1.一種煙草腋芽生長調(diào)控基因NtIPT1，其特征在于所述的煙草腋芽生長調(diào)控基因NtIPT1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草腋芽生長調(diào)控基因NtIPT1，其特征在于所述的煙草腋芽生長調(diào)控基因NtIPT1編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一種權(quán)利要求1所述的煙草腋芽生長調(diào)控基因NtIPT1的克隆方法，其特征在于包括以下步驟：
A、確定NtIPT1基因序列；
（1）利用同源基因擬南芥At IPT1序列搜索NCBI煙草基因組數(shù)據(jù)庫，得到煙草NtIPT1的核苷酸序列，該核苷酸序列的NCBI號(hào)為XM_016617583.1；利用此序列設(shè)計(jì)基因克隆引物：
正向引物：5′- AACCTTTTCTTTCTCCAAAACG -3′；
反向引物：5′- CAAAACTGGCGATCGATTACG -3′；
B、提取煙草根組織RNA，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA；
C、根據(jù)NtIPT1基因序列設(shè)計(jì)合成特異性引物，以反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選用Phusion高保真擴(kuò)增酶反應(yīng)體系，體系總體積50μL，包括：200ng cDNA，5×Phusion HF反應(yīng)緩沖液，10mM dNTP，2U的Phusion? High-Fidelity DNA Polymerase，加入特異性引物的正反向引物各1μM，PCR反應(yīng)在Mastercycler? pro擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃，30秒；98℃，7秒，60℃，30秒，72℃，40秒，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7分鐘；回收和純化PCR產(chǎn)物；
D、純化產(chǎn)物與載體連接，通過試劑盒反應(yīng)與TOPO載體連接，連接體系與過程如下： 4μL純化產(chǎn)物+1μL salt solution +1μL PCR-BluntⅡ-TOPO混勻，25℃，水浴30min；將連好的載體通過熱激轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，加液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)后涂到含100mg/L 卡那霉素的LB平板上過夜培養(yǎng)， 長出菌后挑取菌落進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后取2ml菌液提取質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒PCR檢測(cè)，篩選陽性克隆，對(duì)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的煙草腋芽生長調(diào)控基因NtIPT1的克隆方法，其特征在于C步驟中所述的特異性引物為：
正向引物：5′- AACCTTTTCTTTCTCCAAAACG -3′；
反向引物：5′- CAAAACTGGCGATCGATTACG -3′。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的煙草腋芽生長調(diào)控基因NtIPT1的克隆方法，其特征在于D步驟中所述的培養(yǎng)基為：稱取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g 溶解于1L 蒸餾水中，高溫滅菌（121℃，25min）后使用。
6.一種權(quán)利要求1所述的煙草腋芽生長調(diào)控基因NtIPT1的應(yīng)用，其特征在于所述的煙草腋芽生長調(diào)控基因NtIPT1在獲得降低打頂后煙草產(chǎn)生腋芽的發(fā)育長度和重量的轉(zhuǎn)基因植株中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的煙草腋芽生長調(diào)控基因NtIPT1的應(yīng)用，其特征在于所述用于獲得降低打頂后煙草產(chǎn)生腋芽的發(fā)育長度和重量的轉(zhuǎn)基因植株的方法包括以下步驟：
A、構(gòu)建RNAi載體：
a、以pCR?-BluntII-TOPO載體為中間載體、PK7GW1Wg2為表達(dá)載體構(gòu)建NtIPT1基因的RNAi 載體，構(gòu)建引物為：
NtIPT1-RNAiF: 5’-GGATCCCGCCGGAAAATCAAGACTGT-3’，
NtIPT1-RNAiR: 5’-CTCGAGACTGCAAGTGAAGCCATGTT-3’，
NtIPT1-RNAiF中GGATCC處為BamH I酶切位點(diǎn)；NtIPT1-RNAiR中CTCGAG處為Xho I酶切位點(diǎn)；
b、以NtIPT1陽性克隆TOPO質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體積為50μL，包括：200ng cDNA，5×Phusion HF反應(yīng)緩沖液，10mM dNTP，2U的Phusion? High-Fidelity DNA Polymerase，加入NtIPT1-RNAiF引物、NtIPT1-RNAiR引物各1μM，PCR反應(yīng)在Mastercycler? pro擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃，30秒；98℃，7秒，55℃，30秒，72℃，30秒，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7分鐘；回收和純化PCR產(chǎn)物；
c、回收目的片段產(chǎn)物與TOPO載體連接：通過試劑盒反應(yīng)與TOPO載體連接；
連接體系與過程如下： 4μL純化產(chǎn)物+1μL salt solution +1μL PCR?-BluntⅡ-TOPO混勻，25℃，水浴30min，將連好的載體通過熱激轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，加培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)后涂到含100mg/L 卡那霉素的LB平板上過夜培養(yǎng)，長出菌后挑取菌落進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后取2ml菌液提取質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒PCR檢測(cè)，篩選陽性克隆，對(duì)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序；
d、入門克隆pENTRTM2B-NtIPT1RNAi的構(gòu)建：用上步測(cè)序?qū)Φ腡OPO質(zhì)粒和pENTRTM2B空載體做酶切反應(yīng)：BamH I + Xho I雙酶切TOPO質(zhì)粒和pENTRTM2B-ccdB得到目的基因片段和載體片段pENTRTM2B，切膠回收后進(jìn)行連接、連接體系：連接反應(yīng)總體積為10μL，含酶切目的片段的切膠回收產(chǎn)物4μL，pENTRTM2B（BamHI+Xho I雙酶切）載體1μL，10 × T4 buffer1μL，T4 Ligase 1μL，滅菌雙蒸水3μL，混勻，室溫反應(yīng)2小時(shí)，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，加培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)后涂到含100mg/L 卡那霉素的LB平板上過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)和酶切檢測(cè)，以驗(yàn)證目的基因片段是否已經(jīng)插入載體片段，入門載體是否構(gòu)建成功；
e、通過LR反應(yīng)得到植物表達(dá)載體：挑選檢測(cè)正確的入門克隆與植物表達(dá)載體pK7GW1Wg2 (Destination clone)進(jìn)行LR反應(yīng)，具體反應(yīng)如下：體系與過程如下：
1）連上2B載體的入門克隆(50-150ng )1-7μL + 0.5μL Destination Vector + TE Buffer(up to 8μL)；
2）上述體系混勻，冰浴2min,輕彈2次；
3）加入2μL LR CloneaseTMⅡ enzyme Mix 到上述體系，輕彈，混勻，離心，25℃水浴1h；
4）加入1μL Proteinase K 輕彈，混勻，37℃水浴10min；
通過熱激轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌，加入培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)后涂含100mg/L 壯觀霉素的LB平板上，得到植物表達(dá)載體，挑菌提質(zhì)粒后，以載體質(zhì)粒為模板，用兩對(duì)引物（T35SF1/P35SR1、IntronF2/P35SR2）進(jìn)行PCR檢測(cè)，用LA taq體系進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系包括：200ng質(zhì)粒DNA，10×LA反應(yīng)緩沖液，10mM dNTP，2U的LA taq DNA Polymerase，加入正反向引物各1μM，PCR反應(yīng)在Mastercycler? pro擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃，5分鐘；94℃，30秒，55℃，30秒，72℃，2分鐘，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7分鐘；檢測(cè)重組質(zhì)粒的正確性，理論上由T35SF1/P35SR1引物擴(kuò)增的片段大小為1.7 kb，由IntronF2/P35SR2引物擴(kuò)增的片段大小為750bp ，同時(shí)滿足兩個(gè)條件，則表明表達(dá)載體構(gòu)建成功，將檢測(cè)對(duì)的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，進(jìn)一步驗(yàn)證；
B、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化：
從-80℃冰箱中取出農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在冰上溶解，并加入重組表達(dá)載體PK7G- NtIPT1 4μL；將混合物分別放入液氮速凍1分鐘，轉(zhuǎn)入37℃水浴5分鐘，再冰浴2分鐘，向混合物中加入1mL LB液體培養(yǎng)基，28℃、220rpm培養(yǎng)3~4小時(shí)；培養(yǎng)物涂布于含有壯觀霉素100mg/L和利福平25mg/L的LB固體培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)2~3天，可見含有目的載體的農(nóng)桿菌克??；
C、RNAi載體導(dǎo)入煙草、培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植株：
a、挑取含有目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌克隆，在含有壯觀霉素和利福平的LB平板上劃線，28℃培養(yǎng)2~3天；刮取劃線菌斑接菌于含有壯觀霉素和利福平的MS培養(yǎng)基中，28℃，220rpm震蕩培養(yǎng)，菌液濃度達(dá)到OD=0.5~0.8時(shí)進(jìn)行侵染，得到含目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌菌體；將菌體收集到離心管中，6,000rpm離心5分鐘富集菌體，棄上清，再用20ml液體MS培養(yǎng)基重懸菌體，得到含目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌懸浮菌液；
b、將煙草葉片置于500mL廣口瓶中， 加入適量75%乙醇，漂洗1min；倒掉乙醇，加入0.1%的HgCl2溶液，置搖床上室溫振蕩15~30分鐘；倒掉溶液，用無菌水沖洗6遍；
c、將煙草葉片取出，用滅菌吸水紙洗去表面液體，取無菌葉片用剪刀切成1cm×1cm的小片，將切成小片的煙草葉片分別放入含目標(biāo)載體的無菌MS液體培養(yǎng)基懸浮菌液中，靜置15~20min；取出煙草葉片，用無菌濾紙吸去多余菌液，于加入6-BA 1.0mg/L、NAA 0.1mg/L的MS培養(yǎng)基中25℃暗培養(yǎng)兩天；把煙草葉片轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，切口接觸培養(yǎng)基，于溫室條件下分化培養(yǎng)；分化培養(yǎng)基為加入6-BA 1.0mg/L、NAA 0.1mg/L、Kan 100mg/L、頭孢霉素500mg/L的MS培養(yǎng)基，每2~3周將其轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中，切口處逐漸長出愈傷組織，最后分化出芽；
d、將長至3~5cm的芽切下，轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，生根后的轉(zhuǎn)基因植株由生根培養(yǎng)基中取出，用自來水洗凈培養(yǎng)基，移植于滅菌的營養(yǎng)土中；
e、轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)NPTII基因特異引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，鑒定轉(zhuǎn)基因陽性植株。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的煙草腋芽生長調(diào)控基因NtIPT1的應(yīng)用，其特征在于C步驟b中所述的0.1%的HgCl2溶液配制方法為稱取升汞0.1克，用少許酒精溶解，再加水定容至100毫升。