專利名稱：蘋果酸酶突變體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于代謝工程和酶的定向進(jìn)化領(lǐng)域，具體涉及一種蘋果酸酶突變體及其應(yīng)用，即利用代謝工程改造的重組大腸桿菌定向進(jìn)化蘋果酸酶，并將獲得的定向進(jìn)化蘋果酸酶用于提高大腸桿菌琥珀酸的產(chǎn)量。
背景技術(shù)：
蘋果酸酶催化可逆反應(yīng)丙酮酸+NADH+ CO2 ^蘋果酸+NAD+，
蘋果酸酶在中央代謝途徑的三碳(O)和四碳(C4)化合物的相互轉(zhuǎn)換過程中扮演著重要的角色，是固定(X)2的C4回補(bǔ)途徑的重要一員。與其它二氧化碳固定C4回補(bǔ)途徑相比，蘋果酸酶催化的反應(yīng)途徑具有明顯的能量經(jīng)濟(jì)性，對研究生命碳循環(huán)、發(fā)展碳負(fù)性工業(yè)過程有著重要的意義。微生物的固碳C4回補(bǔ)途徑，主要包括由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(P印C)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PepCK)、丙酮酸羧化酶(Pyc)、和蘋果酸酶(Mae)等催化的四條途徑。 蘋果酸酶Mae催化丙酮酸羧化固定(X)2實(shí)現(xiàn)C4回補(bǔ)，從磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)開始計(jì)算可以凈產(chǎn)生一個(gè)ATP，最大限度的回收了能量供細(xì)胞使用，因此具有能量經(jīng)濟(jì)性。同時(shí)，該反應(yīng)不與大腸桿菌中主要的糖運(yùn)輸途徑PTS系統(tǒng)競爭PEP (其底物之一是丙酮酸)，因此該反應(yīng)具有明顯的代謝循環(huán)優(yōu)勢。而其它幾個(gè)C4回補(bǔ)酶都有各自的不足磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化磷酸烯醇式丙酮酸和HCO3-反應(yīng)生成草酰乙酸和磷酸，沒有ATP的產(chǎn)生；磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶催化PEP羧化生成草酰乙酸并凈產(chǎn)生一個(gè)ATP，但是，該反應(yīng)依賴于高濃度的PEP，與主要葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)PTS系統(tǒng)消耗PEP相矛盾；丙酮酸羧化酶催化丙酮酸羧化生成草酰乙酸，并消耗一個(gè)ATP，從PEP開始計(jì)算相當(dāng)于沒有凈能量的產(chǎn)生，且該酶在大腸桿菌等一些微生物中不存在。因此，如何提高發(fā)酵菌中蘋果酸酶Mae的含量或效率就成為研究的一個(gè)重要方面。例如，Stols L等利用pTRC99a質(zhì)粒載體在一個(gè)大腸桿菌突變株中過表達(dá)MaeA，通過色譜柱純化了該酶，并且分別在Mn2+和Mg2+存在下測定了其對丙酮酸和蘋果酸的Km值， 發(fā)現(xiàn)Mn2+是更好的激活金屬離子。ImM的Mn2+存在下，該酶對丙酮酸的Km值為16mM，而對蘋果酸的Km值為0. ^mM(Stols and Donnelly 1997)。Jinxia Wang等也表達(dá)純化了大腸桿菌的MaeA，在最適pH7. 2條件下測定了蘋果酸和NAD+的Km值，分別為0. 42mM和0. 097mM, 并且發(fā)現(xiàn)高濃度的底物蘋果酸和NAD+都對脫羧反應(yīng)酶活具有抑制作用(Wang，Tan et al. 2007)。i^derico P. Bologna等研究大腸桿菌的MaeA時(shí)發(fā)現(xiàn)其催化脫羧反應(yīng)的效率約是羧化反應(yīng)的30倍，而且發(fā)現(xiàn)脫羧反應(yīng)的最適pH為7. 5，而羧化反應(yīng)的最適pH為7. 0，該酶對蘋果酸和丙酮酸的Km值分別為0. 66mM和2. 59mM(Bologna，Andreo et al. 2007)。盡管酶的動力學(xué)研究表明在生理?xiàng)l件下蘋果酸酶傾向催化蘋果酸脫羧反應(yīng)；但羧化反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)自由能變化為-2kCal/mol，所以熱力學(xué)應(yīng)該更有利于羧化反應(yīng)的進(jìn)行。已有研究表明在生物體內(nèi)蘋果酸酶可以催化丙酮酸羧化反應(yīng)，參與C4回補(bǔ)途徑。Stols等人報(bào)道在丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脫氫酶雙突變的大腸桿菌NZmil菌株中過表達(dá)大腸桿菌NAD依賴的蘋果酸酶，解決了原菌株在厭氧條件下丙酮酸過量積累造成的細(xì)胞毒性問題。 ^lle等人在丙酮酸羧化酶缺陷的釀酒酵母中過表達(dá)大腸桿菌NAD依賴的蘋果酸酶，獲得了更高ATP產(chǎn)量的葡萄糖厭氧發(fā)酵菌株，證實(shí)了蘋果酸酶催化的逆反應(yīng)替代丙酮酸羧化酶發(fā)揮C4回補(bǔ)功能和有助于ATP積累的優(yōu)勢(Zelle，Harrison et al. 2011)?，F(xiàn)有的研究表明大腸桿菌NAD依賴的蘋果酸酶可以發(fā)揮C4回補(bǔ)功能。因此，改造蘋果酸酶的催化性能， 強(qiáng)化蘋果酸酶的表達(dá)，將之應(yīng)用于代謝工程改造微生物，可望構(gòu)建出具有高效C4回補(bǔ)途徑的工程菌株。發(fā)明目的本發(fā)明的目的在提供一種蘋果酸酶突變體及其應(yīng)用，即通過進(jìn)化方法快速并高通量的定向進(jìn)化蘋果酸酶，增加進(jìn)化機(jī)率并應(yīng)用于琥珀酸等的生產(chǎn)。本發(fā)明的一個(gè)蘋果酸酶突變體，其蛋白序列為SEQ ID NO :1，具體就是69位氨基酸密碼子由原來的ACC變成了 AGC，氨基酸由Thr變成了 kr。本發(fā)明還包括編碼序列為SEQ ID NO 1的蘋果酸酶突變體的基因核苷酸，所述的基因序列的密碼子為大腸桿菌的優(yōu)勢密碼子。本發(fā)明還包括攜帶有編碼序列為SEQ ID NO 1的蘋果酸酶突變體基因的質(zhì)粒，例如 PSLS16。上述的基因，其序列為SEQ ID NO :2。本發(fā)明的另一個(gè)蘋果酸酶突變體，其序列為SEQ ID NO :3，具體就是181位氨基酸密碼子由GCC變成了 ACC，氨基酸由Ala變成Thr，其質(zhì)粒命名為pSLS17。本發(fā)明還包括編碼序列為SEQ ID NO :3的蘋果酸酶突變體的基因編碼核苷酸序列，所述的基因序列的密碼子為大腸桿菌的優(yōu)勢密碼子。本發(fā)明還包括攜帶有編碼序列為SEQ ID NO :3的蘋果酸酶突變體基因的質(zhì)粒，例如 PSLS17。上述的基因，其序列為SEQ ID NO :4。上述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入產(chǎn)琥珀酸的大腸桿菌中，用于提高琥珀酸的產(chǎn)量。本發(fā)明運(yùn)用代謝進(jìn)化與隨機(jī)突變相結(jié)合的定向進(jìn)化方法篩選出蘋果酸酶突變體， 所篩選出的突變體能有效的提高大腸桿菌琥珀酸的產(chǎn)量，具有較好的經(jīng)濟(jì)應(yīng)用前景。


圖1大腸桿菌C4回補(bǔ)進(jìn)化體系的構(gòu)建圖。圖2本發(fā)明的蘋果酸酶突變體質(zhì)粒構(gòu)建和篩選過程示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施例中涉及到的培養(yǎng)基配方如下LBi音養(yǎng)基(IL) :10g tryptone,5g yeast extract, 5g NaCl0NBS培養(yǎng)基配方如下
權(quán)利要求
1.一種蘋果酸酶突變體，其蛋白序列為SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3。
2.一種核苷酸，其特征在于，該核苷酸用于編碼權(quán)利要求1所述的蘋果酸酶突變體。
3.一種用于表達(dá)權(quán)利要求1所述的蘋果酸酶突變體的質(zhì)粒，其特征在于該質(zhì)粒攜帶有權(quán)利要求2所述的核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的質(zhì)粒，其特征在于該質(zhì)粒所攜帶核苷酸的序列為SEQIDNO :2。
5.如權(quán)利要求3所述的質(zhì)粒，其特征在于該質(zhì)粒所攜帶核苷酸的序列為SEQIDNO :4。
6.一種提高菌株產(chǎn)琥珀酸量的方法，其特征在于是在產(chǎn)琥珀酸的菌株中表達(dá)權(quán)利要求 1所述的蘋果酸酶突變體。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的表達(dá)蘋果酸酶突變體是將權(quán)利要求3 所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入菌株中。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述的菌株其保藏編號為CGMCCN0.5108。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蘋果酸酶突變體及其應(yīng)用，即通過進(jìn)化方法快速定向進(jìn)化蘋果酸酶，增加了進(jìn)化機(jī)率并能夠有效應(yīng)用于琥珀酸等的生產(chǎn)。本發(fā)明篩選出的蘋果酸酶突變體，其蛋白序列為SEQ ID NO1或SEQ ID NO3。所篩選出的酶突變體能有效的提高產(chǎn)琥珀酸的大腸桿菌中琥珀酸的產(chǎn)量，具有很好的經(jīng)濟(jì)應(yīng)用前景。
文檔編號C12R1/19GK102311943SQ20111026479
公開日2012年1月11日 申請日期2011年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月7日
發(fā)明者劉嬌, 孫際賓, 鄭平 申請人:天津工業(yè)生物技術(shù)研究所