專利名稱：一種循環(huán)腫瘤細胞特異性富集方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領域，具體地涉及一種循環(huán)腫瘤細胞特異性富集方法。
背景技術(shù)：
癌癥是導致人類死亡的最主要死因之一，世界衛(wèi)生組織(WHO)的數(shù)據(jù)顯示，2008 年全球癌癥新發(fā)病例約為1270萬，癌癥死亡例數(shù)為760萬。目前全球每年新增癌癥患者約為900萬人，預計到2020年全世界癌癥發(fā)病率將比現(xiàn)在增加50%，全球每年新增癌癥患者人數(shù)將達到1500萬人。目前全世界發(fā)病率最高的癌癥是肺癌，依次是乳腺癌，是腸癌、胃癌、肝癌和宮頸癌。中國是世界上癌癥發(fā)病率和死亡率最高的國家之一，全世界有20%的新發(fā)癌癥病人在中國，有1/4的癌癥死亡病人在中國。癌癥的發(fā)病是源于機體的某些器官或組織，癌癥的發(fā)生開始于單個癌細胞，單癌細胞不斷的分裂、增值、分化就可以產(chǎn)生一小團癌細胞而形成腫瘤。當腫瘤生長到一定體積時，癌細胞就會脫落，并通過血管或淋巴管擴散到機體的其它組織或器官，這會形成癌癥轉(zhuǎn)移。癌細胞進入血液循環(huán)是實現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的最初階段，為最終形成腫瘤的轉(zhuǎn)移病灶提供了可能。循環(huán)腫瘤細胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)是指進入人體外周血的腫瘤細胞。 通過檢測外周血中的腫瘤細胞可以有效預測腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。大多數(shù)的癌癥患者致死的主要原因是腫瘤細胞獲得轉(zhuǎn)移能力，通過血液擴散到其他器官或組織。因此在血液中檢測循環(huán)腫瘤細胞具有重要的臨床應用價值，CTCs的檢測對于臨床早期篩查和診斷、監(jiān)測病情、治療預后等具有重要意義。多項研究顯示，檢測乳腺癌患者的CTCs有利于更精確的分期和病情評估，有助于乳腺癌早期診斷，復發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)控。傳統(tǒng)乳腺癌的臨床病理分期和腫瘤細胞分化分級的方法，可以大致反映不同病人術(shù)后生存率的差別，但這些臨床病理特征并不能準確病理分期、預測轉(zhuǎn)移復發(fā)和病人預后。檢測乳腺癌患者的CTCs可以更精確的進行臨床病理分期和病情評估。此外，檢測CTCs是用于評估乳腺癌患者預后的主要指標之一，CTCs能有效預測和監(jiān)測輔助治療的效果，對CTCs狀態(tài)及生物學特性進行分析，可為乳腺癌輔助治療方案的選擇提供更多依據(jù)(Bauernhofer et al. , Oncol Rep, 13 (2), 2005 ；Cristofanilli, SeminOncol,33(3Suppl 9)2006)。對于前列腺癌患者,CTCs是一個重要的預后因子。Shaffer等人(Shaffer et al., ClinCancer Res, 13 (7), 2007)的研究顯示超過65%轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者CTCs大于5，CTCs 大于5患者的中位生存時間小于I年；而CTCs小于5患者的中位生存時間則大于4年。 Olmos等人(Olmos et al. , Ann Oncol, 20 (I), 2009)的研究得出了相似的研究結(jié)論,所研究的191例前列腺癌患者治療前和治療后CTCs數(shù)與總生存時間的關系。結(jié)果表明CTCs大于5患者的總生存時間只有19. 5個月，而CTCs小于5患者的總生存時間超過30個月。因此，檢測CTCs可以有效地用于前列腺癌的治療及生存預后，有助于臨床醫(yī)生為前列腺癌患者制定科學的治療方案。研究表明對于肺癌和結(jié)直腸癌等癌癥患者，CTCs可作為預后判斷重要指標之一。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸腫瘤患者在手術(shù)之后，通過檢測CTCs的數(shù)量能較為準確地預測腫瘤的復發(fā)和預后(Sergeant, et al. J Surg Res, 150 (I), 2008)。另一項研究表明，手術(shù)后的非小細胞癌患者外周血CTCs檢測陽性，與患者發(fā)生復發(fā)性及臨床預后密切相關。進一步表明檢測 CTCs對于包括肺癌和結(jié)腸癌在內(nèi)的多種癌癥具有重要的臨床應用價值，可以用于臨床病理分期、病情監(jiān)測、病情評估及治療預后。此外，大多數(shù)癌癥的篩查、早期診斷、治療預后及個體化診療都面臨獲取病理樣本較難，即使可以取得病理組織樣本，一般樣本量都較少，在少樣本量檢測和評估下，會導致漏檢和假陰性的發(fā)生。不能滿足臨床篩查，診斷和檢測的實際需求，從而使腫瘤患者錯失了最佳的治療時期。眾所周知，血液檢測不需腫瘤組織標本、技術(shù)相對簡單、小創(chuàng)傷、便于在同一患者多次重復進行，易于被患者接受，對于臨床具有更重要的應用價值。如果可以從外周血或淋巴液等體液中捕獲癌細胞，就可以解決臨床晚期患者無病理樣本，或病理樣本少的問題，可以為臨床醫(yī)生的診療，化療預后提供快速科學的參考依據(jù)。目前的CTCs的檢測技術(shù)主要有免疫磁珠分選法和密度梯度離心法。免疫磁珠分選法(如CN201110005376. 8，一種從組織中分離富集靶細胞的方法；循環(huán)腫瘤細胞的檢測及其在乳腺癌患者中的臨床應用，馬德亮等，臨床腫瘤學雜志，2010年11月第15卷第11 期；循環(huán)腫瘤細胞的檢測，李帥等，醫(yī)學綜述，2010年3月第16卷第6期)的基本原理是將磁珠作為抗體載體形成抗體磁珠復合物，其與細胞特異性抗原結(jié)合后形成抗原抗體磁珠復合體，該復合體在外加磁場的作用下發(fā)生移動并與其他非選擇物分離，從而達到分離細胞的目的。免疫磁珠分離方法雖然可以較好地進行CTCs的分離和富集，但是該方法的費用較高，操作較復雜，不能滿足臨床快速檢測和實際檢測的需求。密度梯度離心法(如 CN97195305. 8，富集稀少細胞的方法)具有操作相對簡單，可操作性強，經(jīng)濟實用，然而多次離心可造成CTCs的破壞和損失，檢測的敏感性相對不足，無法特異性識別腫瘤細胞，細胞回收率只有40% _65%，其富集的敏感性遠達不到臨床的檢測的實際需求。因此，臨床上迫切需要開發(fā)一種靈敏度高，經(jīng)濟適用，操作性強，簡單實用的CTCs富集檢測技術(shù)，以實現(xiàn)采用特異性的檢測方法對CTCs進行富集和檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對上述問題，提供一種快速、操作簡便、經(jīng)濟實用的CTCs富集和檢測方法。一種富集循環(huán)腫瘤細胞的方法，包括以下步驟(a)根據(jù)所需制備腫瘤細胞表面受體的一抗和二抗；(b)固定腫瘤細胞表面受體二抗；(c)孵育一抗與待測樣品；(d)捕獲待測樣品中的循環(huán)腫瘤細胞；或包括以下步驟(A)根據(jù)所需制備腫瘤細胞表面受體的一抗；(B)固定腫瘤細胞表面受體一抗；(C)孵育待測樣品；(D)捕獲待測樣品中的循環(huán)腫瘤細胞。
其中，所述的腫瘤細胞的表面受體包括EGFR、VEGFR、FGFR或I3DGFR等，這些表面受體的第一抗體可以通過商業(yè)購買得到，也可以自制。其中，所述步驟b或步驟B的固定為將二抗或一抗固定在聚苯乙烯或聚丙烯材料的固相載體上或其它現(xiàn)有的固相載體上。固定的固相載體可以選用聚苯乙烯或聚丙烯材料的酶標板，酶標板可以為96孔，48孔或12孔板，其中任意一種?？贵w和固相載體的固定方法有多種，較佳地，本發(fā)明的一抗或二抗按如下步驟進行操作進行固定(a)酶標板使用前用PBS沖洗，將一抗或二抗用H緩沖液(pH 9.6)稀釋為 3-10μ g/mL，加入酶標板中；(b)蓋上膜板包被4°C 10-15小時，或37°C放置1-2小時；(c)棄去包被液用PBST洗滌液洗滌I次，輕拍孔板使洗滌液甩干；(d)每孔中加入200 μ L封閉液封板，在37°C放置I小時；(e)甩去孔板里面的溶液，用PBST洗滌2次后拍干，置于4°C保存?zhèn)溆?。在本發(fā)明中，所述的一抗可以單克隆抗體或者多克隆抗體。在本發(fā)明的較佳實施例中，所述的一抗為兔抗人細胞表面受體。在本發(fā)明的較佳實施例中，所述的二抗為羊抗兔一抗的抗體。在本發(fā)明的較佳實施例中，步驟d或步驟D之后，還包括步驟(e)循環(huán)腫瘤細胞的檢測。例如，采用熒光PCR檢測。本發(fā)明另一方面提供了用于孵育一抗與循環(huán)腫瘤細胞的方法，步驟c的操作為 將一抗用PBS液稀釋，調(diào)整其濃度為2-10 μ g/mL，取50 μ L加入到經(jīng)Red Cell Lysis液處理的待檢測患者血液的離心管中，混勻、37°C下微震蕩孵育10-20分鐘，使之充分接觸；將上述孵育后的血液轉(zhuǎn)移到第二抗體固定的酶標板內(nèi)。其中，處理血液的方法包括加入Red Cell Lysis液后，再加入福爾馬林或70% 乙醇溶液。本發(fā)明另一方面提供了用于檢測富集的循環(huán)腫瘤細胞的EGFR基因突變的方法，
檢測的試劑盒包括如下體系
模板5 μι
各引物0.1-1.0 μπιο
各探針0.5-L0 Mmol
Taq 酶1.0U
dNTPI. O mmol
MgCL27. O mmol
總體積25 μι所述引物和探針序列包括SEQ ID NO :I-SEQ ID NO :24。本發(fā)明方法設計運用CTCs的表面特有表面抗原作為靶標，通過其對應的抗體識別結(jié)合CTCs表面抗原，使其變?yōu)閹А板^”的腫瘤細胞，然后通過固相載體固定化表面受體的第二抗體，特異性捕獲“錨腫瘤細胞”，達到分離的目的。并采用高靈敏的PCR檢測方法高靈敏的檢測試劑盒檢測。
本發(fā)明的CTCs富集方法特異性強，高效快速、操作簡便、經(jīng)濟實用，所用檢測方法靈敏度高，檢測效率高，同時具備了特異性富集、高靈敏檢測、簡單實用、快速準確等特點。 實現(xiàn)CTCs的特異性捕獲和高靈敏檢測的優(yōu)勢雙重結(jié)合。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明建立了一種特異性富集循環(huán)腫瘤細胞的方法，此方法(I)可以在血液，淋巴液或胸腔積體液中快速高效富集循環(huán)腫瘤細胞；(2)操作簡單，只需對一抗或二抗進行固化，通過固化的二抗捕獲循環(huán)腫瘤細胞；(3)富集方便快速，操作過程只需45分鐘；(3)富集后可快速檢測，通過富集可以快速應用于循環(huán)腫瘤細胞基因突變檢測；(4)特異性強，可以特異性富集血液中的腫瘤細胞。(5)成本比磁珠分離法低。(6)整個富集和檢測方法靈敏度高，其最低檢測限可以檢測出5個腫瘤細胞每5ml的血液中。


圖I為富集循環(huán)腫瘤細胞的原理模式2為實施例I的操作示意圖。圖3為實施例中3個不同細胞濃度下檢測的PCR圖。
具體實施例方式本發(fā)明通過循環(huán)腫瘤細胞表面抗原制備其特異性抗體，基于抗原和抗體的特異性親和力來捕獲CTCs。其基本原理是將固相載體作為二抗的載體形成二抗載體復合物，將一抗作為循環(huán)腫瘤細胞表面特異性抗原識別體形成一抗細胞結(jié)合物，即形成為“錨腫瘤細胞”，二抗載體復合物可以特異結(jié)合一抗，在一定條件通過特異親和力形成二抗一抗細胞復合體，從而實現(xiàn)捕獲CTCs，達到分離細胞的目的。然后通過高靈敏的檢測方法對富集的腫瘤細胞進行檢測，實現(xiàn)了對CTCs的特異性捕獲和高靈敏檢測。CTCs富集及檢測方法包括如下步驟(I)制備細胞腫瘤細胞表面受體一抗和二抗(a)兔抗人細胞表面受體一抗的制備將200 μ g抗原溶入ImL的PBS緩沖溶液中，取上述抗原ImL加常規(guī)的ImL完全福氏佐劑，劇烈震蕩使之充分乳化，制得抗原乳化液。取上述乳化的抗原對兔進行后背皮下注射，每點注射量約為500 μ L。首次免疫后，每2-3周注射抗原加強免疫，并在末次免疫后的 7-14天收集血液。收集的血液置于37°C恒溫箱放置下半小時左右，在4°C放置過夜后，在 4°C, IOOOOg離心10分鐘，收集上清液即為抗血清，將上述抗血清用親和柱層析進行純化， 得到第一抗體，后貯于-20°C以下冰箱保存?zhèn)溆谩?b)羊抗兔二抗的制備將上述得到一抗經(jīng)過純化之后，取400ug作為抗原溶入3mL的PBS緩沖溶液中，將其等比例的與完全福氏佐劑混合乳化后，注射于綿羊后腿肌肉。兩周后，按照相同的方法再免疫一次。末次免疫后兩周，采血。采集的血液置于37°C恒溫箱放置下半小時，然后在4°C， IOOOOg離心10分鐘，收集上清液即為抗血清，將上述抗血清用親和柱層析進行純化，得到純的羊抗兔第二抗體，后貯于-20°C以下冰箱保存?zhèn)溆?。其中所述細胞表面受體可以為(a)表面生長因子受體(Epidermal Growth FactorReceptor, EGFR) ； (b)血管內(nèi)皮生長因子受體(Vascular Endothelial GrowthFactorReceptor, VEGFR) ; (C)成纖維細胞生長因子(Fibroblast Growth Factor receptor, FGFR) ； (d)人血小板衍生生長因子受體(Platelet-Derived Growth Factor Receptor, PDGFR)。(2)固定細胞表面受體二抗采用聚苯乙烯或聚丙烯材料的固相載體作為第二抗體的載體，通過二抗的Fe端與固相載體一定條件下結(jié)合形成二抗載體復合物，其形成二抗載體復合物的過程稱為固定。固定的固相載體可以選用聚苯乙烯或聚丙烯材料的酶標板，酶標板可以為96孔，48孔或12孔板，其中任意一種。將純化后的抗體按如下步驟進行操作進行固定(f)酶標板使用前用PBS沖洗，將二抗用H緩沖液(pH 9. 6)稀釋為3-10 μ g/mL, 加入酶標板中；(g)蓋上膜板包被4°C，放置6-24小時，或37°C放置1-2小時；(h)棄去包被液用PBST洗滌液洗滌I次，輕拍孔板使洗滌液甩干；⑴每孔中加入200 μ L封閉液封板，在37°C放置1-2小時；(j)甩去孔板里面的溶液，用PBST洗滌2次后拍干，置于4°C保存?zhèn)溆?；所述溶液配制如下PBS 液1. 2g Na2HPO4,0. Ig KCl,0. Ig K3PO4,4. Og NaCl，調(diào)整pH至7. 4，定溶于500mL超純水中，封閉液PBS 液加 5% BSA ；PBST 洗滌液=PBST (pH 7. 4+0. 05 % 吐溫 20)；H 緩沖液3. Og Na2CO3,6. Og NaHCO3,溶解于 IOOOmL 超純水中，調(diào)整 pH 至 9. 6 ;(3)孵育一抗和循環(huán)腫瘤細胞制備的一抗可以特異性識別循環(huán)腫瘤細胞表面特有的抗原，并通過抗原和抗體間的親和力，實現(xiàn)特異性結(jié)合，形成一抗腫瘤細胞結(jié)合體，從而使腫瘤細胞變?yōu)閹А板^”腫瘤細胞。按如下實施步驟孵育包被“錨腫瘤細胞”取5mL的含腫瘤細胞的血液加入Red Cell Lysis溶液(具體操作步驟按試劑盒說明書操作)，離心后棄上清液，加入3ml的PBS溶液；將上述制備的兔抗人表面受體的一抗用PBS液稀釋，調(diào)整其濃度為2-10 μ g/mL，取50 μ L加入經(jīng)Red Cell Lysis液處理的待檢測患者血液的離心管中，混勻、37°C下微震蕩孵育10-20分鐘，使之充分接觸。(4)捕獲“錨腫瘤細胞”將經(jīng)步驟(3)處理孵育后的血液轉(zhuǎn)移到經(jīng)步驟(2)處理的帶有固定二抗的酶標板內(nèi)。在37°C下孵育30-40分鐘，使其充分反應結(jié)合；反應后移去多余血液，然后用PBST洗滌I次；通過抗原抗體的特異性親和力“錨腫瘤細胞”即被捕獲，如圖I所示。待洗畢后，采用步驟5所述的熒光PCR方法檢測。(5)檢測循環(huán)腫瘤細胞(a)富集細胞DNA的提取 經(jīng)PBST洗滌后，加入蛋白酶K和Buffer ATL, 56 V消化裂解I小時，加入 200mL BufTerAL混勻再加入200 μ L無水乙醇充分混勻；將上清小心轉(zhuǎn)移到QIA 2mL離心柱中，6000 X g (8000rpm)離心 lmin,加入 500 μ L Buffer Aff1,6000 X g (8000rpm)離心lmin,小心打開蓋子加入500 μ L Buffer AW2,6000Xg(8000rpm)離心lmin,空管離心20000Xg(HOOOrpm)離心3min，加入IOOyL Buffer ATE于膜中央，溫育5分鐘， 20000Xg(14000rpm)離心 lmin。所提DNA溶于Tris-HCl (10mmol/L,pH 8. O)，經(jīng)紫外分光光度計檢測提取質(zhì)量，并確定濃度，用Tris-HCl溶液(10mmOl/L，pH 8. O)調(diào)整DNA濃度2ng/l·! L作為PCR擴增的模板。(b)熒光PCR擴增體系根據(jù)檢測目的之不同設計不同的探針及引物進行檢測，提取的DNA模板后，應于如下實時熒光PCR進行擴增，熒光PCR擴增體系為
模板I-IOmL各引物O. 1-1. Oμπιο 各探針O. 5-1. Oμπιο Taq酶I. 0-5. OUdNTPO. 5-3. 0-mmolMgCL22. 0-10. Ommol總體積10-40 mL所述熒光PCR的反應條件是95°C預變性5分鐘，15個循環(huán)；94°C變性15秒，66°C 退火40秒，72°C延伸10秒，35個循環(huán)；94°C變性15秒，56°C退火40秒，72°C延伸10秒，35 個循環(huán)，后35個循環(huán)在退火時檢測FAM和HEX或ROX熒光信號。檢測FAM和HEX熒光信號的Ct值，根據(jù)熒光PCR擴增儀顯示的Ct值判斷結(jié)果檢測反應體系的FAM和HEX熒光強度，以HEX信號達到設定閾值(Ct > 16)時表明上樣DNA 的量在允許范圍內(nèi)，F(xiàn)AM信號結(jié)果可信；以FAM達到設定的閾值時所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為陰陽性判斷的標準，Ct值為O或31 :陰性；Ct小于30 :陽性。下面結(jié)合實施例，來對本發(fā)明檢測體系進一步闡述。應理解，這些實施例僅用于本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。除非另有定義或說明，本專利所述的科學技術(shù)術(shù)語與本領域普通技術(shù)人員所理解具有相同的含義。實施例I本實施例以腫瘤細胞表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)為特異性結(jié)合靶點，以EGFR為抗原制備第一抗體及第二抗體，以腫瘤細胞H1975和健康人血液為介質(zhì)捕獲腫瘤細胞為例，對本發(fā)明富集和檢測體系作進一步闡述和驗證。富集和檢測的方法包括以下步驟I.制備EGFR—抗及二抗(a)兔抗人EGFR—抗的制備將200 μ g抗原溶入ImL的PBS緩沖溶液中，取上述抗原ImL加常規(guī)的ImL完全福氏佐劑，劇烈震蕩使之充分乳化，制得抗原乳化液。取上述乳化的抗原對兔進行后背皮下注射，注射量約為500 μ L。首次免疫后，每2-3周注射抗原加強免疫，并在注射后的7-10天收集血液。收集的血液置于37°C恒溫箱放置下半小時，放置4°C過夜；然后于4°C，IOOOOg離心10分鐘，收集上清液即為抗血清，將上述抗血清用親和柱層析進行純化，后貯于_20°C以下冰箱保存。(b)羊抗兔EGFR 二抗的制備
將上述得到一抗經(jīng)過純化之后，取400ug作為抗原溶入3mL的PBS緩沖溶液中，將其等比例的與完全福氏佐劑混合乳化后，注射于綿羊后腿肌肉。兩周后，按照相同的方法再免疫一次。末次免疫后兩周，采血。采集的血液置于37°C恒溫箱放置下半小時左右；然后在 4°C，IOOOOg離心10分鐘，收集上清液即為抗血清，將上述抗血清用親和柱層析進行純化， 后貯于_20°C以下冰箱保存。2.固定表面受體二抗以聚苯乙烯或聚丙烯材料制得的96孔酶標板為固定的固相載體，包被前用PBS沖洗酶標板I次，按如下步驟操作進行包被(a)將EGFR二抗用H緩沖液(pH 9. 6)稀釋的為5 μ g/mL的工作液；每孔加200 μ L 的抗體工作液于酶標板中；(b)蓋上膜板在4°C包被孵育12小時；(c)棄去包被液用PBST洗滌液洗滌I次，輕拍孔板使洗滌液甩干；(d)每孔中加入200 μ L封閉液封板，37°C放置I小時；(e)甩去孔板里面的溶液，用PBST洗滌2次后拍干，室溫晾干，4°C保存?zhèn)溆?；所述溶液配制如下PBS 液1. 2g Na2HPO4,0. Ig KCl, O. Ig K3PO4,4. Og NaCl，溶于 500mL 超純水中，調(diào)整pH至7. 4 ;封閉液PBS液加 5 % BSA ;PBST 洗滌液=PBS 加 O. 05 % 吐溫 20 (pH 7. 4)；H 緩沖液3. Og Na2CO3,6. Og NaHCO3,溶于 IOOOmL 超純水中，調(diào)整 pH 至 9. 6 ;3.孵育一抗和H1975腫瘤細胞取人工培養(yǎng)的對數(shù)生長期腫瘤細胞H1975，用細胞計數(shù)板計數(shù)后，確定初始細胞數(shù)為105/mL，經(jīng)10倍梯度稀釋，調(diào)整細胞數(shù)分別為104/mL，103/mL和102/mL。將上述3個濃度的稀釋細胞各取50uL，分別加入到含有5mL健康人血(EDTA抗凝)的離心管中，微振蕩混合均勻。同時，將上述104/mL，103/mL和102/mL 3個濃度的稀釋細胞各50uL，分別加入到5mL 的PBS溶液中，微振蕩混合均勻，作為陽性對照。以不含腫瘤細胞的健康人各取50uL加到 5mL血液，作為陰性對照。分別取上述血液5mL的加入Red Cell Lysis溶液(具體操作步驟按試劑盒說明書操作)，離心后棄上清液，加入3ml的PBS溶液；將上述制備的兔抗人表面受體的一抗用 PBS液稀釋，調(diào)整其濃度為2-10 μ g/mL，取50 μ L加入經(jīng)Red Cell Lysis處理后的待檢測血液的離心管中，混勻、37°C下微震蕩孵育10-20分鐘，使之充分接觸。4.捕獲“錨腫瘤細胞”將上述步驟(3)孵育的一抗血液分別轉(zhuǎn)移到經(jīng)步驟(2)固定的二抗酶標板內(nèi)，在 37°C下孵育30分鐘，繼續(xù)反應，反應后移去多余血液，然后用PBST洗滌I次，如圖2所示。 待洗畢后，采用步驟5所述的熒光PCR方法檢測。5.檢測循環(huán)腫瘤細胞(a)循環(huán)腫瘤細胞DNA的提取經(jīng)PBST洗完后，加入蛋白酶K和Buffer ATL, 56 V消化裂解I小時，加入 200mL BufTerAL混勻再加入200 μ L無水乙醇充分混勻；將上清小心轉(zhuǎn)移到QIA 2mL離心柱中，6000 X g (8000rpm)離心 lmin,加入 500 μ L Buffer Aff1,6000 X g (8000rpm)離心lmin,小心打開蓋子加入500 μ L Buffer AW2,6000Xg(8000rpm)離心lmin,空管離心20000Xg(HOOOrpm)離心3min，加入IOOyL Buffer ATE于膜中央，溫育5分鐘， 20000Xg(14000rpm)離心 lmin。所提DNA溶于Tris-HCl (lOmmol/L，pH 8. O)，經(jīng)紫外分光光度計檢測提取質(zhì)量，并確定濃度，用Tris-HCl溶液(lOmmol/L，pH 8. O)調(diào)整DNA濃度2ng/μ I作為PCR擴增的模板。(b) PCR擴增體系將上述所提DNA樣本應于如下實時熒光PCR進行擴增，所述擴增引物為特異引物， 探針為新型雙環(huán)探針，引物和探針序列見表2. EGFR的熒光PCR擴增體系為
模板5 \jL各引物O. 1-1. O各探針O. 5-1. OTaq酶1.0UdNTP1. O mmolMgCL27. 0 mmol總體積25 μι所述熒光PCR的反應條件是95°C預變性5分鐘，15個循環(huán)94°C變性15秒，66°C退火40秒，72°C延伸10秒，35個循環(huán)94°C變性15秒，56°C退火40秒，72°C延伸10秒，31個循環(huán)，后31個循環(huán)在退火時檢測FAM和HEX或ROX熒光信號。采用MX3000P熒光PCR擴增儀，檢測FAM和HEX熒光信號的Ct值，根據(jù)熒光PCR 擴增儀顯示的Ct值判斷結(jié)果檢測反應體系的FAM和HEX熒光強度，以HEX信號達到設定閾值(Ct > 16)時表明上樣DNA量在允許范圍內(nèi)，F(xiàn)AM信號結(jié)果可信；以FAM達到設定的閾值時所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為陰陽性判斷的標準，Ct值為O或31 :陰性；Ct小于30 :陽性。實驗結(jié)果表明，在含有腫瘤細胞的血液可以檢測出含有腫瘤細胞，其最低檢測限可以檢測出5個腫瘤細胞每5ml的血液中，檢測結(jié)果見圖3。表明該方法具有很好的富集效果，可以滿足臨床檢測實際的需求。表I EGFR突變特異性引物和探針核苷酸序列
權(quán)利要求
1.一種富集循環(huán)腫瘤細胞的方法，包括以下步驟(a)根據(jù)所需制備腫瘤細胞表面受體的一抗和二抗；(b)固定腫瘤細胞表面受體二抗；(C)孵育一抗與待測樣品；(d)捕獲待測樣品中的循環(huán)腫瘤細胞；或包括以下步驟(A)根據(jù)所需制備腫瘤細胞表面受體的一抗；(B)固定腫瘤細胞表面受體一抗；(C)孵育待測樣品；(D)捕獲待測樣品中的循環(huán)腫瘤細胞。
2.如權(quán)利要求I所述的一種富集循環(huán)腫瘤細胞的方法，其特征在于表面受體包括 EGFR、VEGFR、FGFR 或 PDGFR。
3.如權(quán)利要求I所述的一種富集循環(huán)腫瘤細胞的方法，其特征在于所述步驟b或步驟B的固定為將二抗或一抗固定在聚苯乙烯或/和聚丙烯材料的固相載體上。
4.如權(quán)利要求I所述的一種富集循環(huán)腫瘤細胞的方法，其特征在于，二抗或一抗按如下步驟進行固定(a)酶標板使用前用PBS沖洗，將一抗或二抗用緩沖液稀釋為3-10μ g/mL,加入酶標板中；(b)蓋上膜板包被4°C10-15小時，或37°C放置1_2小時；(c)棄去包被液用PBST洗滌液洗滌I次，輕拍孔板使洗滌液甩干；(d)每孔中加入200μ L封閉液封板，在37°C放置I小時；(e)甩去孔板里面的溶液，用PBST洗滌2次后拍干，置于4°C保存?zhèn)溆谩?br> 5.如權(quán)利要求I所述的一種富集循環(huán)腫瘤細胞的方法，其特征在于所述的一抗為單克隆抗體或者多克隆抗體。
6.如權(quán)利要求I所述的一種富集循環(huán)腫瘤細胞的方法，其特征在于，步驟c的操作為 將一抗用PBS液稀釋，調(diào)整其濃度為2-10 μ g/mL，取50 μ L加入到經(jīng)Red Cell Lysis液處理的待檢測患者血液的離心管中，混勻、37°C下微震蕩孵育10-20分鐘，使之充分接觸；將上述孵育后的血液轉(zhuǎn)移到第二抗體固定的酶標板內(nèi)。
7.如權(quán)利要求6所述的步驟c的操作，其特征在于處理血液的方法包括加入Red CellLysis液步驟后，再加入福爾馬林或70%乙醇溶液。
8.如權(quán)利要求I至7任一項所述的一種富集循環(huán)腫瘤細胞的方法，其特征在于步驟d 或步驟D之后，還包括步驟(e)循環(huán)腫瘤細胞的檢測。
9.用于檢測富集的循環(huán)腫瘤細胞的EGFR基因突變的引物和探針，其特征在于所述引物和探針序列包括SEQ ID NO =I-SEQ ID NO :24。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種富集循環(huán)腫瘤細胞的方法，(a)根據(jù)所需制備腫瘤細胞表面受體的一抗和二抗；(b)固定腫瘤細胞表面受體二抗；(c)孵育一抗與待測樣品；(d)捕獲待測樣品中的循環(huán)腫瘤細胞。本發(fā)明方法操作簡單，只需對二抗進行固定，通過固定的二抗捕獲孵育的循環(huán)腫瘤細胞；富集方便快速，操作過程只需45分鐘；富集后可快速檢測，通過富集可以應用于體液中循環(huán)腫瘤細胞基因突變檢測。
文檔編號C12N5/09GK102586189SQ20121002348
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月2日
發(fā)明者周細武, 張海龍, 曾驥孟, 羅捷敏, 鄭立謀, 阮力 申請人:廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司