專利名稱：珙桐pcr鑒定用引物及pcr鑒定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物檢測鑒定技術，具體地說涉及對珙桐生物資源進行PCR鑒定用引物及使用該引物的PCR鑒定方法。
背景技術：
珙桐屬珙桐科珙桐屬，為落葉喬木，花奇色美，是1000萬年前新生代第三紀留下的孑遺植物，在第四紀冰川時期，大部分地區(qū)的珙桐相繼滅絕，只有在我國南方的一些地區(qū)幸存下來，成為了植物界今天的“活化石”。為我國獨有的珍稀名貴觀賞植物，為世界著名的珍貴觀賞樹，常植于池畔、溪旁及療養(yǎng)所、賓館、展覽館附近，并有和平的象征意義，屬于被子植物。材質沉重，是建筑的上等用材，可制作家具和作雕刻材料。是世界上瀕于滅絕的、 非常珍貴的、我國獨有的單型屬植物。由于它具有極高的觀賞價值以及非常罕見等特點，被我國列為國家一級重點保護樹種。為防止我國珙桐種質資源的流失，對我國的社會生產力造成難以估量的損失，應該加大對我國珙桐資源的保護工作。
隨著現(xiàn)代生物技術的出現(xiàn)，致使基因資源更多的是以非活體的遺傳物質形式攜帶出境，增加了口岸查驗的困難，為防止我國珙桐資源流失，建立有效的植物遺傳資源出境檢驗鑒定方法就顯得極為必要。目前國內外對珙桐檢測識別僅限于形態(tài)上，在種的水平上未見有關其分子檢測方法的研究。
為了保護我國珙桐種質資源，需要建立一種能夠對難以從形態(tài)上進行判斷的珙桐遺傳資源進行辨別，且應該適合口岸檢查應用，簡單且精確的生物鑒定方法，以此防止珙桐不會以非活體遺傳物質形式等非傳統(tǒng)形態(tài)被攜帶出國境。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種珙桐的PCR鑒定用引物及PCR鑒定方法，對難以從形態(tài)上進行判斷的珙桐進行簡單且精確的鑒定。
本發(fā)明應用衍生性酶切擴增多態(tài)性序列(dCAPS，derived cleaved amplified polymorphic sequences)分子標記方法對珙桐的分子檢測方法進行研究，通過生物信息學的方法，在對珙桐與其近緣種植物葉綠體atpF-atpH基因序列進行分析和比較的基礎上， 設計dCAPS分子標記，建立了對珙桐穩(wěn)定、高效的鑒定方法，可根據(jù)對擴增產物酶切結果的瓊脂糖電泳判定是否有珙桐核酸存在。
dCAPS是一種通過等位基因快速檢測、鑒定單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)的分子標記方法。dCAPS技術原理為在引物中引入錯配堿基，使擴增的產物在一個生物型中具有相應的核酸內切酶酶切位點，而在另一種生物型中沒有，PCR產物經過核酸內切酶酶切，通過分析圖譜，進而檢測出SNP位點。在本發(fā)明提供的用于鑒定珙桐的引物中，基于atpF-atpH基因中的一個SNP位點，利用dCAPS Finder2. 0軟件設計上游引物，用I^rimer Premier 5. 0軟件設計下游引物。
本發(fā)明提供珙桐PCR鑒定用引物，能對珙桐的DNA進行擴增，生成珙桐特異性擴增片段。本發(fā)明提供的珙桐PCR鑒定用引物，其核苷酸序列為正向5，-GGTTACATTTTTCATATGATCTCCG-3，反向5，-ATTTTATTGCCTTGGATG-3，。本發(fā)明的引物可以通過利用本領域技術人員公知的化學合成方法來進行的DNA 合成技術來獲得。本發(fā)明提供了上述引物在鑒定珙桐種質資源中的應用。本發(fā)明提供了一種珙桐PCR鑒定方法，該方法以樣品總DNA為模板，上述引物進行 PCR擴增，擴增產物經限制性內切酶進行酶切，反應結束根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳，若酶切產物為279bp大小，判定為陽性結果。本發(fā)明提供的一種珙桐PCR鑒定方法中，限制性內切酶為Acil。本發(fā)明提供的PCR鑒定珙桐的方法中，25 μ L PCR反應體系為
樣品DNAlpL(10-50ng)10 χ PCR buffer (無 Mg2+ )2.5\\L25mM MgCl2IOmMdNTPs2\\LΙΟμΜ上游引物IpLΙΟμΜ下游引物IpL5U/pLTaqDNA 聚合酶O.lpLddH20\5ΛμL本發(fā)明提供的PCR鑒定珙桐的方法中，PCR的反應條件為預變性94°C、5min ；再經94°C變性30s，51°C退火40s，72°C延伸40s，35個循環(huán)；最后72°C延伸IOmin0本發(fā)明提供的PCR鑒定珙桐的方法中，20 μ L酶切反應體系為PCR產物10yL， IOXbuffer 2 μ L,內切酶 0. 5 μ L，ddH207. 5 μ L酶切反應條件為37 °C，反應池。在本發(fā)明的實施例中，PCR反應產物酶切后，用4%瓊脂糖凝膠進行電泳。酶切產物大小為279bp，判定為陽性結果，其核苷酸序列見SEQ ID No. 4所示。本發(fā)明提供的PCR鑒定珙桐方法，其檢測樣品總DNA可以來自珙桐的種子、葉片、 珙桐加工品以及珙桐種質資源。本發(fā)明還提供了一種珙桐鑒定用試劑盒，其含有的一對引物，該引物對的核苷酸序列為正向5，-GGTTACATTTTTCATATGATCTCCG-3，反向5，-ATTTTATTGCCTTGGATG-3，?？梢詫⒈景l(fā)明引物以及相關試劑組裝成試劑盒，以方便使用。本發(fā)明的試劑盒可以是由多個隔斷所形成，以容納固定一個或多個如管或小瓶的容器。這些容器之一或者多個可以裝有本發(fā)明的引物，根據(jù)需要該引物可以是凍干形式或溶于緩沖液中的狀態(tài)。另外， 本發(fā)明的試劑盒中還可以包括用于PCR反應的一種或多種酶/試劑，以及實施本發(fā)明所需要的其它成分及用具。
通過使用本發(fā)明的引物，對所測珙桐的DNA進行擴增，生成珙桐特異擴增片段，從而能夠簡單且精確地對珙桐進行鑒定。并且能有效地縮短試驗時間。本研究建立了適合口岸應用的簡便的珙桐檢測方法，即直接從進、出境的植物類材料上檢測珙桐，操作快捷、結果準確，避免了用傳統(tǒng)的形態(tài)分類學和細胞學方法所產生的耗費時間和易疏漏的缺陷，順應了當今口岸檢測工作的特點。


圖1為利用本發(fā)明引物的珙桐特異性檢測實驗結果，其中1 珙桐(1)，2:珙桐 (2),3 喜樹，4 辣椒，5 菊花岸地黃紅，6 水稻，7 鴨梨，8 水青樹，9 大豆，10 攀枝花蘇鐵，11 福建柏，12 紫毛兜蘭，13 銀脈蝦脊蘭，14 鵝掌楸，15 云南擬單性木蘭，16 觀光木，17 櫻桃紅燈，18 馬鈴薯大西洋，19 油菜中雙10號，20 水對照。
圖2為利用本發(fā)明引物的珙桐特異性檢測實驗結果，其中1 喜樹，2 珙桐(1)，3 珙桐(2)，M =DNA Marker DL2000。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
若未特別指明，實施例中所用的化學試劑均為常規(guī)市售試劑，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。
實施例1引物的設計
本發(fā)明通過分析珙桐與其近緣種植物atpF-atpH基因序列的基礎上，利用軟件 dCAPS Finder2. 0和Primer Premier 5. 0設計引物，經過多輪篩選，發(fā)現(xiàn)以下引物能夠快速、準確地對珙桐進行定性檢測。
本發(fā)明提供的檢測引物的核苷酸序列
正向5，-GGTTACATTTTTCATATGATCTCCG-3，
反向5，-ATTTTATTGCCTTGGATG-3，。
實施例2總DNA的提取
(1)取0. 2 0. 3g植物組織，用硅膠保存，剪碎后置研缽中加液氮研成粉末狀，移至已滅菌的1. 5mL離心管，一般加到離心管的1/3體積。
(2)在離心管中加入已在65°C預熱500 μ LCTAB提取液(20g/LCTAB, 1. 4M NaCl, 0. IM Tris-HCl,20mM EDTA，pH 8.0)混勻，置于 65°C水浴鍋保溫 30 分鐘。
C3)將樣品從水浴鍋中取出，加入與提取液等體積的氯仿/異戊醇04 1)，上下顛倒離心管充分混勻，12000轉/分鐘離心15分鐘。
(4)吸取上清液置于另一已滅菌的1. 5mL離心管。
(5)再加入等體積的氯仿/異戊醇04 1)，重復步驟(3)，⑷。
(6)加入等體積或兩倍體積的無水乙醇(已在_20°C預冷)，輕輕顛倒離心管混勻，置于-20°C冰箱，放置30分鐘。(7) 10000轉/分鐘離心10分鐘，倒去上清液，保留沉淀.此時的沉淀物主要為 DNA。(8)加入400 μ L 70%乙醇，10000轉/分鐘離心5分鐘，收集沉淀。置于37°C或 50°C烘箱烘干。(9)加入 100 μ L TE (或者滅菌水)溶解 DNA，再加 2 μ L RNA 酶(10mg/mL)，37°C保溫30分鐘。(10) 1. 0%瓊脂糖電泳檢測DNA濃度及質量。實施例3PCR擴增方法的建立1、PCR反應體系以總DNA為模板，進行PCR反應，25 μ L反應體系樣品DNA 1 μ L (10_50ng)， IOXPCR buffer (Mg2+free) 2. 5 μ L, 25mM MgCL2 2 μ L, IOmMdNTPs 2 μ L，10 μ M Primers 2 μ L, 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0. 1 μ L，ddH2015. 4 μ L。2、PCR反應條件將裝有樣品的PCR管放入ABI PCR儀后，設置如下條件進行反應預變性94°C、 5min ；再經94°C變性30s，51°C退火40s，72°C延伸40s，35個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。3、限制性內切酶進行酶切20yL酶切反應體系為
PCR 產物 IOpL 10 χ buffer 2μΣ 內切酶 0.5pL
ddH20 7.5μΣ ；酶切反應條件為37 °C，反應池。4、反應結束后酶切產物經過4%瓊脂糖凝膠電泳判定結果，若酶切產物比PCR擴增產物415bp特異性擴增條帶小，則為陽性。本實施例中，酶切產物為279bp。實施例4珙桐PCR方法的特異性確定以珙桐2份材料與其他17個植物總DNA為模板，以水為陰性對照，通過PCR反應， PCR產物酶切，酶切反應結束后用4%的瓊脂糖凝膠電泳，若酶切產物比PCR擴增產物4Mbp 特異性擴增條帶小的話，則可判定為陽性結果。試驗結果只有珙桐和其近緣種的PCR擴增產物出現(xiàn)陽性擴增，而其它材料和陰性對照均沒有目的擴增信號或有非特異性擴增，結果見圖1。經內切酶AciI酶切后，珙桐的 PCR產物的酶切產物與其近緣種喜樹的相比略小，結果見圖2。
權利要求
1.珙桐PCR鑒定用引物，其特征在于，其能對珙桐的葉綠體atpF-站PH基因進行擴增， 生成珙桐特異性擴增片段。
2.如權利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物核苷酸序列為 正向5’ -GGTTACATTTTTCATATGATCTCCG-3’反向5，-ATTTTATTGCCTTGGATG-3’。
3.權利要求1或2所述的引物在鑒定珙桐種質資源中的應用。
4.一種珙桐PCR鑒定方法，該方法以樣品總DNA為模板，利用權利要求1或2所述的引物進行PCR擴增，擴增產物經限制性內切酶進行酶切，反應結束后根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳判定結果。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，25μ L PCR反應體系為樣品DNA10-50ng,10 χ PCR buffer,無Mg2+2.5\\L25mM MgCl22\\LIOmMdNTPs2\\LΙΟμΜ上游引物IpLΙΟμΜ下游引物IpL5U/pLTaqDNA 聚合酶O.lpLddH20\5AμL
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，PCR的反應條件為預變性94°C、5min;再經 94°C變性30s, 51°C退火40s, 72°C延伸40s, 35個循環(huán)；最后72°C延伸IOmin0
7.如權利要求4所述的方法，其特征在于，20μ L酶切反應體系為PCR產物10 μ L， IOXbuffer 2 μ L,內切酶 0. 5 μ L, ddH207. 5 μ L ；酶切反應條件為 37°C，反應 2h。
8.如權利要求4所述的方法，其特征在于，用4%瓊脂糖凝膠進行電泳。
9.如權利要求4所述的方法，其特征在于，樣品總DNA來自珙桐的種子、葉片、珙桐加工品以及珙桐種質資源。
10.一種珙桐鑒定用試劑盒，其包括，權利要求1或2所述的引物。
全文摘要
本發(fā)明提供了珙桐PCR鑒定用引物及PCR鑒定方法。本發(fā)明通過分析珙桐與其近緣種植物atpF-atpH基因，設計了dCAPS引物，所述引物核苷酸序列見序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。本發(fā)明的珙桐PCR鑒定方法，是以樣品總DNA為模板，利用上述引物進行PCR擴增，選擇相應的限制性內切酶進行酶切，反應結束后根據(jù)瓊脂糖電泳判定結果。本發(fā)明引物特異性好，檢測方法快速簡單，準確性高，靈敏度好，為珙桐物種資源的鑒定提供了檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK102559908SQ20121002440
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月3日 優(yōu)先權日2012年2月3日
發(fā)明者李明福, 許瑾 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院