專利名稱：一種煙草表皮毛發(fā)育相關(guān)基因NtTTG2及其重組表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種煙草表皮毛發(fā)育相關(guān)基因NtTTG2及其重組表達(dá)載體和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在植物體表面的表皮毛在不同種類的植物上表現(xiàn)出不同的形態(tài)特征。一般來說， 表皮毛是由表皮細(xì)胞分化出的毛狀單細(xì)胞或者多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可以作為植物最外層的天然屏障，有著不可替代的保護(hù)功能，如可以減弱植物在紫外線、干旱、輻射和毒性物質(zhì)等非生物脅迫下所受到的傷害[1]。另外，植物表皮毛在植物抗擊蟲害和抵御病原物侵染過程中也起著非常重要的作用。在植物中，表皮毛發(fā)育的控制是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過程。有許多證據(jù)顯示，表皮毛的起始和發(fā)育是受正向調(diào)控因子和負(fù)向調(diào)控因子調(diào)控的。目前，對于擬南芥的表皮毛發(fā)育模型已經(jīng)研究的比較透徹，這也成為了研究植物細(xì)胞分化分子基礎(chǔ)的最好的模型之一。擬南芥的表皮毛是無腺體的單細(xì)胞表皮毛，一般有3個(gè)分支，在整個(gè)植株中均有分布。它的發(fā)育是一個(gè)由時(shí)空控制的過程，已經(jīng)分離到的表皮毛突變體70多個(gè)，可歸以下幾種類型無表皮毛型、表皮毛簇生型、表皮毛減少型、表皮毛扭曲型和玻璃狀表皮毛型， 涉及二十多個(gè)基因的參與 。為了闡釋表皮毛發(fā)育起始的控制機(jī)制，克隆調(diào)控基因和研究這些調(diào)控基因的功能是非常必要的。目前認(rèn)為，在這些基因中，有三個(gè)最為重要，分別是編碼myb的GL1，編碼bHLH的GL3和編碼WD-40的TTG1，這三個(gè)基因表達(dá)的產(chǎn)物在矮牽牛中形成三元復(fù)合體，控制著花青苷的生物合成 ]。在擬南芥中，GLl (GLABR0US1)和 TTGl (TRANSPARENTTESTA GLABRA 1)兩個(gè)基因發(fā)生功能缺失的突變體，葉片的表皮毛完全消失。GL3(GLABROUS;3)基因突變的突變體數(shù)量和表皮毛的分支明顯減少或消失。表皮毛包括分泌型和非分泌型兩種，是由表皮細(xì)胞層分化出來的單細(xì)胞或多細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。分泌型表皮毛具有腺體，可以分泌多種化合物，如多糖、機(jī)酸、萜烯類或者鹽等。擬南芥的表皮毛是非分泌型的單細(xì)胞表皮毛，是表皮細(xì)胞分化成的三叉結(jié)構(gòu)，一般認(rèn)為起物理防衛(wèi)的功能，表皮毛密度的增加可以減少被天敵選擇的幾率M。這種以表皮毛作為物理屏障的功能是一種直接的抗蟲機(jī)制，可以避免植食性昆蟲的傷害。另外，有些植物的表皮毛可以分泌化學(xué)物質(zhì)來抵御外敵侵害，如分泌與防衛(wèi)相關(guān)的酶類等等。煙草(Nicotiana repanda)表皮毛中含有去甲基尼古丁，這種生物堿可以抗擊植食性昆蟲，比尼古丁毒性更大。研究表明，去甲基尼古丁的產(chǎn)生是受茉莉酸甲酯或傷誘導(dǎo)的，而且被誘導(dǎo)后積累非常迅速，在抗蟲中具有重要作用。表皮毛的分泌物含有大量的對天敵具有毒性或防御作用的物質(zhì)，可以占到葉片干重的17% [5]0 Wagner等2004年實(shí)驗(yàn)證明，煙草表皮毛的分泌物在抗擊蚜蟲傷害起著重要的作用。表皮毛的分泌物可以流到葉片的表皮細(xì)胞上，當(dāng)蚜蟲爬過時(shí)，這些分泌物就會粘附于蚜蟲身體上，從而被蚜蟲帶到植物的其他部位，啟動(dòng)其他部位的抗蟲防衛(wèi)反應(yīng)。
以往研究證明，擬南芥表皮毛有利于真菌孢子和菌絲的吸附，無毛突變體gll 增強(qiáng)了對真菌侵染耐受能力。但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，表皮毛中可以高水平表達(dá)α-1， 3-glucanase，具有這種特性的表皮毛可以明顯提高對真菌侵染的抗性。這種特性是不依賴于水楊酸或者茉莉酸防衛(wèi)信號通路，只依賴于表皮毛內(nèi)表達(dá)的α -l，3-glUCanaSe[6]。表皮毛在減輕植株對重金屬的毒害也有重要作用。如擬南芥葉片表皮毛中可以積累十倍于表皮細(xì)胞的有毒金屬量，還檢測到高水平的谷胱甘肽的生物合成，表皮毛這種充當(dāng)毒性分子存儲庫的功能可以降低植物中的養(yǎng)分值，從而防止植食性動(dòng)物的襲擊[7]。另外，植物的表皮毛具有較高的反射率，能夠有效的反射大量的紫外線，減少紫外線直接照射與表皮細(xì)胞上，減輕植物所受的UV-B輻射破壞。總之，在植物的發(fā)育和防衛(wèi)中，表皮毛起著非常重要的作用，而模式植物擬南芥表皮毛的發(fā)育調(diào)控機(jī)制的解析也帶動(dòng)了許多其他植物如煙草表皮毛的相關(guān)研究。這些研究將能更好的闡明表皮毛發(fā)育機(jī)制以及為抗病、高產(chǎn)基因工程育種提供優(yōu)秀的基因資源。參考文獻(xiàn)[l]Traw Μ. B and Feeny P (2008). Glucosinolates and trichomes track tissue value in two sympatric mustards. Ecology 89 :763-772.[2]Kirik V, Simon M, Huelskamp M, Schiefelbein J(2004). The ENHANCER OF TRY AND CPC lgene acts redundantly with TRIPTYCH0N and CAPRICE in trichome and root hair cell patterning in Arabidopsis. Dev. Biol. 268 :506-513.[3]Walker A. R,Davison P. A,Bolognesi-ffinfield A. C, James C. M,Srinivasan N, Blundell T. L, Esch J. J, David Marks M，Gray J. C(1999). The TRANSPARENT TESTA GLABRAllocus, which regulates trichome differentiation and anthocyanin biosynthesis in Arabidopsis, encodes a WD40repeat protein. Plant Cell 11 1337-1349.[4]Agrawal A. A and Fishbein M(2006). Plant defense syndromes. Ecology 87 :S132-S149.[5] Ambrosio S. R, Oki Y, Heleno V. C, Chaves J. S, Nascimento P. G, Lichston J. E, Constantino M. G, Varanda Ε. M, Da Costa F B (2008). Constituents of glandular trichomes of Tithonia diversifolia !relationships to herbivory and antifeedant activity. Phytochemistry. 69 :2052-2060.[6]Calo L, Garcia I, Gotor C, Romero L. C(2006). Leaf hairs influence phytopathogenic fungus infection and confer an increased resistance when expressing a Trichoderma a~l,3-glucanase. J. Experimental Botany. 57 :3911-3920.[7]Davidian J. C, Grill D, De Kok L. J, Stulen I，Hawkesford M. J, Schnug E, Rennenberg H(2003) · Sulfur transport and assimilation in plants !regulation, interaction, signaling. Leiden :Backhuys Publishers,pp :91-99.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種煙草表皮毛發(fā)育相關(guān)基因NtTTG2。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種含有NtTTG2基因的重組表達(dá)載體。
本發(fā)明的又一目的是提供該基因的應(yīng)用。一種含WD-40結(jié)構(gòu)域的基因NtTTG2，該基因來源于普通煙草(Nicotiana tabacum)，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的。所述的含WD-40結(jié)構(gòu)域的煙草表皮毛發(fā)育相關(guān)基因NtTTG2編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示的。一種重組表達(dá)載體，包括所述的煙草表皮毛發(fā)育相關(guān)基因NtTTG2和植物表達(dá)載體。所述的植物表達(dá)載體選自PBI121，PBI221或pCAMBIA1301中的一種。所述的植物表達(dá)載體選自pCAMBIA1301。所述的重組表達(dá)載體是通過將基因NtTTG2插入到載體pCAMBIA1301酶切位點(diǎn)Sac I/KpnI 間得到的載體 pCAMBIA1301: :NtTTG2。所述的重組表達(dá)載體是通過將基因NtTTG2插入到載體pCAMBIA1301酶切位點(diǎn) Sac I/Kpnl間，并通過BamH I/Xba I酶切位點(diǎn)在NtTTG2后插入RFP基因得到的雙元載體 PCAMBIA1301::NtTTG2-RFP。一種轉(zhuǎn)化體，由所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞所得，所述的宿主細(xì)胞優(yōu)選大腸桿菌細(xì)胞或農(nóng)桿菌細(xì)胞。所述的煙草表皮毛發(fā)育相關(guān)基因NtTTG2在導(dǎo)入植物獲得促進(jìn)生長和/或增加產(chǎn)量的品種中的應(yīng)用，優(yōu)選導(dǎo)入煙草或小麥獲得促進(jìn)生長和/或增加產(chǎn)量的品種中的應(yīng)用。所述的含煙草表皮毛發(fā)育相關(guān)基因NtTTG2的重組表達(dá)載體在導(dǎo)入植物獲得促進(jìn)生長和/或增加產(chǎn)量的品種中的應(yīng)用，優(yōu)選導(dǎo)入煙草或小麥獲得促進(jìn)生長和/或增加產(chǎn)量的品種中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明提供了一種新的煙草表皮毛發(fā)育相關(guān)基因NtTTG2，該基因來源于普通煙草，含WD-40結(jié)構(gòu)域，具有促進(jìn)植物生長發(fā)育及種子飽滿、種子數(shù)量的功能。利用該基因構(gòu)建的重組表達(dá)載體，過量表達(dá)NtTTG2基因，將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化煙草，所獲得的 NtTTG2過表達(dá)植株明顯表現(xiàn)為促進(jìn)生長及增加產(chǎn)量。


圖 lpCAMBIA1301: :NtTTG23-UTK-intron-NtTTG23-υτκ 和 pCAMBIA1301: :NtTTG2_RFP 載體圖譜。圖 2pCAMBIA1301 :NtTTG2_RFP 載體酶切驗(yàn)證圖，A. pCAMBIAl301 NtTTG2載體酶切驗(yàn)證圖。M為Marker，泳道1為載體酶切驗(yàn)證圖， 用SacI和KpnI進(jìn)行酶切；B. pCAMBIA1301 :NtTTG2-RFP載體酶切驗(yàn)證圖。M為Marker，泳道1為用Mc I和KpnI進(jìn)行酶切，泳道2為用BamH I和)(ba I進(jìn)行酶切，泳道3為用Sac I和Xba I進(jìn)行酶切。圖3潮霉素抗性平板篩選，A為非轉(zhuǎn)基因煙草，B和C為轉(zhuǎn)基因煙草種子。圖 4pCAMBIA1301: :NtTTG2-intron-NtTTG2 轉(zhuǎn)基因煙草基因表達(dá)檢測，A. Northern雜交檢測NtTTG2基因表達(dá)量，其中TCNC為野生型，TTG2iNCl，2，3為不同轉(zhuǎn)基因株系；B.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測NtTTG2基因表達(dá)量，其中TCNC為野生型， TTG2iNCl，2，3為不同轉(zhuǎn)基因株系。圖5pCAMBIA1301: :NtTTG2-RFP轉(zhuǎn)基因煙草基因表達(dá)檢測，A. Northern雜交檢測NtTTG2基因表達(dá)量，其中TCNC為野生型，T0TNC1，2，3為不同轉(zhuǎn)基因株系；B.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測NtTTG2基因表達(dá)量，其中TCNC為野生型，TOTNC 1，2，3分別為不同轉(zhuǎn)基因株系。圖 6pCAMBIA1301: :NtTTG23 UTK-intron-NtTTG23 UTK(沉默植株)生長產(chǎn)量表型， A.野生型(TCNC)和沉默植株(TTG2iNC4)煙草在花盆中生長45天和115天表型；B.野生型(TCNC)和沉默植株(TTG2iNC4)煙草在種植10、20、30、40和50天后生長高度測定；C.野生型(TCNC)和沉默植株(TTG2iNC4)煙草在種植10、20、30、40和50天后鮮重測定。圖7pCAMBIA1301: :NtTTG2-RFP (過表達(dá)植株)生長表型，A.野生型(TCNC)和過表達(dá)植株(T0TNC1，2，3)在生長45天后表型；B.野生型(TCNC)和過表達(dá)植株(T0TNC1,2, 3)花及角果表型；C.野生型(TCNC)和沉默植株(T0TNC1，2，3)煙草在種植10、20、30、40和 50天后鮮重測定；D.野生型(TCNC)和沉默植株(T0TNC1，2，;3)煙草角果內(nèi)種子數(shù)統(tǒng)計(jì)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1. NtTTG2基因的克隆與序列結(jié)構(gòu)分析煙草(Nicotiana tabacum)品種NC89的種子直接播于裝有營養(yǎng)土的直徑為15cm 的花盆中，溫室O3-27°C、10h光照/14h黑暗)培養(yǎng)，40日齡植株用于RNA的提取。總RNA提取以普通煙草為材料，總RNA的抽提采用Trizol試劑(Invitrogen， USA)按照說明操作，用分光度計(jì)檢測其RNA含量和質(zhì)量。反轉(zhuǎn)錄生成第一鏈取2μ g RNA作模板，根據(jù)!Iomega公司M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶配套試劑使用說明，分別加入下游引物0. 5 μ g，定容至15μ L，70°C變性5min，立即在冰上放置 5min。然后分別加入 M-MLV 5 X buffer 5 μ L，dNTP (25mM) 5 μ 1，rRNasin Ribonuclease Inhibitor 25U,M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 200U，DEPC 水補(bǔ)足 25rtL。42°C溫育 lh，95°C 5min 滅活反轉(zhuǎn)錄酶。經(jīng)過優(yōu)化后，取適量的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于隨后的PCR。以cDNA第一鏈作為RT-PCR模板，常規(guī)方法做PCR，擴(kuò)增NtTTG2基因PCR擴(kuò)增引物序列上游引物SEQID NO. 3(5，-ACACACATAATTTCCCTTCCATTTCC-3，)下游引物SEQID Ν0· 4(5，-AGAGACCATATAAACACAGTGCCCT-3，)，25μ L 反應(yīng)體系為10XEx taq buffer 2. 5 μ L, dNTP 2. 0 μ L，Mg2+L 5 μ L，上、下游引物各 1 μ L, Ex taq 0. 2 μ L，模板 1 μ L，ddH20 15. 8 μ L。反應(yīng)程序如下為 95°C 5min， 95°C 50sec，58°C 50sec，72°C lmin,72°C IOmin0 PCR 產(chǎn)物 NtTTG2 基因經(jīng)純化回收后，連接到 pMD 19-T Simple Vector 載體(Takara，Japan)上得到 pMD 19-T Simple: :NtTTG2 質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，送上海invitrogen公司測序，序列如SEQ ID N0. 1。實(shí)施例2.雙元載體 pCAMBIA1301 NtTTG23-UTE-intron-NtTTG23-UTE 的構(gòu)建根據(jù)NtTTG2基因3、不翻譯區(qū)序列(3—UTR)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增其編碼區(qū)部分片段 337bp，用于NtTTG2基因沉默載體的構(gòu)建。上游引物SEQID N0. 5(5' -TGTAGCGGAGTTGGAAAGGCATCAGG-3 ‘)
下游引物SEQID NO. 6(5，-TCCCACCGCTGAGCAAAAGACATAC-3，)，以 pMD 19-T Simple :NtTTG2 質(zhì)粒為模板，利用 SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 進(jìn)行PCR擴(kuò)增長度為337bp的部分NtTTG23 UTK基因序列，條件如下95°C預(yù)變性5min ；95°C變性45sec、58°C復(fù)性30sec、72°C延伸30sec, 30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min。PCR產(chǎn)物用1 % 的瓊脂糖膠電泳，溴化乙錠(EB)染色，用Agarose Gel DNA Purification Kit(TaKaRa)對電泳條帶進(jìn)行回收。將通過PCR方法獲得的337bp部分NtTTG23 UTK基因序列，用T4連接酶連接至pUCm-T載體上得到pUCm-T NtTTG23、■載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α。涂LB (含Amp 100 μ g/mL)平板，37°C培養(yǎng)16_20h后挑取若干克隆提取質(zhì)粒，BamH I和I^st I雙酶切驗(yàn)證后送公司測序。測序驗(yàn)證正確后，用I3St I/BamH I和I^st I/Xho I兩種不同的雙酶切方式分別切pUCm-T: :NtTTG23 UTK載體，酶切得到兩端具有不同酶切位點(diǎn)的兩種NtTTG23 UTK基因片段 NtTTG23 UTK(Pst I/BamH I)和 NtTTG23 UTK(Pst I/Xho I)，以進(jìn)行下一步操作。利用存在于pBSSK-in載體(Invitrogen，上海)中的內(nèi)含子構(gòu)建發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該內(nèi) ^TX^i 600bp, g T Phaseolus vulgaris nitrite reductase (NIR)(JftiHT^ 花)，利用該內(nèi)含子兩側(cè)的多克隆位點(diǎn)將已獲得的NtTTG23 UTK基因片段反向重復(fù)地連在內(nèi)含子兩側(cè)。具體步驟如下將NtTTG23 UTK(Pst I/BamH I)連入用BamH I與I^st I雙酶切的 pBSSK-in ；該產(chǎn)物再用Nsi I與Xho I (或Sal I)雙酶切，然后將NtTTG23 UTE(Pst I和Xho I)連接其上(Pst I和Nsi I是同尾酶，可發(fā)生連接，但連接后無法切開)，即構(gòu)成RNAi載體。最后用Me I/Kpn I 將整個(gè) RNAi 片段切下，得到 NtTTG23 UTK-intron-NtTTG23 UTK(S ac I/Kpn I)，連入穿梭載體pCAMBIA1301的組成型表達(dá)啟動(dòng)子35S之后的&ic I和Kpn I 酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)成轉(zhuǎn)化單元 PCAMBIA1301: :NtTTG23 UTK-intron-NtTTG23 UTK(圖 1)。將 pCA MBIAl3Ol NtTTG23-UTE-intron-NtTTG23-UTE 轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌 EHAlO5 (Invitrogen,上海)中，為
轉(zhuǎn)基因奠定基礎(chǔ)。實(shí)施例3.雙元載體 pCAMBIA1301 :NtTTG2_RFP 的構(gòu)建提取煙草總RNA，利用RT-PCR反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用上游引物SEQ ID NO. 7 (5，-GAGCTCATGGAAAATTCAAGTCAAGAAT-3，)，下游引物SEQ ID NO. 8(5，-GGTACCTACTTTAA GCAGTTGCAACTTGT-3，)，以煙草 cDNA 為模板，擴(kuò)增 NtTTG2，在 NtTTG2 兩端引入 Sac I/Kpn I酶切位點(diǎn)，將擴(kuò)增得到的NtTTG2基因連接到pMD 19-T SimpleVector載體(Takara, Japan)上轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α中，測序正確后，用Me Ι/Κρη I對連接有NtTTG2基因的 pMD 19-T Simple Vector載體進(jìn)行雙酶切，得到測序正確的NtTTG2片段，然后將載體 PCAMBIA1301 (購自 CAMBIA 公司)也用 Sac I/Kpn I 酶切，將 NtTTG2 片段與 pCAMBIA1301 線性載體連接，NtTTG2被插入pCAMBIA1301載體中花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子下游得到 PCAMBIA1301: :NtTTG2 載體。同樣原理，用 BamH I/Xba I 將 pBIlM (Invitrogen，上海)上的RFP (紅色熒光蛋白)切下，插入到用同樣的酶切pCAMBIA1301 :NtTTG2載體下游的BamH I/Xba I酶切位點(diǎn)間，得到雙元載體pCAMBIA1301 :NtTTG2-RFP,并進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果見圖 2。將pCAMBIA1301: :NtTTG2-RFP轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌EHA105anvitrogen，上海)中，為轉(zhuǎn)基因奠定基石出。實(shí)施例4.葉盤法轉(zhuǎn)化煙草及其抗性篩選
具體步驟簡述如下1農(nóng)桿菌培養(yǎng)1)分別從平板上挑取轉(zhuǎn)染 pCAMBIA1301: :NtTTG23 UTK-intron-NtTTG23、■載體 (NtTTG2基因沉默載體)的農(nóng)桿菌EHA105單菌落以及含有pCAMBIA1301 :NtTTG2_RFP載體(NtTTG2基因過表達(dá)載體)的農(nóng)桿菌EHA105單菌落，分別接種到3mL YEB液體培養(yǎng)基中 (Str 25 μ g/mL、Rif50 μ g/mL、Kan 80 μ g/mL)于恒溫?fù)u床上 27°C，180rpm 搖培過夜至 OD 600 為 0. 6-0. 8。2)搖培過夜的菌液按1 100的比例，轉(zhuǎn)入新配置的含上述抗生素的YEB培養(yǎng)基中，在與上述相同的條件下培養(yǎng)Mi左右，0D600為0. 2-0. 5時(shí)即可用于轉(zhuǎn)化。2侵染于超凈工作臺上，將菌液倒入無菌的小培養(yǎng)皿中。取不具潮霉素(Hm)抗性的煙草無菌苗的幼嫩、健壯葉片，去主脈，將葉片剪成0. 5cmX0. 5cm的小塊，放入菌液中， 浸泡適當(dāng)時(shí)間(一般5-lOmin)。取出葉片置于無菌濾紙上吸去附著的菌液。<注 > 同時(shí)設(shè)未經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的葉盤作為陰性對照，以下步驟同。3共培養(yǎng)將侵染后的煙草葉片接種在不含任何激素和抗生素的MS基本培養(yǎng)基上，用封口膜封好培養(yǎng)皿，28°C黑暗中培養(yǎng)2-4d。4選擇培養(yǎng)將黑暗中共培養(yǎng)2-4d的煙草葉片轉(zhuǎn)移到帶抗性的分化培養(yǎng)基 (MS+1 μ g/mL 6-芐氨基嘌呤+50 μ g/mL潮霉素+500 μ g/mL羧芐青霉素)中，用封口膜封好培養(yǎng)皿，在光照為2，000-10, 0001uX、25j8°C、16/ i光照/光暗條件下選擇培養(yǎng)，結(jié)果見圖 3。5生根培養(yǎng)約2-3周后，待不定芽長到Icm左右時(shí)，切下不定芽并轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基(1/2MS+200 μ g/L ΙΑΑ+50 μ g/mL潮霉素+500 μ g/mL羧芐青霉素)上進(jìn)行生根培養(yǎng)， 5-10d后長出不定根。根長好后，移入盆缽中培養(yǎng)。待煙草種子成熟后進(jìn)行單株收種(Tl代，具有RR，Rr，rr型)，T1代種子繼續(xù)在Hm 抗性平板上篩選，根據(jù)孟德爾遺傳第一定律統(tǒng)計(jì)分析，將篩選獲得T2代純合品系，分別得到轉(zhuǎn)入 pCAMBIA1301: :NtTTG23~UTR-intron-NtTTG23~UTR 的 NtTTG2 基因沉默植株純合品系以及轉(zhuǎn)入pCAMBIA1301: :NtTTG2-RFP的NtTTG2基因過表達(dá)植株純合品系。實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因煙草中NtTTG2基因表達(dá)檢測l.Northern 雜交，方法參考 Wu et al. 2007 :ffu X,ffu Τ, Long J, Yin Q, Zhang Y, Chen L,Liu R, Gao T and Dong H(2007). Productivity and biochemical properties of green tea in response to full-length and functional fragments of HpaG Xooc, a harpin protein from the bacterial rice leaf streak pathogen Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola. J. Biosci. 32 :1119-1131.)1. IRNA甲醛凝膠變性電泳分別提取并純化pCAMBIA1301 :NtTTG2-intron_NtTTG2轉(zhuǎn)基因煙草以及 PCAMBIA1301: :NtTTG2-RFP轉(zhuǎn)基因煙草的RNA。去純化的RNA樣品進(jìn)行甲醛變性電泳。 首先用0. lmol/L NaOH浸泡電泳槽及梳子5min，然后用0. 1 % DEPC水仔細(xì)沖洗；在滅菌印pendorf管中建立變性反應(yīng)；然后，55 °C水浴60min，冰水中放置IOmin，離心；加入2 μ 110 X甲醛凝膠加樣緩沖液并將印pendorf管重新放置于冰上；制備1 OOmL含有 2. 2mol/L甲醛的1.5%瓊脂糖凝膠。加1. 5g瓊脂糖到72mL滅菌水中，加熱溶解瓊脂糖，在冷卻至55°C的溶液中同時(shí)加入IOmL 10XMOPS電泳緩沖液和18mL去離子甲醛，并在通風(fēng)櫥內(nèi)灌制凝膠(0. 5%的凝膠可以用來分離0. 5-8Kb的RNA，若要分離更大的RNA，則使用 1. 0% -1. 2%的瓊脂糖凝膠)；將瓊脂糖/甲醛凝膠裝入水平電泳槽中，加入足夠1XM0PS 電泳緩沖液覆蓋凝膠約1mm，預(yù)電泳5min(5V/Cm)；凝膠浸入1XM0PS電泳緩沖液中，4-5V/ cm電壓下進(jìn)行電泳，直到溴酚藍(lán)移出約8cm(電泳過程中，由于電泳緩沖液的pH值會發(fā)生變化，導(dǎo)致在較高電壓下，條帶會模糊不清。電泳過程中可以使用蠕動(dòng)泵將兩極緩沖液循環(huán)， 每電泳Ih換一次緩沖液。)；電泳結(jié)束后將膠塊置于凝膠成相系統(tǒng)中，觀察RNA的完整性， 記錄18S、28S條帶離加樣孔的距離，并在DEPC水中沖洗。
權(quán)利要求
1.一種含WD-40結(jié)構(gòu)域的煙草表皮毛發(fā)育相關(guān)基因NtTTG2，其特征在于該基因來源于普通煙草(Nicotiana tabacum)，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的。
2.權(quán)利要求1所述的含WD-40結(jié)構(gòu)域的煙草表皮毛發(fā)育相關(guān)基因NtTTG2編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示的。
3.一種重組表達(dá)載體，其特征在于包括權(quán)利要求1所述的基因NtTTG2和植物表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述的植物表達(dá)載體選自 PBI121, PBI221 或 pCAMBIA1301 中的一種，優(yōu)選 pCAMBIA1301。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述的重組表達(dá)載體的啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子，優(yōu)選花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子。。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述的重組表達(dá)載體是通過將NtTTG2基因插入到載體pCAMBIA1301酶切位點(diǎn)Mc I/Kpn I間得到的載體 PCAMBIA1301::NtTTG20
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述的重組表達(dá)載體是通過將 NtTTG2基因插入到載體pCAMBIA1301酶切位點(diǎn)Me I/Kpn I間，并通過BamH I Xba I酶切位點(diǎn)在NtTTG2后插入RFP基因得到的雙元載體pCAMBIA1301 :NtTTG2_RFP。
8.一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于由權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞所得，所述的宿主細(xì)胞優(yōu)選大腸桿菌細(xì)胞或農(nóng)桿菌細(xì)胞。
9.權(quán)利要求1所述的煙草表皮毛發(fā)育相關(guān)基因NtTTG2在導(dǎo)入植物獲得促進(jìn)生長和/ 或增加產(chǎn)量的品種中的應(yīng)用，優(yōu)選導(dǎo)入煙草或小麥獲得促進(jìn)生長和/或增加產(chǎn)量的品種中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體在導(dǎo)入植物獲得促進(jìn)生長和/或增加產(chǎn)量的品種中的應(yīng)用，優(yōu)選導(dǎo)入煙草或小麥獲得促進(jìn)生長和/或增加產(chǎn)量的品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種煙草表皮毛發(fā)育相關(guān)基因NtTTG2及其重組表達(dá)載體和應(yīng)用。該基因來源于普通煙草，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其編碼的產(chǎn)物氨基酸序列為SEQ ID NO.2。本發(fā)明還提供一種重組表達(dá)載體，包括本發(fā)明所述的基因NtTTG2。該基因在促進(jìn)植物生長發(fā)育及種子飽滿、種子數(shù)量方面有重要作用，是一種理想促生及增加產(chǎn)量的基因，可在導(dǎo)入植物獲得促進(jìn)生長和/或增加產(chǎn)量的品種中應(yīng)用，優(yōu)選導(dǎo)入煙草或小麥獲得促進(jìn)生長和/或增加產(chǎn)量的品種中應(yīng)用。
文檔編號C12N15/82GK102304522SQ20111026467
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月8日
發(fā)明者崔潤芝, 徐衡, 李寶燕, 董漢松, 蔡洪生 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)