶蛋白保留其初始的構(gòu)象。任選地，可以使用常規(guī)的技術(shù)諸如超聲處理來(lái)分拆測(cè)試樣品， 之后添加肽探針。在涉及體內(nèi)檢測(cè)的實(shí)施方案中，測(cè)試樣品是活的受試者。對(duì)于體外使用，探針可以在溶液，諸如具有約4和約10之間，諸如約5和約8之間的PH，具有約0. 01和約0. 5之間的離子強(qiáng)度(在通常用氯化鹽，諸如氯化鈉或氯化鉀制備時(shí))的水溶液中提供。溶液還可以以約30%至約100% (按體積計(jì))之間，諸如約45%至約60%之間的量包含水可混合的有機(jī)材料(例如三氟乙醇、六氟-2-丙醛(HFIP)或乙腈 (ACN))?？梢杂煤线m的緩沖系統(tǒng)諸如乙酸鹽/乙酸、Tris、或磷酸鹽來(lái)制備溶劑。對(duì)于體內(nèi)使用，探針可以在任何生理學(xué)可接受溶液中提供。例如，可以將探針以三氟乙酸鹽制備，并在有機(jī)溶劑，諸如100% HFIP或50% ACN中重懸。在其它實(shí)施方案中，所述方法在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)，并且包括對(duì)受試者施用肽探針，并例如掃描受試者以檢測(cè)定位于β-片層構(gòu)象靶蛋白位置的經(jīng)標(biāo)記的肽探針。在例如US 2008/0095706中提供了關(guān)于體內(nèi)方法的更多詳情，通過(guò)提及而其內(nèi)容完整收入本文。在此類體內(nèi)實(shí)施方案中，可以諸如通過(guò)局部注射來(lái)對(duì)患者施用經(jīng)標(biāo)記的肽探針，容許其定位于患者內(nèi)存在的靶蛋白或高階靶蛋白結(jié)構(gòu)的任何位置，然后可以對(duì)患者掃描以檢測(cè)位于靶蛋白或高階靶蛋白結(jié)構(gòu)的位置處的經(jīng)標(biāo)記的探針的位置。還涵蓋其它施用路徑，包括鼻內(nèi)和口服。如上文所討論的，可以用適合于體內(nèi)成像的任何標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記探針?；颊呖梢赃M(jìn)行全身掃描以鑒定靶蛋白的任何位置?；蛘?，可以掃描患者的特定區(qū)域以確定靶蛋白是否位于該特定區(qū)域中。感興趣的特定區(qū)域可以包括血管組織、淋巴組織或腦(包括海馬或額葉)、 或其它器官諸如心臟、腎、肝或肺。例示性的合適的掃描或成像技術(shù)包括正電子發(fā)射斷層攝影(PET)、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)(SPECT)、磁共振成像(MRI)、放射照相術(shù)、斷層攝影術(shù)、熒光術(shù)、核醫(yī)學(xué)、光學(xué)成像、腦照相術(shù)和超聲波掃描術(shù)。在一些實(shí)施方案中，諸如為了檢測(cè)不溶性靶蛋白(諸如Αβ原纖維)，肽探針與靶蛋白間的結(jié)合導(dǎo)致不溶性復(fù)合物的形成?？梢允褂贸Ｒ?guī)的技術(shù)來(lái)檢測(cè)不溶性復(fù)合物，諸如通過(guò)使用常規(guī)的技術(shù)諸如使不溶性復(fù)合物沉淀的離心和/或過(guò)濾自反應(yīng)混合物分離不溶性復(fù)合物來(lái)進(jìn)行。然后，可以通過(guò)檢測(cè)技術(shù)來(lái)進(jìn)一步表征不溶性復(fù)合物，例如不溶性復(fù)合物中存在的任何肽探針。此類檢測(cè)技術(shù)可以包括例如檢測(cè)肽探針的標(biāo)記物，或者通過(guò)使用諸如SDS-PAGE(其基于分子量來(lái)分離蛋白質(zhì))等技術(shù)或本領(lǐng)域中已知的其它常規(guī)的技術(shù)來(lái)表征不溶性復(fù)合物的其它技術(shù)。不溶性復(fù)合物中的肽探針上的可檢測(cè)標(biāo)記物的檢測(cè)與肽探針-靶蛋白復(fù)合物的存在關(guān)聯(lián)，其繼而與測(cè)試樣品中的靶蛋白關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，諸如為了檢測(cè)可溶性靶蛋白聚集體(諸如可溶性Αβ寡聚物)，肽探針與靶蛋白間的結(jié)合導(dǎo)致可溶性復(fù)合物的形成?？梢酝ㄟ^(guò)數(shù)種不同方法來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)包括可溶性復(fù)合物的復(fù)合物。例如，可以分開復(fù)合物與反應(yīng)混合物的其它組分，諸如未結(jié)合的肽探針和/或未結(jié)合的靶蛋白，然后可以通過(guò)檢測(cè)復(fù)合物中存在的肽探針上的可檢測(cè)標(biāo)記物來(lái)檢測(cè)復(fù)合物。可以使用本領(lǐng)域中已知的任何方法來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。在一些實(shí)施方案中，使用大小排阻層析(SEC)來(lái)分離肽探針-靶蛋白復(fù)合物。SEC 使用捕捉介質(zhì)(又稱作固定相)中的孔或開口來(lái)保留較小的分子，使得較小的分子較慢地遷移通過(guò)捕捉介質(zhì)，而較大的分子較快地通過(guò)。這些孔或開口具有限定的大小，并且可以選擇為區(qū)分肽探針-靶蛋白復(fù)合物與未結(jié)合的肽探針和/或未結(jié)合的靶蛋白。依照這些方法， 肽探針-靶蛋白復(fù)合物會(huì)在未結(jié)合的肽探針前洗脫。較早級(jí)分中的肽探針上的可檢測(cè)標(biāo)記物的檢測(cè)與肽探針-靶蛋白復(fù)合物的存在關(guān)聯(lián)，其繼而與測(cè)試樣品中的靶蛋白關(guān)聯(lián)。備選的實(shí)施方案使用親和層析來(lái)保留捕捉介質(zhì)上的肽探針-靶蛋白復(fù)合物。此方法利用捕捉介質(zhì)，諸如固相，其包含結(jié)合肽探針-靶蛋白復(fù)合物的親和分子。親和分子可以選擇為特異性結(jié)合靶蛋白、肽探針、復(fù)合物、或與肽探針-靶蛋白復(fù)合物的任何組分綴合的標(biāo)記物。在一些實(shí)施方案中，親和分子特異性結(jié)合靶蛋白或與靶蛋白綴合的標(biāo)記物，使得靶蛋白保留于捕捉介質(zhì)上。一旦洗掉未結(jié)合的組分(包括任何未結(jié)合的肽探針)，通常便可以使用洗脫緩沖液來(lái)洗脫結(jié)合的材料，并可以分析洗脫劑。洗脫劑中的肽探針上的可檢測(cè)標(biāo)記物的檢測(cè)與洗脫劑中的肽探針-靶蛋白復(fù)合物的存在關(guān)聯(lián)，其繼而與測(cè)試樣品中的靶蛋白關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，將靶蛋白與捕捉介質(zhì)的親和分子結(jié)合的模塊綴合。例如，若親和分子包含親合素或鏈霉親合素，則可以將靶蛋白與生物素綴合。在其它實(shí)施方案中，將肽探針與被親和分子特異性結(jié)合的模塊，諸如生物素綴合。 此類肽探針特別適合于在ELISA和免疫沉淀測(cè)定法中使用。例如，可以與經(jīng)生物素標(biāo)記的肽探針一起使用經(jīng)親合素包被的板。清洗以除去非特異性結(jié)合的探針后，添加要測(cè)定靶蛋白的樣品。清洗以除去非特異性結(jié)合的物質(zhì)后，添加特異性結(jié)合靶蛋白的抗體(諸如小鼠抗Αβ抗體，諸如識(shí)別Aβ抗體，而非肽探針的抗體6Ε10)。清洗以除去非特異性結(jié)合的抗體后，添加經(jīng)標(biāo)記的抗體(諸如標(biāo)記有辣根過(guò)氧化物酶的小鼠抗IgG抗體)。在此類測(cè)定法中，抗體標(biāo)記物的檢測(cè)與樣品中的靶蛋白的存在關(guān)聯(lián)。下文表1 中的肽探針 AD310(SEQ ID NO :38)、AD313 (SEQ ID NO :39)、AD314 (SEQ ID NO 40)、AD317(SEQ ID NO :41)、禾口 AD321 (SEQ ID NO :42)例示了此類肽探針的具體實(shí)施方案，及生物素化的備選位點(diǎn)的例子。雖然這些肽探針之每種包含SEQ ID N0:2(肽22)， 但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以如上文一般描述及如由這些肽探針明確例示的那樣將本文中所描述的任何肽探針生物素化。例如，可以經(jīng)由螺旋接頭(諸如EAAAK ;SEQ ID NO 56)在C端實(shí)現(xiàn)生物素化，如以AD310 (SEQ ID NO :38)例示的。一般地，螺旋接頭包括形成 α螺旋的殘基，諸如丙氨酸殘基?；蛘?，可以經(jīng)由賴氨酸殘基(包括內(nèi)部或末端賴氨酸殘基)上的側(cè)鏈來(lái)實(shí)現(xiàn)生物素化，如以AD313 (SEQ ID NO 39)例示的。或者，可以經(jīng)由柔性接頭(諸如GSSGSSK (SEQ ID NO :57))在C端實(shí)現(xiàn)生物素化，如以AD314 (SEQ ID NO :40)例示的。一般地，柔性接頭包括一個(gè)或多個(gè)甘氨酸和/或絲氨酸殘基，或可以自由旋轉(zhuǎn)約其Φ和 Ψ角的其它殘基?；蛘?，可以經(jīng)由凝血酶位點(diǎn)接頭(諸如包含LVPRGS(SEQ ID NO 58)的接頭，諸如GLVPRGSGK(SEQ ID NO :59))在C端實(shí)現(xiàn)生物素化，如以AD317 (SEQ ID NO :41)例示的?；蛘?，可以經(jīng)由扭結(jié)接頭(諸如PSGSH((SEQ ID NO 60))在C端實(shí)現(xiàn)生物素化，如以 AD321(SEQ ID NO 42)例示的。一般地，扭結(jié)接頭包含一個(gè)或多個(gè)脯氨酸殘基，或具有嚴(yán)格保護(hù)生物素模塊遠(yuǎn)離肽探針的蛋白質(zhì)結(jié)合基序的固定的φ和Ψ角的其它殘基。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)檢測(cè)由肽探針產(chǎn)生的信號(hào)，諸如在肽探針展現(xiàn)出β-片層構(gòu)象或與其靶蛋白結(jié)合狀態(tài)有關(guān)的其它構(gòu)象時(shí)產(chǎn)生的信號(hào)來(lái)檢測(cè)肽探針與靶蛋白間的結(jié)合。可以在從反應(yīng)混合物分離(諸如上文所描述)或不分離(諸如在體內(nèi)實(shí)施方案中) 肽探針-靶蛋白復(fù)合物的情況中在體外或在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)這些實(shí)施方案。在這些實(shí)施方案中， 可以用形成受激子的標(biāo)記物，諸如芘，或用FRET標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記肽探針。憑借任一類標(biāo)記物， 在肽探針采用片層構(gòu)象或與其靶蛋白結(jié)合狀態(tài)有關(guān)的其它構(gòu)象時(shí)產(chǎn)生信號(hào)，諸如可以在與展現(xiàn)出β -片層構(gòu)象的靶蛋白接觸、相互作用或結(jié)合后發(fā)生。受激子指不必是共價(jià)的且在已經(jīng)被光子激發(fā)的分子實(shí)體與相同的未激發(fā)分子實(shí)體間形成的加合物。加合物在自然界中是短暫的，并且在其通過(guò)發(fā)射光子而發(fā)熒光前一直存在。受激子表示兩個(gè)熒光團(tuán)的相互作用，其在用特定波長(zhǎng)的光激發(fā)后發(fā)射不同波長(zhǎng)的光， 該光與由單獨(dú)起作用的任一種熒光團(tuán)發(fā)射的光在量級(jí)上也不同。有可能通過(guò)產(chǎn)生比通常的發(fā)射譜的波長(zhǎng)長(zhǎng)的波長(zhǎng)的新熒光帶來(lái)識(shí)別受激子(或受激子的形成)。因?yàn)榧ぐl(fā)譜與單體的激發(fā)譜相同，所以可以區(qū)分受激子與熒光共振能量轉(zhuǎn)移。受激子的形成取決于熒光團(tuán)的幾何排列，而且很大程度上受其間距離的影響。在一個(gè)實(shí)施方案中，芘模塊存在于肽探針的每個(gè)末端處或附近，并且熒光團(tuán)間的受激子形成可忽略，只要總體肽構(gòu)象是α-螺旋或無(wú)規(guī)卷曲，但是在肽藥劑經(jīng)歷結(jié)構(gòu)變化 (諸如構(gòu)象變化成片層構(gòu)象)，從而使芘模塊彼此接近時(shí)形成受激子。存在于肽上的其它位置處的芘模塊在此背景中也可以是有用的，只要受激子形成是構(gòu)象依賴性的。此外，受激子形成的量級(jí)與存在的蛋白質(zhì)分析物的量成正比。如此，本發(fā)明的方法通過(guò)檢測(cè)受激子形成而容許靶蛋白或結(jié)構(gòu)的檢測(cè)和體內(nèi)成像。在肽探針在與靶蛋白聯(lián)合或結(jié)合后從較為有序的構(gòu)象變化成不太有序的構(gòu)象的實(shí)施方案中，在芘模塊存在于肽探針的每個(gè)末端處或附近時(shí)，受激子信號(hào)可以是與肽的未結(jié)合狀態(tài)有關(guān)的信號(hào)，并且芘單體熒光會(huì)較低。在此類肽與片層構(gòu)象的靶蛋白接觸時(shí)， 它們經(jīng)歷降低芘標(biāo)記物的物理接近的構(gòu)象變化，導(dǎo)致芘受激子信號(hào)降低和芘單體信號(hào)升高。存在于肽上的其它位置處的芘模塊在此背景中也可以是有用的，只要受激子/單體信號(hào)傳導(dǎo)取決于隨肽探針是為聯(lián)合(例如結(jié)合)還是為未結(jié)合(例如沒(méi)有結(jié)合靶蛋白)狀態(tài)而變化的構(gòu)象。此外，在這些實(shí)施方案中，芘單體信號(hào)的升高或芘受激子信號(hào)的降低與存在的靶蛋白的量成正比。如此，這些實(shí)施方案同樣通過(guò)監(jiān)測(cè)受激子和單體信號(hào)傳導(dǎo)而容許靶蛋白或結(jié)構(gòu)的檢測(cè)和體內(nèi)成像。這在圖11中顯示，其使用肽22進(jìn)行(在下文更為詳細(xì)地描述的)。具體地，圖11顯示了在沒(méi)有(左側(cè))和存在(右側(cè))可溶性Αβ寡聚物的情況中在每個(gè)末端經(jīng)芘標(biāo)記的肽22 (SEQ ID NO 2)的原始熒光譜。肽22的熒光在沒(méi)有寡聚物的情況中隨時(shí)間是穩(wěn)定的(沒(méi)有單體或受激子熒光的升高)，但是在與可溶性Αβ寡聚物一起溫育時(shí)展現(xiàn)出芘單體信號(hào)的升高?？梢酝ㄟ^(guò)光學(xué)特性的變化來(lái)檢測(cè)受激子的形成。根據(jù)附著于探針的熒光團(tuán)，可以通過(guò)已知的熒光測(cè)量技術(shù)，包括UV、IR、⑶、NMR、或熒光等來(lái)測(cè)量此類變化。光學(xué)特性的這些變化的量級(jí)與已經(jīng)采用與該變化有關(guān)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)的綴合物的量成正比，而且與存在的靶蛋白或結(jié)構(gòu)的量成正比。相似的考慮因素適用于FRET。例如，可以在每個(gè)末端處或附近用選自下列FRET標(biāo)記物對(duì)的標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記肽探針DACIA-I/NBD、Marina藍(lán)/NBD和EDANS/Fam(熒光)。對(duì)于在與靶蛋白聯(lián)合或結(jié)合后從不太有序的構(gòu)象變化成較為有序的構(gòu)象的肽探針，F(xiàn)RET信號(hào)的檢測(cè)與肽探針的片層構(gòu)象有關(guān)，而且與靶蛋白的存在關(guān)聯(lián)。對(duì)于在與靶蛋白聯(lián)合或結(jié)合后從較為有序的構(gòu)象變化成不太有序的構(gòu)象的肽探針，F(xiàn)RET信號(hào)的檢測(cè)與肽探針的未結(jié)合狀態(tài)有關(guān)，而不同(單體)信號(hào)或無(wú)信號(hào)的檢測(cè)與靶蛋白的存在關(guān)聯(lián)。相似的考慮因素也適用于熒光團(tuán)/猝滅劑標(biāo)記物，如上文所討論的。如上文所討論的，本文中所描述的肽探針設(shè)計(jì)為諸如通過(guò)展現(xiàn)出降低的背景信號(hào)來(lái)在檢測(cè)測(cè)定法中實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)的性能。如此，肽探針可以比檢測(cè)展現(xiàn)出片層構(gòu)象的靶蛋白中的參照肽更靈敏且更可靠。如上文所記錄的，靶蛋白可以與疾病或狀況有關(guān)。如此，靶蛋白的檢測(cè)可以與疾病或狀況的診斷或風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，由本文中所描述的肽探針檢測(cè)的展現(xiàn)出
片層構(gòu)象的靶蛋白的量可以與臨床相關(guān)疾病特征，諸如疾病進(jìn)展或狀態(tài)，或疾病的素因關(guān)聯(lián)。在其它實(shí)施方案中，可以使用本文中所描述的方法來(lái)測(cè)定患者中存在的錯(cuò)折疊淀粉樣蛋白的量，和/或A β 40與A β 42蛋白的比率，已知所述特征對(duì)應(yīng)于淀粉樣蛋白生成性疾病，諸如AD的疾病進(jìn)展。本文中所描述的肽探針也可用于鑒定抑制靶蛋白展現(xiàn)出片層構(gòu)象的能力的藥劑，諸如可以用于治療背景。在此類方法中，將藥劑與靶蛋白一起溫育，并檢測(cè)肽探針與展現(xiàn)出片層構(gòu)象的靶蛋白的結(jié)合。通過(guò)比較在與和不與藥劑一起溫育的情況中結(jié)合靶蛋白的肽探針的量，可以測(cè)定藥劑的抑制能力。例示性的方法記載于US 2008/0095706(對(duì)應(yīng)于美國(guó)專利申請(qǐng)11/8 ，953)，通過(guò)提及而將其全部?jī)?nèi)容完整收入本文。5.體內(nèi)治療方法在其它實(shí)施方案中，提供了用于阻止靶蛋白的蛋白質(zhì)聚集體形成的體內(nèi)方法，包括使體內(nèi)的靶蛋白與針對(duì)靶蛋白的肽探針接觸，其中肽探針優(yōu)先結(jié)合靶蛋白，由此阻止靶蛋白的高階蛋白質(zhì)聚集體的形成。在一些實(shí)施方案中，肽探針優(yōu)先結(jié)合選自下組的自我聚集的特定狀態(tài)的靶蛋白單體、可溶性寡聚物、和不溶性自我聚集體。依照其它實(shí)施方案，提供了用于投遞針對(duì)靶蛋白的治療劑的方法，包括組合治療劑與針對(duì)靶蛋白的肽探針，并對(duì)有此需要的患者施用肽探針-治療劑組合。例如，可以將肽探針與治療劑綴合(直接或經(jīng)由接頭)以對(duì)靶蛋白的位置靶向投遞治療劑。在此類體內(nèi)實(shí)施方案(其在上文所提及的US 2008/0095706中披露)中，可以諸如通過(guò)局部注射來(lái)對(duì)患者施用肽探針(單獨(dú)的或作為包含另一種治療劑的組合)，并容許其定位于患者內(nèi)存在的靶蛋白或高階靶蛋白結(jié)構(gòu)的任何位置，以實(shí)現(xiàn)療法。還涵蓋其它施用路徑，包括鼻內(nèi)和口服。感興趣的特定區(qū)域可以包括血管組織、淋巴組織或腦(包括海馬或額葉)、或其它器官諸如心臟、腎、肝或肺。6.試劑盒還提供了包含本文中所描述的肽的試劑盒。試劑盒可以準(zhǔn)備好用于實(shí)施本文中所描述的方法。通常，試劑盒包括可用于實(shí)施方法的至少一種組分或組分的包裝組合?！鞍b組合”意為試劑盒提供含有一種或多種組分，諸如肽探針、緩沖劑、使用指令等的組合的單一包裝。包含單一容器的試劑盒包括在“包裝組合”的定義內(nèi)。試劑盒可以包括實(shí)施本文中所公開的方法必需的一些或所有組分。通常，試劑盒在至少一個(gè)容器中包括至少一種肽探針。試劑盒可以在一個(gè)或多個(gè)容器中包括多種肽探針，其可以是相同或不同的，諸如包含不同序列和/或不同標(biāo)記物的探針。多種探針可以存在于單一容器中或者在各含有單一探針的不同容器中。
實(shí)施例實(shí)施例1熒光報(bào)告模塊與肽的綴合可以提供監(jiān)測(cè)肽在不同溶劑條件下，或者在存在相互作用配偶體(諸如靶蛋白)和輔因子(諸如抗淀粉樣蛋白劑)的情況中的構(gòu)象動(dòng)力學(xué)的簡(jiǎn)單機(jī)制。如上文所討論的，根據(jù)芘是否為單體狀態(tài)或者它是否與其它芘分子極其物理接近或配對(duì)(受激子狀態(tài))，芘發(fā)射兩種獨(dú)特的熒光譜。在芘在本文中所描述的肽的N和C端處或附近綴合時(shí)，芘模塊可以隨肽的構(gòu)象而以不同距離分開，其中芘為片層構(gòu)象時(shí)極其物理接近(圖1Β)，而為無(wú)規(guī)卷曲/ α -螺旋構(gòu)象時(shí)相隔較遠(yuǎn)(圖1C)。如此，在將芘在本文中所描述的肽的N和C端處或附近綴合時(shí)，它可以而肽的構(gòu)象而提供具有兩種獨(dú)特的熒光譜的熒光信號(hào)，其中單體信號(hào)與肽的無(wú)規(guī)卷曲/α-螺旋構(gòu)象有關(guān)，而受激子信號(hào)與肽的 β-片層構(gòu)象有關(guān)。結(jié)果可以以片層構(gòu)象(受激子)的信號(hào)或者以來(lái)自片層構(gòu)象 (受激子)的信號(hào)與來(lái)自α-螺旋構(gòu)象(單體)的信號(hào)的熒光比率報(bào)告。在將超過(guò)一個(gè)芘模塊與感興趣的肽綴合時(shí)，可以使用計(jì)算機(jī)建模來(lái)預(yù)測(cè)芘間距離，以選擇會(huì)隨肽的構(gòu)象而產(chǎn)生不同信號(hào)的肽。圖IA顯示了芘的芘間距離于室溫隨肽的溶劑環(huán)境的分布的計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)，所述芘與對(duì)應(yīng)于A β肽(SEQ ID NO 1)區(qū)的肽的每個(gè)末端綴合。如此圖中所顯示的，肽在水中采用片層構(gòu)象，其中芘模塊相對(duì)極其接近(N和C端芘環(huán)的中心間為約10Α)。比較而言，肽在40%三氟乙醇(TFE)中采用α-螺旋構(gòu)象，其中芘模塊相隔更遠(yuǎn)(N和C端芘環(huán)的中心間為約20Α )。實(shí)施例2依照本文中所描述的原則來(lái)設(shè)計(jì)新的肽探針。如圖2中所顯示的，肽序列基于Αβ 肽的氨基酸17-35，其是Aβ肽的β-片層形成區(qū)。參照序列(WT;SEQ ID NO 1)對(duì)應(yīng)于野生型序列，其具有添加的末端賴氨酸殘基以便于芘標(biāo)記。肽22 (SEQ ID NO 2)包括用組氨酸殘基的替代、用谷氨酸殘基的替代、和添加的C
端賴氨酸殘基。肽38(SEQ ID NO 3)包括用四個(gè)連續(xù)的丙氨酸殘基的替代、用組氨酸殘基的替代、 用谷氨酸殘基的替代、和添加的C端賴氨酸殘基。肽45 (SEQ ID NO 4)包括添加的三個(gè)連續(xù)的N端丙氨酸殘基、用組氨酸殘基的替代、用谷氨酸殘基的替代、和添加的C端賴氨酸殘基。
肽I32S(SEQ ID NO 5)包括用亮氨酸殘基替換異亮氨酸殘基和添加的C端賴氨酸殘基。肽M35A(SEQ ID NO 6)包括用丙氨酸殘基替換C端殘基、和添加賴氨酸殘基作為肽的C端殘基。肽E22P(SEQ ID NO 7)包括用脯氨酸殘基替換谷氨酸殘基。肽GM6(SEQ ID NO 8)包括用絲氨酸殘基替換苯丙氨酸殘基及用脯氨酸殘基替換亮氨酸殘基。如上文所討論的，肽22、38和45 (SEQ ID NO. 2-4)中的組氨酸和谷氨酸殘基替代容許那些殘基間的鹽橋的形成，這可以使α-螺旋構(gòu)象穩(wěn)定化和/或提供一種用于控制通過(guò)控制測(cè)定條件產(chǎn)生的信號(hào)的手段。如上文所討論的，這些肽展現(xiàn)出降低的背景信號(hào)，這是由于肽在沒(méi)有片層構(gòu)象的靶蛋白的情況中不太可能采用片層構(gòu)象。如上文所討論的，肽38 (SEQ ID NO 3)和肽45 (SEQ ID NO 4)中的連續(xù)的丙氨酸替代(丙氨酸重復(fù))具有高的α-螺旋傾向，并且如此使肽的α-螺旋構(gòu)象穩(wěn)定化。再次， 這些肽展現(xiàn)出降低的背景信號(hào)，這是由于肽在沒(méi)有片層構(gòu)象的靶蛋白的情況中不太可能采用片層構(gòu)象。如上文所討論的，一些替代便于在與靶蛋白接觸、結(jié)合或相互作用后采用β-片層構(gòu)象，或其它構(gòu)象變化，使得肽采用β -片層構(gòu)象，或者在與靶蛋白接觸、結(jié)合或相互作用后比參照序列更有效地經(jīng)歷構(gòu)象變化。在SEQ ID Ν0:7、9、13和19-21中將丙氨酸替換成甘氨酸、谷氨酸替換成脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、或賴氨酸，和天冬氨酸替換成天冬酰胺導(dǎo)致具有增強(qiáng)的片層形成和聚集特性的肽探針。肽M35A(SEQ ID NO 6)中的C端甲硫氨酸殘基替代使肽比參照(野生型)序列在
氧化環(huán)境中更穩(wěn)定。其它工作已經(jīng)顯示了，肽I32S(SEQ ID NO : 中異亮氨酸成絲氨酸的替代、肽 AD323、AD325、AD330、AD329、AD328、和 AD327(SEQ ID NO :28-33)中的絲氨酸、組氨酸、異亮氨酸、和/或亮氨酸成天冬氨酸的替代、和肽GM6和GM6變異1(SEQ ID NO :34-35)中的苯丙氨酸成絲氨酸及亮氨酸成苯丙氨酸的替代使所得的探針的β-片層構(gòu)象脫穩(wěn)定化，盡管這些探針在與靶蛋白，諸如A β寡聚物接觸、結(jié)合或相互作用后比參照(野生型)序列更有效地經(jīng)歷構(gòu)象變化。實(shí)施例3可以在數(shù)種不同測(cè)定法中針對(duì)已知的靶蛋白使用肽探針來(lái)評(píng)估它們?cè)诮o定的測(cè)定法中使用和/或在給定的測(cè)定條件下使用的適合性。例如，一種肽在一個(gè)特定的測(cè)定法中可以是更有效的，而不同肽在不同測(cè)定法中可以是更有效的。在數(shù)種不同測(cè)定法中使用 SEQ ID NO :1的肽，如下文所討論的?？梢允褂孟嗨频臏y(cè)定法來(lái)檢測(cè)測(cè)試樣品中的靶蛋白。(i)不溶性復(fù)合物在此測(cè)定法中，在基于離心的體外相互作用測(cè)定法中組合可溶性肽探針與不溶性靶蛋白纖維。會(huì)在不溶性沉淀物中檢測(cè)出結(jié)合靶蛋白的肽探針，所述不溶性沉淀物可以使用離心來(lái)分離。未結(jié)合不溶性靶蛋白纖維的肽探針保留在上清液中，并且在沉淀物中檢測(cè)不到。在存在增加量的三氟乙醇(TFE)的情況中將A β 42纖維(靶蛋白)和肽探針(SEQID NO 1) 一起溫育3小時(shí)。以17，OOOx g將樣品離心30分鐘，并將沉淀物在樣品緩沖液中變性，并通過(guò)SDS-PAGE來(lái)分析。結(jié)果在圖3中顯示。為了比較而顯示參照樣品(輸入)。 在此實(shí)施例中，在40% TFE條件時(shí)清楚地觀察到靶蛋白與肽探針的結(jié)合(在40% TFE時(shí)比較左側(cè)和右側(cè)小圖，其中“肽”帶在左側(cè)小圖，而不是右側(cè)小圖中出現(xiàn))。這指示肽降落到具有原纖維形式的靶蛋白的旋轉(zhuǎn)沉淀物中，所述原纖維形式的靶蛋白在SDA-PAGE上以單體 A β 42顯示，這是因?yàn)樵w維在SDS-PGE條件下溶解成單體。若用可檢測(cè)的標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記肽，則沉淀的不溶性復(fù)合物中的信號(hào)會(huì)與靶物-肽結(jié)合關(guān)聯(lián)(未顯示)。(ii)大小排阻層析在此測(cè)定法中，在基于大小排阻層析的體外相互作用測(cè)定法中組合可溶性肽探針與例如可溶性靶蛋白寡聚物。將經(jīng)標(biāo)記的肽探針(SEQ ID NO 1，2 μ M)和靶蛋白(Α β寡聚物，2 μ Μ)在Hepes緩沖液(10mM，pH 7. 0)中一起溫育90分鐘，然后加載至G25大小排阻柱(其具有5000Da分子量截留)上。將該柱以73 g進(jìn)行離心達(dá)2分鐘。通過(guò)TECAN熒光計(jì)來(lái)分析洗脫劑和柱材料。此方法在圖14A中顯示。也可以通過(guò)SDS-PAGE來(lái)分析洗脫劑(未顯示)。在此測(cè)定法中，未結(jié)合的肽探針會(huì)由于其較小的大小而保留于柱上。如此，洗脫劑中的經(jīng)標(biāo)記的肽探針的檢測(cè)指示洗脫劑中的靶蛋白-肽復(fù)合物的存在。這通過(guò)圖14B中所顯示的結(jié)果來(lái)確認(rèn)，該圖顯示了在存在寡聚物的情況中回收經(jīng)熒光標(biāo)記的肽。在用肽45進(jìn)行的相似的測(cè)定法中，將經(jīng)標(biāo)記的肽探針(SEQ ID NO :4，2μΜ)和靶蛋白(Αβ寡聚物，2 μ Μ)在H印es緩沖液(10mM，pH 7.0)中一起溫育90分鐘，然后加載至 G25大小排阻柱(其具有5000Da分子量截留)上。將該柱以73 g進(jìn)行離心達(dá)2分鐘。 通過(guò)TECAN熒光計(jì)來(lái)分析洗脫劑和柱材料。此方法在圖4A中顯示。在此測(cè)定法中，未結(jié)合的肽探針會(huì)由于其較小的大小而保留于柱上。如此，洗脫劑中的經(jīng)標(biāo)記的肽探針的檢測(cè)指示洗脫劑中的靶蛋白-肽復(fù)合物的存在。這通過(guò)圖4B中所顯示的結(jié)果來(lái)確認(rèn)，該圖顯示了在存在寡聚物的情況中回收經(jīng)熒光標(biāo)記的肽。(iii)親和層析在此測(cè)定法中，在基于親和層析的體外相互作用測(cè)定法中組合可溶性肽探針與例如可溶性靶蛋白寡聚物。對(duì)于此實(shí)施例，用親和分子諸如生物素來(lái)標(biāo)記靶蛋白，并將其與經(jīng)標(biāo)記的肽探針一起溫育。溫育后，將混合物與支持物(例如柱或珠)上的捕捉模塊，諸如鏈霉親合素一起溫育，從而捕獲靶蛋白。清洗未結(jié)合的材料后，可以檢查支持物以檢測(cè)經(jīng)標(biāo)記的肽探針， 這會(huì)指示支持物上結(jié)合的靶蛋白-肽探針復(fù)合物的存在?；蛘撸梢韵疵摻Y(jié)合的材料，然后對(duì)其檢查以檢測(cè)經(jīng)標(biāo)記的肽探針。再次，經(jīng)標(biāo)記的肽探針的檢測(cè)會(huì)指示洗脫劑中的靶蛋白-肽探針復(fù)合物的存在。圖5A和圖15A顯示了使用經(jīng)生物素標(biāo)記的靶蛋白和經(jīng)鏈霉親合素包被的珠進(jìn)行的親和層析測(cè)定法。此類測(cè)定法可用于例如評(píng)估給定的肽探針的功效。將經(jīng)標(biāo)記的肽探針(SEQ ID NO 1，2 μ M)和生物素化的靶蛋白(Α β 42寡聚物， 2 μ Μ)在PBS中一起溫育30分鐘。然后，使用經(jīng)鏈霉親合素包被的磁珠來(lái)將混合物進(jìn)行捕捉步驟。用PBS清洗該珠以除去未結(jié)合的材料，并通過(guò)SDS-PAGE來(lái)分析捕獲的材料。在備選的測(cè)定法(方案B，在圖15Α中顯示)中，于室溫將4μ N生物素化的Aβ 42寡聚物與預(yù)清洗的鏈霉親合素Dynabead —起溫育30分鐘。然后，用PBS緩沖液將復(fù)合物清洗兩次，并在PBS緩沖液中重懸。然后，混合等體積的結(jié)合的寡聚物和4 μ M經(jīng)標(biāo)記的肽探針(SEQ ID NO :1)，并于室溫溫育30分鐘。然后，通過(guò)三次PBS清洗，接著通過(guò)磁體來(lái)收集珠復(fù)合物來(lái)洗去未結(jié)合的材料。然后，將復(fù)合物在IX LDS緩沖液中重懸，煮沸10分鐘， 并在10% Bis-Tris凝膠上加載。圖15Β顯示了結(jié)果。如圖中所顯示的，僅在存在高分子量寡聚物的情況中在捕捉材料中檢測(cè)出經(jīng)標(biāo)記的肽探針，指示肽探針結(jié)合靶蛋白寡聚物。也可以通過(guò)熒光譜來(lái)分析捕捉材料(未顯示)。在用肽22進(jìn)行的相似的測(cè)定法(方案Α)中，將經(jīng)標(biāo)記的肽探針(SEQ ID NO :2， 4μΜ)和生物素化的靶蛋白(Α β 42寡聚物，4 μ N)在H印es緩沖液(10mM，pH 7.0)中一起溫育90分鐘。然后，使用經(jīng)鏈霉親合素包被的磁珠來(lái)將混合物進(jìn)行捕捉步驟。用PBS清洗該珠以除去未結(jié)合的材料，并通過(guò)SDS-PAGE來(lái)分析捕捉材料。在用肽22進(jìn)行的備選測(cè)定法(方案B，在圖5A中顯示)中，于室溫將4μΝ生物素化的Aβ 42寡聚物與預(yù)清洗的鏈霉親合素Dynabead —起溫育30分鐘。然后，用PBS緩沖液將復(fù)合物清洗兩次，并在PBS緩沖液中重懸。然后，混合等體積的結(jié)合的寡聚物和4 μ M 經(jīng)標(biāo)記的肽探針(SEQ ID NO :2)，并于室溫溫育30分鐘。然后，通過(guò)三次PBS清洗，接著通過(guò)磁體來(lái)收集珠復(fù)合物來(lái)洗去未結(jié)合的材料。然后，將復(fù)合物在IX LDS緩沖液中重懸，煮沸10分鐘，并在10% Bis-Tris凝膠上加載。圖5Β顯示了結(jié)果。左側(cè)小圖(第1道-第3道)顯示了鏈霉親合素磁珠下拉合成的生物素化的寡聚物(將第2道和第3道與第1道比較)。第4道顯示了類似于100% 結(jié)合的以4μ M的濃度直接加載于凝膠上的肽探針(肽22)。第2道顯示了加載至凝膠上的結(jié)合反應(yīng)(方案Α)，注意A β寡聚物和肽探針共洗脫。第3道和第4道顯示了在不添加 (第3道)和添加(第4道)生物素化的A β 42寡聚物的情況中依照方案B制備的結(jié)合反應(yīng)。在沒(méi)有寡聚物的情況中，肽探針不存在于凝膠上，指示它尚未結(jié)合鏈霉親合素珠。在存在生物素化的寡聚物的情況中，回收到肽探針。這些結(jié)果顯示了肽探針直接結(jié)合生物素化的Αβ42寡聚物。實(shí)施例4如上文所討論的，在一些實(shí)施方案中，肽探針的變體序列設(shè)計(jì)為提高與未結(jié)合靶蛋白的肽有關(guān)的任何信號(hào)和與結(jié)合靶蛋白的肽有關(guān)的信號(hào)間的信號(hào)差異，諸如通過(guò)增加與肽的(未結(jié)合的)隨機(jī)/α-螺旋構(gòu)象有關(guān)的任何信號(hào)(例如背景信號(hào))和與肽的(結(jié)合的)β-片層構(gòu)象有關(guān)的信號(hào)間的信號(hào)差異來(lái)進(jìn)行。一種評(píng)估此參數(shù)的方式是在不同濃度的TFE (其是一種誘導(dǎo)肽中的α-螺旋構(gòu)象的有機(jī)溶劑)中溫育經(jīng)標(biāo)記的肽。出于上文所討論的原因，在其α-螺旋與片層構(gòu)象間具有顯著信號(hào)差異的肽可以是特別有用的。將在每個(gè)末端用芘標(biāo)記的肽探針22 (SEQ ID NO :2，2 μ Μ)在tris緩沖液(IOmM Tris, pH 7. 0)中的O至80% TFE中溫育30分鐘。通過(guò)TECAN熒光計(jì)來(lái)測(cè)量反應(yīng)，并記錄受激子單體熒光比率。如圖6A中所顯示的，緩沖液中的肽22的最大信號(hào)響應(yīng)(80至20% TFE的信號(hào)獲得)是約100比率單位，其比參照肽(SEQ ID NO 1)的最大信號(hào)響應(yīng)大4倍。 在存在原纖維淀粉樣靶蛋白的情況中測(cè)試經(jīng)歷構(gòu)象變化的能力時(shí)，肽22比參照肽(SEQ ID NO 1)大2.6倍地運(yùn)行。也就是說(shuō)，肽22在存在原纖維淀粉樣靶蛋白的情況中展現(xiàn)出比參照肽的最大信號(hào)獲得大約2. 6倍的最大信號(hào)獲得。實(shí)施例5(i)對(duì)肽探針構(gòu)象的結(jié)構(gòu)分析如實(shí)施例2中所討論的，將組氨酸和谷氨酸殘基替代引入肽22、38和45 (SEQ ID NO 2-4)中，從而容許形成那些殘基間的鹽橋?？梢栽诓煌琾H和鹽條件下對(duì)此類肽實(shí)施CD 分析以測(cè)定肽在給定條件下的構(gòu)象。在此實(shí)施例中使用在每個(gè)末端用芘模塊標(biāo)記的肽38 (SEQ ID NO 3)。如圖7中所顯示的，在PH 7(實(shí)線)，肽是高度α螺旋的(38%)，而且α螺旋構(gòu)象的比例在pH 4(小虛線)甚至更高(52% )。在這兩種pH水平，500mM NaCl的添加有利于β -片層構(gòu)象而大大減少α螺旋構(gòu)象。如此，在PH 7，在存在500mM NaCl (大虛線)的情況中，α螺旋含量是4%，而β-片層含量是40% (在沒(méi)有鹽的情況中自10%上升)。在pH 4，在存在500mM NaCl (虛線/點(diǎn)線)的情況中，α螺旋含量是6%，而β _片層含量是52% (在沒(méi)有鹽的情況中自4%上升)。這些結(jié)果指示鹽橋使α螺旋構(gòu)象(其構(gòu)象在低PH和低鹽時(shí)是有利的) 穩(wěn)定化。在較大的鹽濃度，鹽橋受到破壞，并且不再使α螺旋構(gòu)象穩(wěn)定化。(ii)對(duì)結(jié)合靶蛋白的肽探針的結(jié)構(gòu)分析可以通過(guò)CD分析來(lái)評(píng)估結(jié)合靶蛋白的肽探針的構(gòu)象。圖8顯示了各自分開及組合的經(jīng)二芘標(biāo)記的肽38 (SEQ ID NO 3)和Αβ42寡聚物(靶蛋白)的構(gòu)象。單獨(dú)的肽是高度α螺旋的(36%)。將肽38與靶蛋白混合后，肽經(jīng)歷導(dǎo)致增加的片層構(gòu)象和減少的 α螺旋構(gòu)象的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。也就是說(shuō)，肽38的二級(jí)結(jié)構(gòu)得到改變，使得α螺旋的比例二等分(18%)，而β-片層結(jié)構(gòu)的比例從20%提高至31%。如此，肽38在與A β 42寡聚物靶蛋白接觸后采用β -片層構(gòu)象，并且可以通過(guò)CD分析來(lái)檢測(cè)構(gòu)象變化。(iii)對(duì)結(jié)合靶蛋白的肽探針的受激子分析也可以通過(guò)對(duì)單獨(dú)的和與靶蛋白組合的肽測(cè)量芘熒光來(lái)檢測(cè)結(jié)合靶蛋白的肽探針的構(gòu)象。圖9B顯示了游離的經(jīng)二芘標(biāo)記的肽45(SEQ ID NO 4)的芘熒光。與β-片層構(gòu)象有關(guān)的受激子熒光與α-螺旋構(gòu)象有關(guān)的單體熒光相比具有不同的波長(zhǎng)，并且受激子單體熒光比率是9 1。圖9Α顯示了在存在不同量的Αβ 42寡聚物靶蛋白(0，0. 03， 0. 1和0. 3 μ Μ)的情況中經(jīng)二芘標(biāo)記的肽45的芘熒光。A β 42寡聚物靶蛋白的添加導(dǎo)致在最高Αβ42寡聚物濃度(0.3μΜ)時(shí)受激子單體熒光比率向20 1的劑量依賴性轉(zhuǎn)變。 受激子單體熒光比率的此變化反映肽的相應(yīng)構(gòu)象變化，其導(dǎo)致增加的β-片層構(gòu)象，和減少的α螺旋構(gòu)象。如此，肽45在與Αβ 42寡聚物靶蛋白接觸后以劑量依賴性方式采用 β -片層構(gòu)象，并且可以通過(guò)測(cè)量芘熒光來(lái)檢測(cè)構(gòu)象變化。實(shí)施例6圖10示意性顯示了本文中所描述的方法和探針的數(shù)個(gè)不同實(shí)施方案。( )Αβ纖維測(cè)定法(頂部小圖)可以在有機(jī)溶劑，諸如40% TFE中進(jìn)行A β纖維測(cè)定法。如圖10的頂部小圖中所顯示的，在沒(méi)有Αβ纖維的情況中在40% TFE中溫育的在每個(gè)末端用芘標(biāo)記的肽探針(例如SEQ ID NO 1)展現(xiàn)出主要為α螺旋的構(gòu)象，如可以通過(guò)⑶分光術(shù)所觀察到的(數(shù)據(jù)未顯示)。此構(gòu)象與芘模塊的單體或自身熒光(370-410nm;見(jiàn)圖6)有關(guān)。在引入Αβ纖維底物后，探針采用片層構(gòu)象。此構(gòu)象與芘模塊的受激子熒光G30-530nm;見(jiàn)圖6)有關(guān)。
( )Αβ寡聚物測(cè)定法(底部小圖)可以在水性溶劑，諸如水中進(jìn)行A β寡聚物測(cè)定法。如圖10的底部小圖A中所顯示的，在沒(méi)有Αβ寡聚物的情況中在每個(gè)末端用芘標(biāo)記的肽探針22(例如SEQ ID NO :2)展現(xiàn)出與芘模塊的受激子熒光有關(guān)的構(gòu)象(見(jiàn)圖11)，并且因此認(rèn)為具有增加的β-片層結(jié)構(gòu)。在引入Αβ寡聚物后，熒光譜轉(zhuǎn)變成主要為自身熒光(單體的)(見(jiàn)圖11)，其與減少的
片層結(jié)構(gòu)，或增加的α螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)?；蛘?，如圖10的底部小圖B中所顯示的，可以在每個(gè)末端用FRET對(duì)(例如FAM和 EDANS)的成員來(lái)標(biāo)記肽探針。依照例示的實(shí)施方案，F(xiàn)RET標(biāo)記物在沒(méi)有A β寡聚物的情況中不相互作用，而在引入Αβ寡聚物后，熒光譜轉(zhuǎn)變成FRET-熒光，其與增加的片層結(jié)構(gòu)有關(guān)。肽探針 AD293(SEQ ID NO :52)、AD292 (SE ID NO :53)、AD 291 (SEQ ID NO :54)和 AD 290 (SEQ ID NO 55)已經(jīng)展現(xiàn)出與此類構(gòu)象變化一致的熒光行為。涉及圖10，底部小圖的觀察結(jié)果提示，至少對(duì)于這些肽，在肽探針的氨基酸序列外，標(biāo)記物的性質(zhì)可以影響肽探針的折疊特性和/或構(gòu)象。如此，芘標(biāo)記物可以促成β-片層結(jié)構(gòu)的形成，所述片層結(jié)構(gòu)導(dǎo)致沒(méi)有Αβ寡聚物情況中的受激子熒光。另一方面， FRET對(duì)不表現(xiàn)為如在沒(méi)有底物的情況中一樣強(qiáng)地相互作用。實(shí)施例7如上文所討論的，肽22 (SEQ ID NO 2)在與Αβ寡聚物相互作用后經(jīng)歷構(gòu)象變化。 圖11顯示了在每個(gè)末端用芘標(biāo)記且于室溫在IOmM Hepes (ρΗ 7.0)中在水性條件下溫育數(shù)小時(shí)的肽22的熒光譜。肽22的熒光在沒(méi)有寡聚物的情況中隨時(shí)間是穩(wěn)定的(沒(méi)有單體或受激子熒光的升高)，但是在與可溶性A β寡聚物一起溫育時(shí)展現(xiàn)出芘單體信號(hào)的升高。 (實(shí)線=時(shí)間0;虛線=3小時(shí)；點(diǎn)線=18小時(shí))。具體地，并如圖11 (右側(cè)小圖)中所顯示的，肽22展現(xiàn)出從芘受激子(于約460和485nm的發(fā)射最大值)向芘單體(于約380和 400nm的發(fā)射最大值)的時(shí)間依賴性構(gòu)象轉(zhuǎn)變。實(shí)施例8此實(shí)施例例示肽22對(duì)A β寡聚物的特異性。于室溫將肽22 (IOOnM)在水中與等摩爾濃度(0、30、100、和300ηΝ)的數(shù)種潛在的 A β底物Α β 42寡聚物(1型)；A β 42寡聚物O型)；A β 1-42單體；A β 1-40單體；A β 1-42 纖維；A β 1-40纖維；牛血清清蛋白(對(duì)照底物)；和碳酸酐酶(對(duì)照底物)一起溫育15小時(shí)。如圖12中所顯示的，肽22在兩種Αβ寡聚物底物方面展現(xiàn)出劑量依賴性熒光響應(yīng)，其特征在于芘單體(自身)熒光隨寡聚物加載升高而升高。A β 42單體和A β 40纖維在較高的底物加載時(shí)誘導(dǎo)輕微的熒光響應(yīng)。這些數(shù)據(jù)表明在水性條件下，肽22熒光響應(yīng)是靶物特異性且劑量響應(yīng)性的。實(shí)施例9此實(shí)施例進(jìn)一步研究了肽22的反應(yīng)性。參考圖13Α，于25°C將肽22(70ηΜ)與0、30、100、或300ηΝ合成的Αβ 42寡聚物一起溫育，并在溫育3小時(shí)后記錄熒光發(fā)射譜。如圖13(頂部小圖)中所顯示的，在沒(méi)有Αβ42 寡聚物的情況中，肽22展現(xiàn)出非常少的芘單體(自身)熒光(370-420nm)。然而，芘單體 (自身)熒光以劑量依賴性方式隨Αβ 42寡聚物濃度而升高。例如，并如圖13中所顯示的，肽22在與300ηΝΑ β 42寡聚物一起溫育時(shí)比與30Α β 42寡聚物一起溫育時(shí)顯示更大的芘單體熒光。(實(shí)線無(wú)A β 42寡聚物；虛線/點(diǎn)線30ηΝ A β 42寡聚物；大虛線100ηΝ A β 42 寡聚物；小虛線300ηΝΑβ 42寡聚物)。使用圓二色性(⑶)分析來(lái)測(cè)定肽22、合成的A β 42寡聚物、及其混合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)。于室溫將樣品在IOmM磷酸鈉(ρΗ 7.0)中溫育3小時(shí)，之后測(cè)量⑶。對(duì)于每份樣品， 自190-260nm評(píng)估相對(duì)橢圓率。圖13(頂部小圖)顯示了 4 μ M肽22 (實(shí)線)；33ηΜ合成的 Αβ 42寡聚物(虛線/點(diǎn)線)；兩種個(gè)別樣品的算術(shù)和(大虛線)；肽22和合成的Αβ 42寡聚物的混合物(小虛線)的CD譜。每個(gè)數(shù)據(jù)集表示三次分開的譜掃描的平均值。數(shù)據(jù)顯示單獨(dú)的肽22具有主要為β片層的二級(jí)結(jié)構(gòu)(36%)，而合成的Αβ42寡聚物基本上是未結(jié)構(gòu)化的(即橢圓率是0)。在將兩種種類一起溫育時(shí)，肽22的結(jié)構(gòu)保持主要為β片層(43%)，具有與兩種個(gè)別組分的和非常相似的譜。數(shù)據(jù)提示在肽22與Αβ42 寡聚物相互作用后發(fā)生的構(gòu)象變化，所述A β 42寡聚物改變通過(guò)CD檢測(cè)不到的肽22的熒光譜，并且因此沒(méi)有顯著改變肽或肽-寡聚物復(fù)合物的總體β-片層含量。實(shí)施例10下文表1中列出了依照上文所描述的原則設(shè)計(jì)的例示性肽探針。如通過(guò)序列中的陰影所顯示的，大多數(shù)肽序列基于Αβ肽(WT ；SEQ ID NO 1)的氨基酸16-35，其是Aβ肽的 β-片層形成區(qū)(其它序列基于A β肽的更長(zhǎng)的部分)，具有添加的C端賴氨酸殘基以便于標(biāo)記。在該表中標(biāo)示序列變體的種類(或多種種類)(例如進(jìn)行修飾以改善穩(wěn)定性，提供鹽橋，增加溶解度，促成α-螺旋形成，使β-片層結(jié)構(gòu)脫穩(wěn)定化，添加A β結(jié)合基序等)。還顯示了肽探針標(biāo)記的選項(xiàng)，包括不同標(biāo)記物位點(diǎn)和標(biāo)記物對(duì)。除非另有指明，用兩個(gè)芘標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記所有肽，一個(gè)在N端胺上，而另一個(gè)在C端賴氨酸殘基的側(cè)鏈上。另外，除非另有指明，所有構(gòu)建體含有替換羧基基團(tuán)的C端酰胺。在該表中使用以下縮寫“ΡΒΑ”=芘丁酸“r，，=d_ 精氨酸"Dabcyl，，= 4_ (4- 二甲基氨基苯基)二氮烯基苯甲酸“EDANS”= 5_(2，-氨乙基)氨基萘磺酸“FAM” = 5 (6)羧基熒光素“丹酰” =5- 二甲基氨基萘-1-磺酰表1 肽探針
權(quán)利要求
1.一種針對(duì)能夠展現(xiàn)出與淀粉樣蛋白生成性疾病有關(guān)的構(gòu)象變化的靶蛋白的肽探針， 其中所述肽探針是肽或肽模擬物，其(i)由10至50個(gè)氨基酸殘基組成，其包含作為參照序列變體的氨基酸序列，所述參照序列由所述靶蛋白的β-片層形成區(qū)的氨基酸序列組成， ( )能夠采用無(wú)規(guī)卷曲/α-螺旋構(gòu)象和β-片層構(gòu)象兩者，并(iii)在結(jié)合靶蛋白后經(jīng)歷產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的構(gòu)象變化，其中所述變體序列相對(duì)于所述參照序列包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、替代或刪除，使得(A)所述變體序列的無(wú)規(guī)卷曲/α -螺旋構(gòu)象比由所述參照氨基酸序列組成的探針在氧化環(huán)境中更穩(wěn)定；和/或(B)無(wú)規(guī)卷曲/α-螺旋構(gòu)象的所述變體序列的N端與C端之間的距離與β-片層構(gòu)象的所述變體序列的N端與C端之間的距離不同；和/或(C)所述變體序列在結(jié)合展現(xiàn)出β-片層構(gòu)象的靶蛋白后比所述參照序列更有效地采用β -片層構(gòu)象；和/或(D)所述變體序列在結(jié)合展現(xiàn)出片層構(gòu)象的靶蛋白后采用不太有序的構(gòu)象；和/或(E)所述變體序列的片層結(jié)構(gòu)在熱力學(xué)上沒(méi)有所述參照序列的片層結(jié)構(gòu)強(qiáng)； 和/或(F)所述變體序列比所述參照序列具有升高的穩(wěn)定性和/或降低的反應(yīng)性；和/或(G)所述變體序列比所述參照序列具有升高的親水性和/或在水溶液中的溶解度；和/或(H)所述變體序列比所述參照序列具有額外的Aβ結(jié)合基序；和/或(I)所述變體序列具有增強(qiáng)的形成聚集體的能力。
2.權(quán)利要求1的肽探針，其中所述肽探針在N端、C端、這兩端、或者在所述肽在結(jié)合靶蛋白后經(jīng)歷構(gòu)象變化時(shí)產(chǎn)生信號(hào)的一個(gè)或多個(gè)位置處用可檢測(cè)標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記。
3.權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的肽探針，其中所述肽探針用兩種或更多種標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記， 其中在所述肽探針結(jié)合靶蛋白時(shí)所述肽探針上的兩種或更多種標(biāo)記物間的距離與在所述肽探針未結(jié)合靶蛋白時(shí)的所述距離不同。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的肽探針，其中在所述肽探針結(jié)合靶蛋白時(shí)由所述可檢測(cè)標(biāo)記物產(chǎn)生的所述信號(hào)與在所述肽探針未結(jié)合靶蛋白時(shí)產(chǎn)生的所述信號(hào)不同。
5.權(quán)利要求3的肽探針，其中所述肽探針用可檢測(cè)標(biāo)記物對(duì)來(lái)標(biāo)記，所述可檢測(cè)標(biāo)記物對(duì)選自受激子對(duì)、FRET對(duì)和熒光團(tuán)/猝滅劑對(duì)。
6.權(quán)利要求5的肽探針，其中所述肽探針用受激子對(duì)來(lái)標(biāo)記，并在所述肽探針展現(xiàn)出 β-片層構(gòu)象時(shí)發(fā)射受激子信號(hào)。
7.權(quán)利要求2-6中任一項(xiàng)的肽探針，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記物包含芘模塊。
8.權(quán)利要求5的肽探針，其中所述肽探針用FRET對(duì)來(lái)標(biāo)記，并在所述肽探針展現(xiàn)出 β-片層構(gòu)象時(shí)發(fā)射熒光共振轉(zhuǎn)移(FRET)信號(hào)。
9.權(quán)利要求8的肽探針，其中所述FRET對(duì)選自下組DACIA-I/NBD、Marina藍(lán)/NBD、丹酰 /trp、和 EDANS/FAM。
10.權(quán)利要求5的肽探針，其中所述肽探針用熒光團(tuán)/猝滅劑對(duì)來(lái)標(biāo)記，且其中所述熒光團(tuán)信號(hào)在所述肽探針展現(xiàn)出片層構(gòu)象時(shí)被猝滅。
11.權(quán)利要求10的肽探針，其中所述熒光團(tuán)/猝滅劑對(duì)選自下組芘/Dabcyl、EDANS/ Dabcyl 和 FAM/Dabcyl。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的肽探針，其中所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、替代或刪除是在所述參照序列的內(nèi)部部分做出的。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的肽探針，其中所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、替代或刪除是在所述參照序列的N端或C端做出的。
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的肽探針，其中變體序列進(jìn)一步包含在C端添加的賴氨酸殘基。
15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的肽探針，其中所述變體序列包含用抗氧化的殘基替換甲硫氨酸殘基。
16.權(quán)利要求15的肽探針，其中所述甲硫氨酸殘基用丙氨酸殘基替換。
17.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的肽探針，其中所述變體序列包含用丙氨酸殘基替換或添加所述參照序列的至少3個(gè)連續(xù)的殘基。
18.權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的肽探針，其中所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、替代或刪除將鹽橋引入所述變體序列中。
19.權(quán)利要求18的肽探針，其中所述變體序列包含選自下組的殘基間的鹽橋谷氨酸殘基和組氨酸殘基、谷氨酸殘基和精氨酸殘基、和谷氨酸殘基和賴氨酸殘基。
20.權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的肽探針，其中所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、替代或刪除將Αβ結(jié)合基序引入所述肽探針中。
21.權(quán)利要求20的肽探針，其中所述Aβ結(jié)合基序包含GXXEG。
22.權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的肽探針，其中所述變體序列在結(jié)合展現(xiàn)出β-片層構(gòu)象的靶蛋白后采用不太有序的構(gòu)象。
23.權(quán)利要求22的肽探針，其中所述靶蛋白是Αβ蛋白，而所述變體序列包含一處或多處選自下組的替代G^H、G29R, G^K、和G33E。
24.權(quán)利要求22或權(quán)利要求23的肽探針，其中所述變體序列的β-片層結(jié)構(gòu)在熱力學(xué)上沒(méi)有所述參照序列的片層結(jié)構(gòu)強(qiáng)。
25.權(quán)利要求對(duì)的肽探針，其中所述靶蛋白是Αβ蛋白，而所述變體序列包含一處或多處選自下組的替代:I32S、F19S、S26D、H29D, I31D、L34D、和 L34P。
26.權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)的肽探針，其中所述變體序列比所述參照序列具有升高的親水性和/或在水溶液中的溶解度。
27.權(quán)利要求沈的肽探針，其中所述變體序列包含一處或多處引入谷氨酸殘基和/或 d-精氨酸殘基的氨基酸添加或替代。
28.權(quán)利要求沈的肽探針，其中所述變體序列與親水性模塊綴合。
29.權(quán)利要求觀的肽探針，其中所述親水性模塊包含可溶性聚乙二醇模塊。
30.權(quán)利要求1- 中任一項(xiàng)的肽探針，其中可檢測(cè)標(biāo)記物與所述肽探針的末端賴氨酸殘基的側(cè)鏈綴合。
31.權(quán)利要求1-30中任一項(xiàng)的肽探針，其中可檢測(cè)標(biāo)記物與所述肽探針的內(nèi)部賴氨酸殘基的側(cè)鏈綴合。
32.權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)的肽探針，其中所述肽探針與生物素模塊綴合。
33.權(quán)利要求32的肽探針，其中所述肽探針經(jīng)由肽接頭與生物素模塊綴合。
34.權(quán)利要求33的肽探針，其中所述肽接頭選自下組柔性接頭、螺旋接頭、凝血酶位點(diǎn)接頭和扭結(jié)接頭。
35.權(quán)利要求34的肽探針，其中所述接頭包含選自由SEQID NO 56-60組成的組的氨基酸序列。
36.權(quán)利要求32的肽探針，其中所述肽探針經(jīng)由內(nèi)部賴氨酸殘基的側(cè)鏈與生物素模塊圣雙口 ο
37.權(quán)利要求1-36中任一項(xiàng)的肽探針，其中所述靶蛋白是Αβ蛋白。
38.權(quán)利要求37的肽探針，其中所述變體序列包含選自由SEQID NO :2_55組成的組的氨基酸序列。
39.權(quán)利要求37的肽探針，其中所述變體序列包含氨基酸序列SEQID Ν0:2(肽22)。
40.一種針對(duì)能夠展現(xiàn)出與淀粉樣蛋白生成性疾病有關(guān)的構(gòu)象變化的靶蛋白的肽探針，其中所述肽探針是肽或肽模擬物，其(i)由10至50個(gè)氨基酸殘基組成，其包含作為參照序列變體的氨基酸序列，所述參照序列由所述靶蛋白的β-片層形成區(qū)的氨基酸序列組成，(ii)能夠采用無(wú)規(guī)卷曲/α-螺旋構(gòu)象和β-片層構(gòu)象兩者，并(iii)在結(jié)合靶蛋白后采用不太有序的構(gòu)象。
41.權(quán)利要求40的肽探針，其中所述肽探針在N端、C端、這兩端、或者在所述肽在結(jié)合靶蛋白后經(jīng)歷構(gòu)象變化時(shí)產(chǎn)生信號(hào)的一個(gè)或多個(gè)位置處用可檢測(cè)標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記。
42.權(quán)利要求41的肽探針，其中所述肽探針用可檢測(cè)標(biāo)記物對(duì)來(lái)標(biāo)記，所述可檢測(cè)標(biāo)記物對(duì)選自受激子對(duì)、FRET對(duì)和熒光團(tuán)/猝滅劑對(duì)。
43.權(quán)利要求42的肽探針，其中所述肽探針用受激子對(duì)來(lái)標(biāo)記，并在所述肽探針未結(jié)合靶蛋白時(shí)發(fā)射升高的受激子信號(hào)，而在所述肽探針結(jié)合靶蛋白時(shí)發(fā)射升高的自身信號(hào)。
44.權(quán)利要求43的肽探針，其中所述受激子對(duì)包含兩個(gè)芘模塊。
45.權(quán)利要求42的肽探針，其中所述肽探針用FRET對(duì)來(lái)標(biāo)記，并在所述肽探針未結(jié)合靶蛋白時(shí)發(fā)射升高的熒光共振轉(zhuǎn)移(FRET)信號(hào)，而在所述肽探針結(jié)合靶蛋白時(shí)發(fā)射非 FRET熒光團(tuán)信號(hào)。
46.權(quán)利要求42的肽探針，其中所述肽探針用熒光團(tuán)/猝滅劑對(duì)來(lái)標(biāo)記，并在所述肽探針未結(jié)合靶蛋白時(shí)發(fā)射降低或猝滅的信號(hào)，而在所述肽探針結(jié)合靶蛋白時(shí)發(fā)射熒光團(tuán)信號(hào)。
47.權(quán)利要求40-46中任一項(xiàng)的肽探針，其中所述靶蛋白是Αβ蛋白。
48.權(quán)利要求47的肽探針，其中所述變體序列包含選自由SEQID NO :2-4,14-15和 28-35組成的組的氨基酸序列。
49.權(quán)利要求1-36和40-46中任一項(xiàng)的肽探針，其中所述靶蛋白選自下組淀粉樣胰島多肽前體蛋白、淀粉樣β蛋白、Αβ肽、血清淀粉樣蛋白Α、胰島素、amylin、非淀粉樣蛋白β組分、朊病毒、血紅蛋白、免疫球蛋白或其片段、β 2-微球蛋白、α-突觸核蛋白、視紫紅質(zhì)、α 1-抗胰凝乳蛋白酶、晶體蛋白、τ、ρ53、早老蛋白、低密度脂蛋白受體、載脂蛋白、超氧化物歧化酶、神經(jīng)絲蛋白、運(yùn)甲狀腺素蛋白、原降鈣素或降鈣素、心房鈉尿因子、凝溶膠蛋白、囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)物、亨延頓氏病蛋白、血纖蛋白原α-鏈、苯丙氨酸羥化酶、膠原、 β -氨基己糖苷酶、和半胱氨酸蛋白酶抑制劑C蛋白。
50.一種用于檢測(cè)測(cè)試樣品中的靶蛋白的方法，其中所述靶蛋白展現(xiàn)出與淀粉樣蛋白生成性疾病有關(guān)的片層構(gòu)象，包括(i)使所述樣品與權(quán)利要求1-49中任一項(xiàng)的肽探針接觸以形成測(cè)試混合物；并( )檢測(cè)所述肽探針與所述樣品中存在的任何靶蛋白間的任何結(jié)合。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述肽探針在N端、C端、這兩端、或者在所述肽在結(jié)合靶蛋白后經(jīng)歷構(gòu)象變化時(shí)產(chǎn)生信號(hào)的一個(gè)或多個(gè)位置處用可檢測(cè)標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述肽探針用兩種或更多種標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記，其中在所述肽探針結(jié)合靶蛋白時(shí)所述肽探針上的兩種或更多種標(biāo)記物間的距離與在所述肽探針未結(jié)合靶蛋白時(shí)的所述距離不同。
53.權(quán)利要求51-52中任一項(xiàng)的方法，其中在所述肽探針結(jié)合靶蛋白時(shí)由所述可檢測(cè)標(biāo)記物產(chǎn)生的所述信號(hào)與在所述肽探針未結(jié)合靶蛋白時(shí)產(chǎn)生的所述信號(hào)不同。
54.權(quán)利要求50-53中任一項(xiàng)的方法，其中所述肽探針用可檢測(cè)標(biāo)記物對(duì)來(lái)標(biāo)記，所述可檢測(cè)標(biāo)記物對(duì)選自受激子對(duì)、FRET對(duì)和熒光團(tuán)/猝滅劑對(duì)。
55.權(quán)利要求M的方法，其中所述肽探針用受激子對(duì)來(lái)標(biāo)記，并在所述肽探針展現(xiàn)出 β-片層構(gòu)象時(shí)發(fā)射受激子信號(hào)。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記物包含芘模塊。
57.權(quán)利要求M的方法，其中所述肽探針用FRET對(duì)來(lái)標(biāo)記，并在所述肽探針展現(xiàn)出 β -片層構(gòu)象時(shí)發(fā)射熒光共振轉(zhuǎn)移(FRET)信號(hào)。
58.權(quán)利要求M的方法，其中所述肽探針用熒光團(tuán)/猝滅劑對(duì)來(lái)標(biāo)記，且其中所述熒光團(tuán)信號(hào)在所述肽探針展現(xiàn)出片層構(gòu)象時(shí)被猝滅。
59.權(quán)利要求50-58中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(ii)包括檢測(cè)由在結(jié)合靶蛋白后經(jīng)歷構(gòu)象變化的所述肽探針產(chǎn)生的任何信號(hào)。
60.權(quán)利要求51-58中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(ii)包括檢測(cè)包含所述肽探針和靶蛋白的復(fù)合物，其通過(guò)檢測(cè)由所述復(fù)合物中存在的任何可檢測(cè)標(biāo)記物產(chǎn)生的任何信號(hào)來(lái)進(jìn)行。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述復(fù)合物是不溶性復(fù)合物，且步驟(ii)包括檢測(cè)由所述不溶性復(fù)合物中存在的任何可檢測(cè)標(biāo)記物產(chǎn)生的任何信號(hào)。
62.權(quán)利要求60的方法，其中所述復(fù)合物是可溶性復(fù)合物，且步驟(ii)包括檢測(cè)由所述可溶性復(fù)合物中存在的任何可檢測(cè)標(biāo)記物產(chǎn)生的任何信號(hào)。
63.權(quán)利要求60的方法，其中該方法進(jìn)一步包括在步驟(ii)前通過(guò)選自離心、大小排阻層析、和親和層析的方法來(lái)分開所述復(fù)合物與所述測(cè)試混合物。
64.一種用于檢測(cè)與淀粉樣蛋白生成性疾病有關(guān)的靶蛋白的方法，其中肽探針在來(lái)自受試者的生理學(xué)樣品中，包括(A)使所述樣品與肽探針接觸，所述肽探針是肽或肽模擬物，其(i)由10至50個(gè)氨基酸殘基組成，其包含作為參照序列變體的氨基酸序列，所述參照序列由所述靶蛋白的 β-片層形成區(qū)的氨基酸序列組成，( )能夠采用無(wú)規(guī)卷曲/α-螺旋構(gòu)象和β-片層構(gòu)象兩者，并(iii)在結(jié)合靶蛋白后采用不太有序的構(gòu)象；并(B)檢測(cè)所述探針與所述樣品中存在的任何靶蛋白間的任何結(jié)合。
65.權(quán)利要求64的方法，其中所述肽探針在N端、C端、這兩端、或者在所述肽在結(jié)合靶蛋白后經(jīng)歷構(gòu)象變化時(shí)產(chǎn)生信號(hào)的一個(gè)或多個(gè)位置處用可檢測(cè)標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記。
66.權(quán)利要求65的方法，其中所述肽探針用可檢測(cè)標(biāo)記物對(duì)來(lái)標(biāo)記，所述可檢測(cè)標(biāo)記物對(duì)選自受激子對(duì)、FRET對(duì)和熒光團(tuán)/猝滅劑對(duì)。
67.權(quán)利要求66的方法，其中所述肽探針用受激子對(duì)來(lái)標(biāo)記，且步驟(ii)包括檢測(cè)任何升高的自身信號(hào)或降低的受激子信號(hào)。
68.權(quán)利要求66的方法，其中所述肽探針用FRET對(duì)來(lái)標(biāo)記，且步驟(ii)包括檢測(cè)任何升高的非FRET熒光團(tuán)信號(hào)或降低的FRET信號(hào)。
69.權(quán)利要求66的方法，其中所述肽探針用熒光團(tuán)/猝滅劑對(duì)來(lái)標(biāo)記，且步驟(ii)包括檢測(cè)任何升高的熒光團(tuán)信號(hào)。
70.一種用于在受試者中檢測(cè)與淀粉樣蛋白生成性疾病有關(guān)的靶蛋白的體內(nèi)方法，包括(A)對(duì)所述受試者施用權(quán)利要求1-49中任一項(xiàng)的肽探針，其中所述探針用在所述探針結(jié)合靶蛋白時(shí)產(chǎn)生信號(hào)的可檢測(cè)標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記，并(B)檢測(cè)所述信號(hào)。
71.權(quán)利要求70的方法，其中使用成像技術(shù)來(lái)檢測(cè)所述信號(hào)。
72.權(quán)利要求71的方法，其中所述成像技術(shù)選自下組正電子發(fā)射斷層攝影(PET)、 單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)(SPECT)、磁共振成像(MRI)、放射照相術(shù)、斷層攝影術(shù)、熒光術(shù)、核醫(yī)學(xué)、光學(xué)成像、腦照相術(shù)和超聲波掃描術(shù)。
73.一種治療患有或有風(fēng)險(xiǎn)形成淀粉樣蛋白生成性疾病的受試者的方法，包括對(duì)所述受試者施用權(quán)利要求1-49中任一項(xiàng)的肽探針。
74.權(quán)利要求70-73中任一項(xiàng)的方法，其中所述探針與針對(duì)所述淀粉樣蛋白生成性疾病的別的治療劑綴合。
75.—種針對(duì)能夠展現(xiàn)出與淀粉樣蛋白生成性疾病有關(guān)的片層構(gòu)象的靶蛋白的肽探針，其中所述肽探針(i)由10至50個(gè)氨基酸殘基組成，其包含作為參照序列變體的氨基酸序列，所述參照序列由所述靶蛋白的片層形成區(qū)的氨基酸序列組成，(ii)能夠采用無(wú)規(guī)卷曲/α-螺旋構(gòu)象和β-片層構(gòu)象兩者，并(iii)在結(jié)合展現(xiàn)出β-片層構(gòu)象的靶蛋白后采用β-片層構(gòu)象，其中所述變體序列相對(duì)于所述參照序列包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、替代或刪除，使得(A)所述變體序列的無(wú)規(guī)卷曲/α-螺旋構(gòu)象比由所述參照氨基酸序列組成的探針在氧化環(huán)境中更穩(wěn)定；和/或(B)無(wú)規(guī)卷曲/α-螺旋構(gòu)象的所述變體序列的N端與C端之間的距離與β-片層構(gòu)象的所述變體序列的N端與C端之間的距離不同；和/或(C)所述變體序列在結(jié)合展現(xiàn)出β-片層構(gòu)象的靶蛋白后比所述參照序列更有效地采用β-片層構(gòu)象。
76.依照權(quán)利要求1-49中任一項(xiàng)的肽在用于檢測(cè)與淀粉樣蛋白生成性疾病有關(guān)的靶蛋白的體內(nèi)方法中的用途。
77.依照權(quán)利要求1-49中任一項(xiàng)的肽在治療患有或有風(fēng)險(xiǎn)形成淀粉樣蛋白生成性疾病的受試者的方法中的用途。
全文摘要
公開了可用于例如檢測(cè)具有可與疾病有關(guān)的β-片層二級(jí)結(jié)構(gòu)的靶蛋白，及用于診斷和治療此類疾病的新肽。還公開了相關(guān)方法和試劑盒。
文檔編號(hào)C07K14/47GK102365295SQ201080014826
公開日2012年2月29日 申請(qǐng)日期2010年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月30日
發(fā)明者A.魯?shù)婪? D.R.杜安, J.R.莫爾, R.韋格爾津 申請(qǐng)人:阿德利夫股份有限公司