專利名稱：輔助鑒定杜鵑薊馬的方法及其專用引物對(duì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及昆蟲檢疫鑒定和害蟲監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種輔助鑒定杜鵑薊馬的方法及其專用引物對(duì)。
背景技術(shù)：
薊馬是有害生物類群，約有5500種，薊馬的檢疫和控制具有重要經(jīng)濟(jì)意義。對(duì)經(jīng)濟(jì)具有重大影響的薊馬約550余種，多發(fā)生在熱帶和亞熱帶地區(qū)，對(duì)水果、蔬菜生產(chǎn)造成直接危害，給熱帶地區(qū)果蔬產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易和調(diào)運(yùn)帶來嚴(yán)重影響，在世界植物檢疫中占有重要地位。薊馬體型細(xì)小，通常為1-1. 5_，繁殖力強(qiáng)、并喜愛棲息于隱秘場(chǎng)所，分布廣泛，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和檢疫上的重要害蟲。對(duì)經(jīng)濟(jì)具有重大影響的薊馬，如西花薊馬(Frankliniella occidentalis)、黃胸薊馬(Thrips hawaiiensis)、杜胃$薊馬(Thrips andrewsi)、普通大薊馬(Megalurothrips usitatus)、煙薊馬(Thrips tabaci)、掠櫚薊馬(Thrips palmi)、蔥韭薊馬(Thrips alliorum、)茶黃硬薊馬(Scirtothrips dorsalis)、鱷梨薊馬(Scirtothrips perseae)等，從國外入侵以及在國內(nèi)進(jìn)一步擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)極大，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和貿(mào)易構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。薊馬疫情的發(fā)展已引起國家高度重視，要求相關(guān)部門加強(qiáng)其檢疫鑒定、疫情監(jiān)測(cè)及控制工作。從進(jìn)口果蔬產(chǎn)品、植物花卉中所截獲到的薊馬以及在國內(nèi)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)疫情監(jiān)測(cè)中所誘捕到的薊馬，均需對(duì)其進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的種類鑒定。傳統(tǒng)的薊馬種類鑒定技術(shù)是以成蟲形態(tài)特征為依據(jù)，難于對(duì)未成熟蟲態(tài)(卵和幼蟲)、殘損樣品以及形態(tài)上非常相近的種類(如黃胸薊馬和杜鵑薊馬)進(jìn)行鑒定，無法滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)診斷防控及植物檢疫實(shí)際工作中所面對(duì)的特殊需求(快速、準(zhǔn)確、大規(guī)模、高通量檢測(cè)鑒定薊馬種類)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種輔助鑒定杜鵑薊馬的方法及其專用引物對(duì)。本發(fā)明提供了輔助鑒定杜鵑薊馬的特異引物對(duì)，由序列表的序列I所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段組成。所述特異引物對(duì)可用于制備試劑盒；所述試劑盒具有如下(a)和/或(b)所述的功能(a)輔助鑒定杜鵑薊馬；(b)輔助鑒別杜鵑薊馬和黃胸薊馬。本發(fā)明還保護(hù)包括所述特異引物對(duì)的試劑盒，；所述試劑盒具有如下(a)和/或 (b)所述的功能(a)輔助鑒定杜鵑薊馬；(b)輔助鑒別杜鵑薊馬和黃胸薊馬。所述試劑盒還可具有其它PCR擴(kuò)增的常規(guī)組分，如Taq酶、10XPCR Buffer (含Mg2+)、dNTPs等。本發(fā)明還提供了一種輔助鑒定杜鵑薊馬的方法，包括如下步驟以待測(cè)薊馬的基因組DNA為模板，用所述特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；如果得到250-500bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物， 所述待測(cè)薊馬為候選的杜鵑薊馬；如果沒有得到250-500bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，所述待測(cè)薊馬為候選的非杜鵑薊馬。所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具體可為285bp-295bp，如289bp。所述待測(cè)薊馬為杜醇薊馬、黃胸薊馬、Thrips parvispinus或普通大薊馬。本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒別杜鵑薊馬和黃胸薊馬的方法，包括如下步驟以待測(cè)薊馬的基因組DNA為模板，用所述特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；如果得到250-500bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，所述待測(cè)薊馬為候選的杜鵑薊馬；如果沒有得到250-500bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，所述待測(cè)薊馬為候選的黃胸薊馬。所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具體可為285bp-295bp，如289bp。所述待測(cè)薊馬為杜鵑薊馬或黃胸薊馬。所述特異引物對(duì)可用于輔助鑒定杜鵑薊馬。所述特異引物對(duì)可用于在輔助鑒別杜鵑薊馬和黃胸薊馬。所述特異引物對(duì)可用于輔助鑒定待測(cè)植物是否被杜鵑薊馬侵染。本發(fā)明具體解決的問題如下(1)解決杜鵑薊馬的快速鑒定問題，實(shí)現(xiàn)形態(tài)相似的兩種薊馬(黃胸薊馬和杜鵑薊馬)的區(qū)分，實(shí)現(xiàn)果蔬和園藝植物上常見的薊馬中杜鵑薊馬的鑒定；(2)解決了杜鵑薊馬非成蟲態(tài)樣品的種類鑒定問題；(3)開發(fā)杜鵑薊馬特異鑒定試劑盒，實(shí)現(xiàn)杜鵑薊馬的高效、便捷、準(zhǔn)確鑒定。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)實(shí)現(xiàn)了杜鵑薊馬快速鑒定，解決了其非成蟲態(tài)樣品的鑒定問題，開辟了兩種形態(tài)相似薊馬(黃胸薊馬和杜鵑薊馬)鑒定的新途徑；(2)操作簡便，經(jīng)濟(jì)易行，傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法一般需要玻片標(biāo)本制作技能，對(duì)樣品完整性等要求高，而特異引物分子鑒定方法可標(biāo)準(zhǔn)化，操作簡便且所需費(fèi)用較低，便于無專業(yè)分類學(xué)知識(shí)背景的工作人員操作與運(yùn)用，在實(shí)際工作中容易推廣應(yīng)用；(3)檢測(cè)靈敏度高，耗時(shí)短，且可以實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。


圖I為特異引物對(duì)特異性檢測(cè)的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2為特異引物對(duì)靈敏度檢測(cè)的瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。杜鵑薊馬又稱杜鵑花薊馬。實(shí)施例I、特異引物對(duì)的設(shè)計(jì)首先收集果蔬和園藝植物上常見的薊馬種類，其中包括形態(tài)相似的黃胸薊馬和杜鵑薊馬。通過基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增獲取其線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I條形碼 (mtDNA COI barcode)序列，同時(shí)收集 BOLD 數(shù)據(jù)庫和 GenBank 中薊馬屬 Thrips Linnaeus 的其他種的mtDNA COI條形碼基因序列。在此基礎(chǔ)上，采用DNAMAN軟件對(duì)不同種的mtDNA COI條形碼進(jìn)行比對(duì)分析，查找杜鵑薊馬的特異序列區(qū)段。采用人工設(shè)計(jì)杜鵑薊馬的特異引物對(duì)，并用Oligo軟件和Blast程序?qū)σ镞M(jìn)行評(píng)估檢查。在標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，對(duì)特異引物進(jìn)行篩選，僅對(duì)該引物所對(duì)應(yīng)的目標(biāo)種——杜鵑薊馬為陽性反應(yīng)(產(chǎn)生特異性條帶)，對(duì)其余種類均為陰性反應(yīng)(無特異性條帶產(chǎn)生)的引物即為杜鵑薊馬的特異引物對(duì)。
特異引物對(duì)的核苷酸序列如下(靶序列長度約為289bp ;因個(gè)體差異性靶序列長度處于285-295bp范圍內(nèi))TAndr-F (序列表的序列 I) :5’ -CATAGCAITTCCACGACTT-3’ ；TAndr-R (序列表的序列 2) :5’ -AAAGTACAGATCAAACAAAAAG-3’。實(shí)施例2、實(shí)施例I設(shè)計(jì)的引物對(duì)的特異性杜醇薊馬(Thrips andrewsi)、黃胸薊馬(Thrips hawaiiensis)和普通大薊馬 (Megalurothrips usitatus):公眾可以從中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所獲得，提及以上品種的文獻(xiàn)為張桂玲.中國薊馬科分類研究[碩士學(xué)位論文].陜西西北農(nóng)林科技大學(xué)，2003。Thrips parvispinus :公眾可以從中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所獲得，提及該品種的文獻(xiàn)為Mound, L. A. &Collins D. ff. , (2000)A south east Asian pest species newly recorded from Europe Thrips parvispinus(Thysanoptera Thripidae), its confused identity and potential quarantine significance. Journal of European Entomology,97,197-200.。一、實(shí)驗(yàn)樣本14頭薊馬樣本均采集自我國海南省不同寄主植物，包括了 4種薊馬杜鵑薊馬 (Thrips andrewsi)、黃胸薊馬(Thrips hawaiiensis)、Thrips parvispinus和普通大薊馬 (Megalurothrips usitatus)。14頭薊馬樣本的具體信息見表I。表I本實(shí)施例中使用的14頭薊馬樣本
樣本薊馬種類蟲態(tài)寄主采集年月I杜鵑薊馬成蟲黃角蘭2011.092杜鵑薊馬成蟲茶花2011.093杜鵑薊馬成蟲茉莉花2011.064杜鵑薊馬幼蟲黃角蘭2011. 095杜鵑薊馬幼蟲茶花2011. 096黃胸薊馬成蟲黃角蘭2011. 097黃胸薊馬成蟲茶花2011. 098黃胸薊馬成蟲香蕉花2011. 089黃胸薊馬幼蟲黃角蘭2011. 0910黃胸薊馬幼蟲香蕉花2011. 08
權(quán)利要求
1.輔助鑒定杜鵑薊馬的特異引物對(duì)，由序列表的序列I所示DNA片段和序列表的序列 2所示DNA片段組成。
2.權(quán)利要求I所述特異引物對(duì)在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒具有如下(a)和/ 或(b)所述的功能(a)輔助鑒定杜鵑薊馬；(b)輔助鑒別杜鵑薊馬和黃胸薊馬。
3.含有權(quán)利要求I所述特異引物對(duì)的試劑盒，;所述試劑盒具有如下(a)和/或(b)所述的功能(a)輔助鑒定杜鵑薊馬；(b)輔助鑒別杜鵑薊馬和黃胸薊馬。
4.一種輔助鑒定杜鵑薊馬的方法，包括如下步驟以待測(cè)薊馬的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求I所述特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；如果得到250-500bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，所述待測(cè)薊馬為候選的杜鵑薊馬；如果沒有得到250-500bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，所述待測(cè)薊馬為候選的非杜鵑薊馬。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述待測(cè)薊馬為杜鵑薊馬、黃胸薊馬、 Thrips parvispinus或普通大薊馬。
6.一種輔助鑒別杜鵑薊馬和黃胸薊馬的方法，包括如下步驟以待測(cè)薊馬的基因組 DNA為模板，用權(quán)利要求I所述特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；如果得到250-500bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，所述待測(cè)薊馬為候選的杜鵑薊馬；如果沒有得到250-500bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，所述待測(cè)薊馬為候選的黃胸薊馬。
7.權(quán)利要求I所述特異引物對(duì)在輔助鑒定杜鵑薊馬中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求I所述特異引物對(duì)在輔助鑒別杜鵑薊馬和黃胸薊馬中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求I所述特異引物對(duì)在輔助鑒定待測(cè)植物是否被杜鵑薊馬侵染中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種輔助鑒定杜鵑薊馬的方法及其專用引物對(duì)。本發(fā)明提供的特異引物對(duì)，由序列表的序列1所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段組成。所述特異引物對(duì)可用于輔助鑒定杜鵑薊馬。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)實(shí)現(xiàn)了杜鵑薊馬快速鑒定，解決了其非成蟲態(tài)樣品的鑒定問題，開辟了兩種形態(tài)相似薊馬(黃胸薊馬和杜鵑薊馬)鑒定的新途徑；(2)操作簡便，經(jīng)濟(jì)易行，傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法一般需要玻片標(biāo)本制作技能，對(duì)樣品完整性等要求高，而特異引物分子鑒定方法可標(biāo)準(zhǔn)化，操作簡便且所需費(fèi)用較低，便于無專業(yè)分類學(xué)知識(shí)背景的工作人員操作與運(yùn)用，在實(shí)際工作中容易推廣應(yīng)用；(3)檢測(cè)靈敏度高，耗時(shí)短，且可以實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102534020SQ20121002395
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月3日
發(fā)明者伍祎, 劉奎, 邱海燕 申請(qǐng)人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所