專(zhuān)利名稱(chēng)：煙草干旱響應(yīng)基因NtRHF1及其編碼蛋白的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種煙草干旱響應(yīng)基因NtRHFl及其編碼蛋白的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著全球氣候變曖，干旱已成為我國(guó)作物生產(chǎn)中頻繁發(fā)生的自然災(zāi)害。畑草作為中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，在整個(gè)生育期對(duì)水分的要求很高。中國(guó)大部分畑區(qū)處于干早、 半干旱環(huán)境中，而且優(yōu)質(zhì)煙區(qū)多位于丘陵山區(qū)，常因土壌干旱而影響煙株的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)降低，干旱已成為制約我國(guó)煙葉產(chǎn)量與品質(zhì)提高的主要限制因子之一。 因此，加強(qiáng)煙草抗旱基因資源的挖掘和利用，對(duì)于煙草抗旱新品種培育，實(shí)現(xiàn)煙草農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重大意義。自20世紀(jì)80年代以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在干旱對(duì)煙草生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝的影響等方面做了大量研究，取得了ー些重要進(jìn)展。歸納起來(lái)主要有以下幾個(gè)方面第一，干旱對(duì)煙草生理的影響，主要表現(xiàn)在(1)干旱脅迫影響了葉綠素的合成，促進(jìn)了葉綠素的分解，從而影響了葉片的光合效率(Plant Molecular Biology，1979，20 :37-44) ； (2)干旱脅迫導(dǎo)致植株氮素代謝關(guān)鍵酶-硝酸還原酶(NR)的活性降低，而蛋白水解酶活性增強(qiáng)引起脯氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和纈氨酸等大量積累；C3)干旱脅迫導(dǎo)致葉片膜脂過(guò)氧化作用增強(qiáng)，膜透性増加，丙ニ醛(MDA)含量升高，出現(xiàn)電解質(zhì)外滲。抗氧化保護(hù)酶S0D、P0D、CAT等酶活性顯著下降。第二，干旱對(duì)煙草生長(zhǎng)發(fā)育的影響，主要表現(xiàn)在(1)干旱脅迫降低了種子的萌發(fā)和幼苗的成活；(2)抑制了根系的生長(zhǎng)，從而影響了礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收；(3)干旱脅迫導(dǎo)致植株矮小，節(jié)間短，葉片小，易早衰。這些研究較好地闡明了干旱對(duì)煙草生長(zhǎng)、發(fā)育及代謝影響的生理生化基礎(chǔ)，但缺乏對(duì)煙草抗旱分子遺傳機(jī)理的研究。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)研究的深入，抗旱基因的發(fā)掘成為目前作物抗逆遺傳資源與品種改良研究的熱點(diǎn)，越來(lái)越多的抗旱相關(guān)基因相繼被克隆和鑒定。按照抗旱基因的功能，可以把植物抗旱相關(guān)基因分為兩大類(lèi)第一類(lèi)基因?yàn)楣δ芑?，主要在植物抗性中起保護(hù)作用。這ー類(lèi)基因主要包括滲透調(diào)節(jié)基因如海藻糖合成酶基因TPSlJf 氨酸合成酶基因P5CS、甘露醇合成基因mtlD、甜菜堿合成酶級(jí)以?xún)?nèi)BADH、及多按合成基因 Odc等；保護(hù)生物大分子的活性基因如脫水蛋白基因BDW、水通道蛋白基因AQP和晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白LEA等。第二類(lèi)基因?yàn)檎{(diào)節(jié)基因，主要在信號(hào)傳導(dǎo)和逆境基因表達(dá)過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用，主要包括一些轉(zhuǎn)錄因子基因如DREB、MYB、bZIP、WRKY、NAC等。這些基因已在植物基因工程中得到應(yīng)用。泛素化是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯后的重要修飾之一，是蛋白質(zhì)降解的信號(hào)。泛素連接酶E3是泛素化過(guò)程中的關(guān)鍵酶類(lèi)，決定了泛素化修飾的特異性，在植物激素調(diào)控、花發(fā)育和病原菌防衛(wèi)反應(yīng)中起著重要的作用(Plant J,2010,61 :1029-1040 ;J Exp Bot，2007， 58 :221-227)。目前煙草中E3連接酶編碼基因的克隆與功能鑒定的報(bào)道較少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的煙草基因RHFl (RING-H2 Finger 1)及其編碼蛋白的應(yīng)用；煙草干旱響應(yīng)基因NtRHFl，核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示；該基因編碼ー種具有鋅指結(jié)構(gòu)的泛素E3連接酶，過(guò)量表達(dá)能提高植物對(duì)干旱脅迫的抗性，尤其是能夠提高植物的抗旱能力。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明中，干旱處理的煙草幼苗葉片中，所述的泛素E3連接酶編碼基因RHFl被誘導(dǎo)表達(dá)。本發(fā)明所述的蛋白NtRHFl是植物泛素化蛋白降解途徑中的關(guān)鍵酶類(lèi)，所以調(diào)控 NtRHFl的表達(dá)能夠調(diào)節(jié)植物對(duì)干旱的抗性。因此所述的干旱響應(yīng)的基因NtRHFl在植物抗旱領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，其經(jīng)濟(jì)效益潛力巨大。。


圖1 :NtRHFl的PCR產(chǎn)物電泳圖；圖2 煙草幼苗葉片中NtRHFl基因響應(yīng)干旱脅迫的表達(dá)模式柱狀圖；圖3 =NtRHFl基因植物表達(dá)載體構(gòu)建示意圖；圖4 轉(zhuǎn)NtRHFl基因的煙草株系表達(dá)水平柱狀圖；圖5 =NtRHFl基因過(guò)量表達(dá)的煙草植株對(duì)干旱脅迫處理的生長(zhǎng)表型照片；圖6 =NtRHFl基因過(guò)量表達(dá)煙草植株對(duì)干旱脅迫處理的生理指標(biāo)變化的柱狀圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1 材料干旱脅迫處理云畑87種子經(jīng)15%次氯酸鈉消毒后，放于含蒸餾水的培養(yǎng)皿中，在溫度為 M-26°C、濕度為60%、光暗交替周期為1池/1池的光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。待幼苗長(zhǎng)至ニ葉一心(約14天)吋，倒掉蒸餾水，進(jìn)行20% PEG 6000溶液脅迫處理實(shí)驗(yàn)。處理的時(shí)間分別為 1、3、6、12、24小時(shí)；脅迫處理后的煙草作為實(shí)驗(yàn)者，未做脅迫處理的煙草幼苗作為對(duì)照組， 用于RHFl的表達(dá)分析。轉(zhuǎn)基因煙草植株的干旱處理，采用人工控制澆水法。待植株長(zhǎng)至5 片葉(約30天)吋，停止?jié)菜?4天，觀察各株系生長(zhǎng)情況。實(shí)施例2 :RHF1 (RING-H2 Finger 1)基因的克隆1.畑草葉片第一鏈cDNA合成畑草葉片總RNA的分離和純化參照TRIZOL試劑盒(Invitrogen，USA)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將所述的煙草葉片總RNA吸取1-2 μ g于1. 5ml離心管中，按照i^ermentas公司的 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到煙草葉片第一鏈 cDNA。2. NtRHFl 基因的 PCR 擴(kuò)增以所述的第一鏈cDNA為模板，進(jìn)行NtRHFl基因的PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。ホ艮 ig 網(wǎng)立占 http //www. ncbi. nlm. nih. gov/ 巾:]0 胃ま: ·歹[J ホ示 f (Expressed Sequence Tag, EST)信息設(shè)計(jì)煙草的NtRHFl基因的全長(zhǎng)cDNA引物
上游引物5‘ -ATGAGTTTTGTTTTCCGAG-3 ‘；下游引物5'-CTACACCATATCATA AGCATC-3‘。將所述的PCR產(chǎn)物在1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠照相系統(tǒng)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物(如圖 1所示)，獲得822bp長(zhǎng)的片段。3.電泳結(jié)束后，用生エ生物工程上海公司的膠回收試劑盒，按照產(chǎn)品說(shuō)明回收純化所述的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并送至北京華大基因公司測(cè)序，驗(yàn)證其正確性。實(shí)施例3 =NtRHFl基因的表達(dá)分析1.本實(shí)例中利用熒光定量RT-PCR方法來(lái)分析NtRHFl基因在20% PEG 6000脅迫下的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)樣品為實(shí)施例1中所述的實(shí)驗(yàn)者和對(duì)照組中的煙草葉片。每個(gè)樣品中， 按照實(shí)施例2中所述的方法，取5 μ g的總RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈CDNA作為模板。根據(jù)NtRHFl基因全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異引物為上游引物5，-TTGGTGCTCGGTGTCTTCTTTAT-3，；下游引物5，-GTGCCCTCAGTGTTTCGTAATCT-3，。應(yīng)用BioRad iQ5實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物為M4bp。2.每個(gè)樣品分別以上游引物5，-TGGCATCACACTTTCTAAAC-3，和下游引物 5’ -CAACGGAATCTCTCAGCCCT-3’來(lái)擴(kuò)增煙草Actin基因片段作為內(nèi)參基因。3.反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線(xiàn)和融解曲線(xiàn)。將Ct值導(dǎo)入Microsoft Excel 2003中，按照公式2_ΔΔ\計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，并繪制基因表達(dá)差異柱狀圖。計(jì)算
公式為Δ Ct目標(biāo)基因= しT目標(biāo)基因_レTUbiquitinΔ ACt目標(biāo)基因=處理組Δ Ct目標(biāo)基因-對(duì)照組C施—in4. NtRHFl在干旱脅迫下的表達(dá)分析將生長(zhǎng)14天的煙草幼苗移至20% PEG 6000溶液中進(jìn)行1、3、6、12J4小時(shí)的脅迫處理。NtRHFl在干旱脅迫下的表達(dá)模式如圖2所示，在脅迫處理的M小時(shí)內(nèi)，NtRHFl基因在干旱處理后的3小時(shí)表現(xiàn)出明顯的升高，一直持續(xù)到M小時(shí)，仍保持較高的表達(dá)量。這表明NtRHFl受干旱脅迫表現(xiàn)出較強(qiáng)的誘導(dǎo)表達(dá)。實(shí)施例4 =NtRHFl基因轉(zhuǎn)化煙草及轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)1.植物表達(dá)載體的構(gòu)建以實(shí)施例2中構(gòu)建的NtRHFl全長(zhǎng)cDNA片段為模板，用含有EcoRI和BamHI接頭序列的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切、回收后，正向插入植物雙元表達(dá)載體PART27的CaMV 35S啟動(dòng)子之后的EcoRI和BamHI位點(diǎn)之間，得到重組載體 pART27-NtRHFl (圖 3)。引物序列如下上游引物5，-AGTGAATTCATGAGTTTTGTTTTCCGAG-3，；下游引物5，-ACAGGATCCCTACACCATATCATAAGCATC-3，。2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化煙草及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定經(jīng)PCR、質(zhì)粒酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒利用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，經(jīng)菌落 PCR檢測(cè)正確后，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草品種云煙87。具體方法如下(1)農(nóng)桿菌的活化從平板上挑取含有目的基因的單菌落，接種到5mL LB液體培養(yǎng)基中(Rif 100μ g/mL、Specl00y g/mL”8°C，180rpm 搖床震蕩培養(yǎng) 20-24h 至 0D600 達(dá)至Ij0. 6-0. 8。( 轉(zhuǎn)接活化后的菌液按1 50的比例，轉(zhuǎn)入含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中沘で，180rpm搖床震蕩培養(yǎng)4_6h左右，0D600達(dá)到0. 3-0. 5時(shí)可用于轉(zhuǎn)化。(3)侵染于超凈工作臺(tái)中，取無(wú)菌珊西煙苗的幼嫩、健壯葉片，去主脈，將葉片剪成0. 5cm2的小塊，放入菌液中浸泡5-15min。取出葉片置于無(wú)菌濾紙上吸去附著的菌液。(4)共培養(yǎng)將侵染后的煙草葉片鋪放于含有共培養(yǎng)基(MS基本固體培養(yǎng)基+Img/ L6-BA+0. lmg/LNAA)培養(yǎng)皿上，用封ロ膜封好培養(yǎng)皿，28°C黑培養(yǎng)1_2天。(5)選擇分化培養(yǎng)將共培養(yǎng)后的煙草葉片轉(zhuǎn)接到含有選擇分化固體培養(yǎng)基(共培養(yǎng)基+600mg/LCef+100mg/LKm)的平皿上，用封ロ膜封好培養(yǎng)皿，在溫度為25で，光照強(qiáng)度為2000-100001ux，16h/8h光暗條件下選培養(yǎng)。(6)生根培養(yǎng)選擇分化培養(yǎng)約2-3周后，待煙草不定芽長(zhǎng)到l-2cm左右吋，切下不定芽并移到含有生根培養(yǎng)基(MS基本固體培養(yǎng)基+0. 3mg/L NAA+100mg/L Km+600mg/L Cef)的三角瓶里進(jìn)行生根培養(yǎng)。(7)移栽待根生長(zhǎng)至2-3cm。苗高7-lOcm左右吋，移出三角瓶洗去根部培養(yǎng)基， 移栽于花盆中，溫室培養(yǎng)。3.利用生エ生物工程上海公司的植物基因組提取試劑盒，按照產(chǎn)品說(shuō)明提取轉(zhuǎn)基因煙草幼苗的基因組DNA，利用本實(shí)例中所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)ー步檢測(cè)和篩選陽(yáng)性植株，從15株再生植株中檢測(cè)到10株陽(yáng)性植株。4.按照實(shí)例2中所述方法提取野生型植株和10株轉(zhuǎn)NtRHFl基因Ttl代植株的總 RNA，按照實(shí)例3中所述的方法進(jìn)行熒光定量RT-PCR分析，進(jìn)ー步分析不同株系的表達(dá)情況。熒光定量PCR所用的畑草內(nèi)參基因Actin如實(shí)施例3中所述。結(jié)果表明，在10株轉(zhuǎn)NtRHFl基因的Ttl代植株中，有5株表達(dá)量較高，而在野生型對(duì)照中未檢測(cè)到該基因的表達(dá)(圖4)。將分子鑒定陽(yáng)性的植株單株收種子，各單株種子分別播種，用卡那霉素繼續(xù)篩選以觀察Tl代的分離情況，如此重復(fù)直至T3代獲得遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系，共獲得5個(gè)穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系。選擇穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量高的2個(gè)株系(0E-4和OE-の進(jìn)行下一歩的干旱脅迫處理實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例5 轉(zhuǎn)NtRHFl過(guò)量表達(dá)煙草植株對(duì)干旱脅迫的抗性表型鑒定1.實(shí)驗(yàn)方法將野生型(WT)和2個(gè)轉(zhuǎn)基因系(0E-4-和0E_5)煙草種子先經(jīng)4°C 冰箱春化，然后于超凈工作臺(tái)里用15%的次氯酸鈉溶液消毒并用滅蒸水洗浄，均勻播于含營(yíng)養(yǎng)土的小盆中，置于光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。待幼苗長(zhǎng)至5片葉時(shí)(30天)，停止?jié)菜?周，觀察植株生長(zhǎng)情況，并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)共設(shè)三次重復(fù)，毎次重復(fù)所測(cè)試的各株系植株均為 10株。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果煙草植株經(jīng)干旱處理14天后，與對(duì)照相比，NtRHFl轉(zhuǎn)基因畑草生長(zhǎng)基本正常，葉片表現(xiàn)部分萎焉，而野生型植株生長(zhǎng)受到明顯抑制，大部分葉片萎焉，受傷程度較重，植株明顯比轉(zhuǎn)基因的要小(圖幻。表明NtRHFl過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)干旱脅迫表現(xiàn)出較好的抗性。實(shí)施例6 轉(zhuǎn)NtRHFl基因煙草植株對(duì)干旱脅迫處理后的生理指標(biāo)變化1.實(shí)驗(yàn)方法將干旱處理14天后的轉(zhuǎn)NtRHFl煙草株系(0E_4_和0E_5)和野生型(WT)幼苗，每個(gè)株系挑5株，分別稱(chēng)量鮮重，并計(jì)算平均值。對(duì)每個(gè)株系的5株剪取葉片，分別稱(chēng)重后，以未處理的株系葉片的含水量為對(duì)照，計(jì)算葉片相對(duì)含水量。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖6A中顯示經(jīng)干旱處理14天后的轉(zhuǎn)NtRHFl煙草株系(0E_4、0E_5) 和野生型(WT)煙草植株的平均鮮重。從圖中可以看出，處理14天后，轉(zhuǎn)NtRHFl煙草株系 (0E-4、0E-5)比野生型(WT)在生物量上分別提高96%，和125%，表明轉(zhuǎn)NtRHFl基因植株對(duì)干旱脅迫有較高的抗性，生長(zhǎng)影響較小。圖6B中顯示經(jīng)干旱處理14天后的轉(zhuǎn)NtRHFl煙草株系(0E_4、0E_5)和野生型(WT) 煙草植株葉片的相對(duì)含水量的變化。從圖中可以看出轉(zhuǎn)NtRHFl基因的煙草植株葉片含水量降低幅度較小，而野生型植株葉綠素含量降低的幅度較大。經(jīng)處理后的野生型植株葉片含水量?jī)H為46%，而2個(gè)轉(zhuǎn)基因系葉片含水量在80%以上。這ー結(jié)果也與實(shí)施例5中觀察到的植株生長(zhǎng)表型一致。以上實(shí)驗(yàn)充分證明煙草中過(guò)量表達(dá)所述的NtRHFl基因能夠顯著提高植物的抗旱能力。
權(quán)利要求
1.煙草干旱響應(yīng)基因NtRHFl，核苷酸序列如SEQID N0:1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草干旱響應(yīng)基因NtRHFl的編碼蛋白的應(yīng)用，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，該蛋白過(guò)量表達(dá)能提高植物對(duì)干旱脅迫的抗性。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了煙草干旱響應(yīng)基因NtRHF1及其編碼蛋白的應(yīng)用；煙草干旱響應(yīng)基因NtRHF1核苷酸序列如SEQ ID NO1所示；編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示；過(guò)量表達(dá)該基因能提高植物對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)性，NtRHF1在煙草抗旱領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/52GK102533802SQ20121002472
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月6日
發(fā)明者夏宗良, 張小全, 朱偉, 蘇新宏 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)