專利名稱：用于多核苷酸序列線性等溫?cái)U(kuò)增的方法及組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多核苷酸擴(kuò)增技術(shù)領(lǐng)域。更具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了利用單個(gè)的RNA/ DNA組合引物擴(kuò)增(即進(jìn)行多次復(fù)制)靶多核苷酸序列的方法、組合物及藥盒，該擴(kuò)增技術(shù)任意地包括轉(zhuǎn)錄作用。
背景技術(shù)：
核酸擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法的發(fā)展近年來(lái)業(yè)已改進(jìn)了核酸序列的檢測(cè)、鑒定、 定量以及序列分析。核酸分析可用于檢測(cè)和鑒定病原體、檢測(cè)導(dǎo)致確定表型的基因變異、診斷遺傳病或?qū)膊〉拿舾行?、評(píng)估發(fā)育、疾病和對(duì)特定刺激的反應(yīng)以及不同基因組測(cè)序計(jì)劃中的基因表達(dá)。核酸擴(kuò)增方法的其它應(yīng)用包括稀少細(xì)胞的檢測(cè)、病原體的檢測(cè)以及惡性腫瘤中變異基因表達(dá)的檢測(cè)等等。核酸擴(kuò)增技術(shù)可潛在地用于定性分析(諸如檢測(cè)確定核酸序列的存在)以及確定基因序列的定量分析。其中后者可用于病原體序列的評(píng)估和定量，以及基因增殖或缺失的測(cè)定(例如經(jīng)常出現(xiàn)在從正常細(xì)胞到腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞轉(zhuǎn)變中)。核酸序列中的序列變異檢測(cè)對(duì)于突變基因型的檢測(cè)(例如有關(guān)基因分析)、導(dǎo)致抗藥性和藥物遺傳性的突變檢測(cè)等是非常重要的。用于檢測(cè)特異突變的不同方法包括等位基因特異的引物延伸、等位基因特異的探針連接反應(yīng)以及鑒別探針雜交(參見例如 U. S. 5，888，819 ;6，004，744 ;5，882，867 ;5，710，028 ;6，027，889 ;6，004，745 ；和 WO US88/02746)。還描述了無(wú)需專門知道變異而檢測(cè)確定核酸序列中序列變異的存在的方法。 其中一些方法是基于對(duì)測(cè)試擴(kuò)增產(chǎn)物與參比擴(kuò)增產(chǎn)物雜交而形成的錯(cuò)配序列的檢測(cè)。通過(guò)利用錯(cuò)配序列的結(jié)合蛋白或者通過(guò)錯(cuò)配序列的化學(xué)或酶裂解可以檢測(cè)這些異源雙鏈體中的錯(cuò)配序列的存在。最近描述了一種基于十字形四鏈DNA結(jié)構(gòu)的分支移位抑制而檢測(cè)序列變異的方法[參見例如 Li shanski，A.等人的 Nucleic Acids Res 28(9) :E42 (2000)]。其它方法是基于對(duì)單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物的特異構(gòu)象的檢測(cè)。單鏈DNA或RNA的第二結(jié)構(gòu)取決于特定的序列。相對(duì)于參比序列的測(cè)試核酸靶物的序列變異導(dǎo)致構(gòu)象的改變。利用與參比擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳遷移率相比而改變的測(cè)試擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳遷移率可檢測(cè)單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物的改變的構(gòu)象。單鏈構(gòu)象的多態(tài)性(SSCP)可廣泛地用于序列變異的檢測(cè)[參見例如Orita M.，等人的 Proc Natl Acad Sci USA 86(8) :2766-70(1989) ；Suzauki, Y.等人的 Oncogene 5(7) 1037-43(1990) ；U. S. 5, 871, 697] 0該方法還可用于基于不同菌株或樣本的特定核酸序列的確定變化而進(jìn)行微生物的鑒定。利用SSCP法的突變檢測(cè)大多采用DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，然而， 還業(yè)已描述了 RNA-SSCP法。依賴于序列的單鏈RNA構(gòu)象被公證和示出，從而導(dǎo)致確定的電泳遷移圖形[參見例如 Sarkar 等人的 Nucleic Acid Research 20(4) :871-878 (1992)和 Gaspar ini 等人的 Hum. Genet. 97 :492-495 (1996)]。雖然可利用探針雜交來(lái)完成確定核酸序列的存在的檢測(cè)及其序列分析，但是當(dāng)測(cè)試樣品中存在低量的(例如較少的分子)核酸序列時(shí)，該方法通常缺乏靈敏度。解決這個(gè)障礙的一個(gè)方案是開發(fā)出用于產(chǎn)生確定核酸序列的多個(gè)拷貝(適用于進(jìn)一步的分析)的方法。這些產(chǎn)生特定核酸序列的多個(gè)拷貝的方法通常被定義為靶擴(kuò)增方法。用于提高雜交分析檢測(cè)靈敏度的其它方法是基于由雜交探針或探針生成多個(gè)產(chǎn)物，例如雜交探針的裂解形成了多個(gè)產(chǎn)物或者相鄰探針的連接反應(yīng)形成一個(gè)獨(dú)特的依賴于雜交的產(chǎn)物。同樣，利用由雜交作用產(chǎn)生的信號(hào)的擴(kuò)增方法例如基于分支DNA探針雜交的方法可獲得靈敏度增大的雜交反應(yīng)。有許多不同種類的核酸擴(kuò)增方法例如指數(shù)式擴(kuò)增法、聯(lián)動(dòng)線性擴(kuò)增法、基于連接反應(yīng)的擴(kuò)增法和基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增法。指數(shù)式核酸擴(kuò)增法的一個(gè)例子是已經(jīng)在許多出版物中公開的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)[參見例如Mullis等人的Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51 :263-273(1986)；Mullis K.等人的 ΕΡ201,184 ；Mullis 等人的 U. S. 4，582，788 ；Erlich 等人的 EP50，424，EP84，796，EP258，017，EP237，362 ;以及 Saiki R.等人的 U. S. 4，683，194]。聯(lián)動(dòng)線性擴(kuò)增法公開在Wallace等人的U.S. 6，027，923中?；谶B接反應(yīng)的擴(kuò)增法的例子是連接擴(kuò)增反應(yīng)(LAR)[由Wu等人在Genomics 4 =560(1989)中公開]和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[在申請(qǐng)?zhí)枮?320308B1的歐洲專利申請(qǐng)中公開]。不同的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增法公開在 U. S. 5，766，849 和 5，654，142 ;還有 Kwoh 等人的 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 1173(1989)和 Ginergeras 等人的 W088/10315 中。最普遍使用的靶擴(kuò)增方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，該方法是基于以下幾個(gè)步驟的多次循環(huán)變性；兩個(gè)寡核苷酸引物的雜交，每一個(gè)雜交到靶鏈的相反鏈上；以及由核苷酸聚合酶產(chǎn)生的引物延伸，從而生成靶鏈的多個(gè)雙鏈拷貝。業(yè)已描述了許多不同種類的PCR，并且該方法被用于DNA或RNA核酸序列的擴(kuò)增、測(cè)序、突變分析及其它分析。采用單個(gè)引物的基于熱循環(huán)的方法也已經(jīng)得到描述(參見例如U. S. 5，508，178 ； 5, 595,891 ;5，683，879 ;5，130, 238 ;以及 5，679，512)。引物可以是 DNA/RNA 嵌合引物(正如U. S. 5，744，308中所公開的)。依賴于熱循環(huán)的其它方法是連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)和相關(guān)修復(fù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RCR)。通過(guò)在不同溫度下的多次保溫循環(huán)即熱循環(huán)或者在一個(gè)溫度下保溫(等溫過(guò)程) 可完成靶核酸的擴(kuò)增。熱穩(wěn)定核酸修飾酶的發(fā)現(xiàn)業(yè)已使核酸擴(kuò)增技術(shù)得到快速發(fā)展[參見Saiki等人的Science 239 :487 (1988)]。熱穩(wěn)定核酸修飾酶例如DNA及RNA聚合酶、連接酶、核酸酶及類似物可用于依賴于熱循環(huán)和等溫?cái)U(kuò)增法這兩種方法。在Fraiser等人的 U. S. 5，648，211 ；Cleuziat 等人的 U. S. 5，824，517 ;以及 Walker 等人的 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 :392-396(1992)公開了等溫方法例如鏈置換擴(kuò)增(SDA)。其它等溫靶擴(kuò)增方法是基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增法，其中RNA聚合酶啟動(dòng)子序列在擴(kuò)增的早期階段并入引物延伸產(chǎn)物中(W089/01050)，而其它靶序列或靶互補(bǔ)序列通過(guò)轉(zhuǎn)錄步驟和DNA/RNA雜交中間產(chǎn)物中的RNA鏈的消化而被擴(kuò)增(參見例如U. S. 5，169，766和4，786，600)。這些方法包括轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、自動(dòng)維持序列擴(kuò)增(3SR)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)，以及這些方法的變型。[參見例如 Guatelli 等人的 Proc. Na t I. Acad. Sci. U. S. A. 87 :1874-1878 (1990)； U. S. 5，766，849 (TMA);以及5，654，142 (NASBA)]。其它擴(kuò)增方法利用模板切換寡核苷酸 (TSOs)和封閉寡核苷酸。例如，U. S. 5，679，512 以及 Patel 等人的 Proc. Nat I. Acad. Sci. U. S. A. 93 =2969-2974(1996)中公開了采用嵌合DNA引物的模板切換擴(kuò)增法，而Laney等人的U. S. 5，679，512中公開了封閉寡核苷酸。等溫靶擴(kuò)增方法無(wú)需熱循環(huán)器，并由此容易適合于公共的儀器平臺(tái)。然而，以前描述的等溫靶擴(kuò)增方法有幾個(gè)缺陷。依據(jù)SDA法的擴(kuò)增需要存在用于確定限制酶的位置，從而可限制其適用性。另一方面，需要聚合酶啟動(dòng)子序列并入由引物生成的擴(kuò)增物以及易于產(chǎn)生非特異擴(kuò)增的過(guò)程限制了基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法例如NASBA和TMB。而且，還沒(méi)有很好地掌握由基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法擴(kuò)增DNA靶物的機(jī)理。目前的擴(kuò)增方法的另一缺陷是，前一擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)測(cè)試樣品的潛在污染，從而導(dǎo)致樣品中發(fā)生非靶特異擴(kuò)增。該缺陷是公知的難題，是靶擴(kuò)增技術(shù)的動(dòng)力結(jié)果和擴(kuò)增產(chǎn)物的形成，是擴(kuò)增的底物。業(yè)已描述了不同的在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束時(shí)或者在靶擴(kuò)增開始前對(duì)測(cè)試樣品進(jìn)行去污染的方法。另外，也描述了利用物理方式防范測(cè)試溶液。所有這些解決方案都是不方便的，并且增加了核酸測(cè)試在公共實(shí)驗(yàn)室設(shè)置中的復(fù)雜性。另外，采用熱循環(huán)過(guò)程的擴(kuò)增方法具有的另一缺陷是較長(zhǎng)的滯后次數(shù)，這是熱循環(huán)封閉所必需的，以便達(dá)到每一循環(huán)的“靶”溫度。結(jié)果，利用熱循環(huán)過(guò)程實(shí)施的擴(kuò)增反應(yīng)需要大量時(shí)間來(lái)達(dá)到反應(yīng)完成化。因此，需要克服這些缺陷的改進(jìn)的核酸擴(kuò)增方法。此處所提供的本發(fā)明滿足了這個(gè)需要并具有其它益處。此處所提到的所有參考文獻(xiàn),包括專利申請(qǐng)和公開文本都作為參考全部并入本文。本發(fā)明的描述本發(fā)明提供了用于多核苷酸擴(kuò)增的方法和組合物，以及這些擴(kuò)增方法的應(yīng)用。因此，本發(fā)明一方面提供了與靶多核苷酸序列互補(bǔ)的多核苷酸序列的擴(kuò)增方法， 該方法包括(a)用組合引物雜交包括靶序列的單鏈DNA模板，所述的組合引物包括RNA部分和3’DNA部分；(b)使包括終止多核苷酸序列的多核苷酸任意雜交到模板的5’區(qū)域(相對(duì)于組合引物與模板的雜交)；(c)用DNA聚合酶延伸組合引物；(d)用一種酶裂解退火組合引物的RNA部分，該酶從RNA/DNA上裂解RNA，以便通過(guò)鏈置換使另一組合引物可與模板雜交并重復(fù)弓I物延伸，由此產(chǎn)生靶序列的互補(bǔ)序列的多個(gè)拷貝。另一方面，本發(fā)明提供了用于擴(kuò)增靶多核苷酸序列的方法，該方法包括(a)用組合引物雜交包括靶序列的單鏈DNA模板，所述的組合引物包括RNA部分和3’ DNA部分；(b) 使包括終止多核苷酸序列的多核苷酸任意雜交到模板的5’區(qū)域(相對(duì)于組合引物與模板的雜交)；(c)用DNA聚合酶延伸組合引物；(d)用一種酶裂解退火組合引物的RNA部分，該酶從RNA/DNA上裂解RNA，以便通過(guò)鏈置換使另一組合引物可與模板雜交并重復(fù)引物延伸， 由此產(chǎn)生被置換的引物延伸產(chǎn)物；(e)在以下條件使包括前啟動(dòng)子的多核苷酸與雜交到被置換的引物延伸產(chǎn)物上的區(qū)域雜交即該條件使轉(zhuǎn)錄將由RNA聚合酶產(chǎn)生，以便產(chǎn)生包括與置換引物延伸產(chǎn)物互補(bǔ)的序列的RNA轉(zhuǎn)錄物，由此產(chǎn)生靶序列的多個(gè)拷貝。此處描述了用于本發(fā)明方法的組合引物的不同實(shí)施例。例如，在一些實(shí)施例中，組合引物的RNA部分是相對(duì)于3’ DNA部分的5’部分。在另一些實(shí)施例中，該5’ RNA部分鄰近3’ DNA部分。對(duì)于此處所描述的方法，可以使用一個(gè)或多個(gè)組合引物。此處還描述了包括終止序列的多核苷酸的不同示例性實(shí)施例。在一些實(shí)施例中， 包括終止序列的多核苷酸是模板切換寡核苷酸(TSO)，其可以(但不是必需的)包含一個(gè)或多個(gè)修飾以便加強(qiáng)對(duì)模板的結(jié)合。因此，在一些實(shí)施例中，TSO包括在雜交到模板上的區(qū)域中的修飾，其中在一系列給定的條件下，與無(wú)修飾點(diǎn)的TSO相比，該TSO更緊密地結(jié)合到該區(qū)域上。此處提供了合適的修飾的例子。在一些實(shí)施例中，包括終止序列的多核苷酸是封閉序列，象TS0，可以包含一個(gè)或多個(gè)修飾以便加強(qiáng)對(duì)模板的結(jié)合。因此，在一些實(shí)施例中，封閉物序列包括雜交到模板上的區(qū)域中的修飾，其中在一系列給定的條件下，與無(wú)修飾的封閉劑相比，該封閉劑更緊密地結(jié)合到該區(qū)域上。此處提供了合適的修飾的例子。本文描述了可用于這些方法及組合物的酶。例如，裂解RNA的酶可以是RNaseH。在一些方面，TSO具有前啟動(dòng)子功能并包括雜交到置換引物延伸產(chǎn)物上的區(qū)域 (可以也可以不鄰近啟動(dòng)子)。在其它實(shí)施例中，包括前啟動(dòng)子的多核苷酸具有一個(gè)3’端區(qū)域，該區(qū)域雜交到被置換的引物延伸產(chǎn)物上，由此被置換的延伸產(chǎn)物的DNA聚合酶延伸， 產(chǎn)生發(fā)生轉(zhuǎn)錄的雙鏈啟動(dòng)子。在一些實(shí)施例中，包括前啟動(dòng)子的多核苷酸是ΡΤ0。這些方法可用于擴(kuò)增任何DNA靶物(包括例如基因組DNA和cDNA)。一個(gè)或多個(gè)步驟可以合并和/或按順序?qū)嵤?經(jīng)常是以任何順序，只要所需的產(chǎn)物能夠形成即可)。本發(fā)明還提供了采用(通常是分析)本發(fā)明擴(kuò)增方法的產(chǎn)物的方法，例如測(cè)序和檢測(cè)序列變異。因此，一方面，本發(fā)明提供了測(cè)序靶核苷酸序列的方法，該方法包括(a)用組合引物雜交包括靶序列的單鏈DNA模板，所述的組合引物包括RNA部分和3’DNA部分；(b)使包括終止多核苷酸序列的多核苷酸任意雜交到模板的5’區(qū)域(相對(duì)于組合引物與模板的雜交)；(c)用DNA聚合酶及dNTPs與dNTP類似物(可是標(biāo)記的也可以是未標(biāo)記的)的混合物延伸組合引物，以便在標(biāo)記或未標(biāo)記的dNTP類似物摻入時(shí)終止引物的延伸；(d)用一種酶裂解退火組合引物的RNA部分，該酶從RNA/DNA雜交體上裂解RNA，以便通過(guò)鏈置換使另一組合引物可與模板雜交并重復(fù)引物延伸，由此產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的靶序列的互補(bǔ)序列的多個(gè)拷貝；(e)分析步驟(a)至⑷的產(chǎn)物，以便測(cè)定序列。另一方面，本發(fā)明提供了用于測(cè)序靶核苷酸序列的方法，該方法包括(a)用組合引物雜交包括靶序列的單鏈DNA模板，所述的組合引物包括RNA部分和3’DNA部分；(b)使包括終止多核苷酸序列的多核苷酸任意雜交到模板的5’區(qū)域(相對(duì)于組合引物與模板的雜交)；(c)用DNA聚合酶延伸組合引物；(d)用一種酶裂解退火組合引物的RNA部分，該酶從RNA/DNA上裂解RNA，以便通過(guò)鏈置換使另一組合引物可與模板雜交并重復(fù)引物延伸，由此產(chǎn)生被置換的引物延伸產(chǎn)物；(e)在以下條件使包括5’端的前啟動(dòng)子的多核苷酸與雜交到置換引物延伸產(chǎn)物上的區(qū)域雜交即該條件使轉(zhuǎn)錄利用rNTPs與rNTP類似物(可是標(biāo)記的也可以是未標(biāo)記的)的混合物由RNA聚合酶產(chǎn)生，以便產(chǎn)生包括與置換引物延伸產(chǎn)物互補(bǔ)的序列的RNA轉(zhuǎn)錄物，并且在標(biāo)記或未標(biāo)記的rNTP類似物摻入時(shí)終止轉(zhuǎn)錄，由此產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的靶序列的多個(gè)拷貝；(f)分析步驟(a)至(e)的產(chǎn)物，以便測(cè)定序列。
在一些方面，本發(fā)明提供了鑒定或分析靶序列的方法。這些方面是基于組合引物的RNA部分并因此這些結(jié)果反映與靶物的相應(yīng)區(qū)域有關(guān)的信息，如果互補(bǔ)或充分互補(bǔ)，該靶物可雜交到組合引物的RNA部分上。與在參比靶序列上實(shí)施的相同擴(kuò)增反應(yīng)所得到的產(chǎn)物的量相比，該產(chǎn)物的量可指示出序列的存在或缺少，而由此進(jìn)一步指示出野生型、突變型或等位變異的存在或缺少。本文描述了不同的序列檢測(cè)實(shí)施例。于是，例如本發(fā)明提供了檢測(cè)靶多核苷酸序列的一個(gè)區(qū)域中的突變的方法，該方法包括實(shí)施本文所描述的擴(kuò)增方法， 其中靶多核苷酸序列的這個(gè)區(qū)域?qū)?yīng)于組合引物的RNA部分，而靶多核苷酸的突變導(dǎo)致可檢測(cè)的擴(kuò)增產(chǎn)物少，這是與由參比模板所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的量相比而言，而該參比模板包括與組合引物的RNA部分對(duì)應(yīng)的不包含突變體的區(qū)域。在這些實(shí)施例中，與由參比模板產(chǎn)生的擴(kuò)增相比，由鏈置換產(chǎn)生的擴(kuò)增減少了，而該參比模板包括與組合引物的RNA部分對(duì)應(yīng)的不包含突變體(與組合引物的RNA部分相比而言)的區(qū)域。這樣，本發(fā)明提供了鑒定靶多核苷酸中感興趣的序列的方法，該方法包括實(shí)施本發(fā)明的擴(kuò)增方法，其中組合引物的RNA部分的序列是公知的，并且(a)與由參比模板所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的量相比，由模板所產(chǎn)生的可檢測(cè)的擴(kuò)增產(chǎn)物的量少，該參比模板包括與組合引物的RNA部分互補(bǔ)的一個(gè)區(qū)域，從而指示出，靶多核苷酸不包括與組合引物的RNA部分互補(bǔ)的序列，并且是與組合引物的RNA部分互補(bǔ)的序列相對(duì)應(yīng)的序列變異體；或者(b)與由參比模板所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的量相比，由模板所產(chǎn)生的可檢測(cè)的擴(kuò)增產(chǎn)物的量更大，該參比模板不包括與組合引物的RNA部分互補(bǔ)的區(qū)域，從而指示出，靶多核苷酸包括與組合引物的RNA部分互補(bǔ)的序列，并且不是與組合引物的RNA部分互補(bǔ)的序列相對(duì)應(yīng)的序列變異體。在一個(gè)實(shí)施例中，組合引物的RNA部分的序列包括野生型序列，并且感興趣的序列的特征在于可測(cè)定野生型序列的存在或缺少。在另一實(shí)施例中，組合引物的RNA部分的序列包括突變型序列，并且感興趣的序列的特征在于可測(cè)定突變型序列的存在或缺少。在又一實(shí)施例中，組合引物的RNA部分的序列包括等位序列，并且感興趣的序列的特征在于可測(cè)定等位序列的存在或缺少。在其它方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)靶多核苷酸中突變(或者在一些方面，是鑒定一個(gè)序列)的方法，該方法包括(a)實(shí)施本文所描述的擴(kuò)增方法；以及(b)為單鏈構(gòu)象分析該方法的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中與參比單鏈多核苷酸相比，構(gòu)象上的差別指示出靶多核苷酸中的突變。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供了檢測(cè)靶多核苷酸突變(或者在一些方面，是鑒定一個(gè)序列)的方法，該方法包括為單鏈構(gòu)象分析本文所描述的任何方法的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中與參比單鏈多核苷酸相比，構(gòu)象上的差別指示出靶多核苷酸中的突變(或者在一些方面，鑒定靶序列)。在其它方面，本發(fā)明提供了制備微陣列的方法，該方法包括(a)實(shí)施本文所描述的擴(kuò)增方法；以及(b)將擴(kuò)增產(chǎn)物固定到固相底物上，從而制成擴(kuò)增產(chǎn)物的微陣列。在其它實(shí)施例中，微陣列是如下生成的通過(guò)利用本文所描述的任何方法將擴(kuò)增產(chǎn)物固定到固相底物上，從而制成擴(kuò)增產(chǎn)物的微陣列。正如本文所描述的，這些應(yīng)用的任一種都采用了這些擴(kuò)增方法(包括不同組分以及這些任一組分的不同實(shí)施方式)的任一種類。例如，所用的組合引物可具有鄰近3’DNA 部分的5’ RNA部分。本發(fā)明還提供了用于本文所描述的擴(kuò)增方法的組合物、藥盒、復(fù)合物、反應(yīng)混合物和包括不同組分(以及這些組分的不同組合)的系統(tǒng)。一方面，例如，本發(fā)明提供了包括組合引物的組合物，所述組合弓I物包括3 ’ DNA部分和5 ’ RNA部分。在一些實(shí)施例中，5 ’ RNA部分鄰近3’ DNA部分。在又一些實(shí)施例中，5’ RNA部分是大約5-大約20個(gè)核苷酸，而3’ DNA 部分是大約5-大約15個(gè)核苷酸。另一方面，本發(fā)明提供了包括TSO的組合物，其中TSO在雜交到模板的區(qū)域中包括一個(gè)修飾，并且在一系列給定的條件下，與沒(méi)有修飾的TSO相比， 該TSO更緊密地結(jié)合到該區(qū)域中。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物包括本文所描述的任何組合引物以及TS0。在又一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了包括本文所描述的任何組合引物及本文所描述的任何封閉序列的組合物，這些組合物包括含有可增強(qiáng)對(duì)模板的結(jié)合的修飾的組分。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供了包括本文所描述的任何組合引物以及PTO的組合物。另一方面，本發(fā)明提供了包括本文(還參見對(duì)這些不同復(fù)合物示意性描繪的附圖)所描述的任何復(fù)合物(通常被認(rèn)為是相對(duì)于最終擴(kuò)增產(chǎn)物的中間體)的組合物。例如， 本發(fā)明提供了包括以下組分的復(fù)合物的組合物(a)模板鏈；以及(b)組合引物，所述組合引物包括3’DNA部分和5’RNA部分。該RNA部分可以是5’位置并且與DNA部分鄰近。在一些實(shí)施例中，該復(fù)合物還包括具有終止序列(可以是例如TSO或一個(gè)封閉序列)的多核苷酸。在一些實(shí)施例中，該復(fù)合物還包括ΡΤ0。另一方面，本發(fā)明提供了含有本文所描述的組分的不同組合的反應(yīng)混合物(或者是包括反應(yīng)混合物的組合物)。例如，本發(fā)明提供的反應(yīng)混合物包括(a)多核苷酸模板; (b)包括3’DNA部分和RNA部分的組合引物；以及(c)DNA聚合酶。正如本文所描述的，任一組合引物都可以在反應(yīng)混合物(或者多個(gè)組合引物)中，包括在3’DNA部分附近具有5’RNA 部分的組合引物。該反應(yīng)混合物還進(jìn)一步包括能夠從RNA/DNA雜交體中裂解DNA的酶(例如RNaseH)。本發(fā)明的反應(yīng)混合物還可包括任一具有本文所述的終止序列的多核苷酸以及包含前啟動(dòng)子和雜交到置換引物延伸產(chǎn)物上的區(qū)域的多核苷酸，還有RNA聚合酶。本發(fā)明的反應(yīng)混合物還可包括PTO。另一方面，本發(fā)明提供了用于實(shí)施本文所述方法的藥盒。這些藥盒在合適的包裝內(nèi)并且一般(但不是必需的)包含適當(dāng)?shù)恼f(shuō)明，而且這些藥盒含有用于擴(kuò)增方法的一種或多種組分。例如，本發(fā)明提供的藥盒包括具有3’ DNA部分和RNA部分(可以在5’位置并且還鄰近3’DNA部分)的組合引物。藥盒中的組合引物可以是本文中描述的任何組合引物。該藥盒還可以含有諸如以下這些組分的任一種(a)包含終止多核苷酸序列的多核苷酸；(b)包含前啟動(dòng)子的多核苷酸；(c)本文所描述的酶的任一種，例如能夠從RNA/DNA雜交體中裂解DNA的酶(例如RNaseH);以及(d)包含前啟動(dòng)子和雜交到置換引物延伸產(chǎn)物上的區(qū)域的多核苷酸。另一方面，本發(fā)明提供了用于本文所述的擴(kuò)增方法的系統(tǒng)。例如，本發(fā)明提供了用于擴(kuò)增靶多核苷酸序列或其補(bǔ)體的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括(a)包括3’DNA部分和RNA部分的組合引物；(b)DNA聚合酶；以及(c)能夠從RNA/DNA雜交體中裂解DNA的酶(例如RNaseH)。 組合引物可以是本文所述的任何一種(或多種)，包括在3’ DNA部分附近具有5’ RNA部分的組合引物。附圖的簡(jiǎn)要描述圖IA-C以圖示法表示出一個(gè)組合引物等溫線性擴(kuò)增的過(guò)程。圖2A-2C以圖示法表示出利用模板切換多核苷酸序列的一個(gè)增強(qiáng)等溫線性核酸擴(kuò)增過(guò)程(包括轉(zhuǎn)錄)。圖3A-3D以圖示法表示出利用封閉序列組分的一個(gè)增強(qiáng)組合引物等溫線性核酸擴(kuò)增過(guò)程(包括轉(zhuǎn)錄)。圖4以圖示法表示出利用一個(gè)引物等溫線性核酸擴(kuò)增過(guò)程檢測(cè)模板序列中的突變?！癤”表示在與組合引物RNA部分互補(bǔ)的位置上的靶DNA的突變。如圖所示，當(dāng)存在突變時(shí)靶核酸的擴(kuò)增被封閉。圖5繪出了合成DNA靶物的線性等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物的溴化乙錠染色的PAGE凝膠。圖6繪出了 DNA擴(kuò)增產(chǎn)物與特異性探針雜交的PAGE分析的放射自顯影圖。圖7繪出了對(duì)由重疊延伸產(chǎn)生的s sRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行比較的溴化乙錠染色的 PAGE凝膠。圖8繪出了對(duì)用3’ -封閉PTO和不用3’ -封閉PTO的線性等溫?cái)U(kuò)增進(jìn)行比較的溴化乙錠染色的PAGE凝膠。圖9繪出了雜交到由來(lái)自E. coli基因組DNA的J基因序列的等溫線性擴(kuò)增產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物上的探針的的放射自顯影圖。

圖10繪出了利用三個(gè)不同設(shè)計(jì)的組合引物產(chǎn)生的線性等溫?cái)U(kuò)增RNA產(chǎn)物的溴化乙錠染色的PAGE凝膠。實(shí)施本發(fā)明的方式本發(fā)明提供了用于擴(kuò)增多核苷酸序列的方法、組合物及藥盒。該方法通常包括使用RNA/DNA組合引物、任選地終止序列，以及在采用轉(zhuǎn)錄的實(shí)施例中還使用前啟動(dòng)子寡核苷酸序列。作為總述，如下實(shí)施這些擴(kuò)增方法組合RNA/DNA引物形成用于復(fù)制靶序列的基礎(chǔ)。在一些實(shí)施例中，終止序列通過(guò)沿靶鏈轉(zhuǎn)換或封閉進(jìn)一步的復(fù)制而提供了復(fù)制終點(diǎn)的基礎(chǔ)。如下所述，在一些實(shí)施例中，包括終止序列的多核苷酸是模板切換寡核苷酸(TSO)，它包括互補(bǔ)得不足以雜交到模板鏈上的序列(除了互補(bǔ)得足以進(jìn)行雜交的序列之外)；在其它實(shí)施例中，終止序列包括互補(bǔ)得足以雜交到模板鏈上的初級(jí)序列。DNA聚合酶起到從該初級(jí)序列復(fù)制靶序列的作用。從RNA/DNA雜交體上裂解RNA的酶(例如RNa seH)從該雜交體上裂解(除去)RNA序列，留下適于和另一組合引物結(jié)合的模板鏈上的序列。另一鏈由 DNA聚合酶產(chǎn)生,然后置換以前復(fù)制的鏈,從而生成置換延伸產(chǎn)物。包括前啟動(dòng)子和雜交到置換引物延伸產(chǎn)物(可以是例如模板切換寡核苷酸或前啟動(dòng)子模板寡核苷酸)上的區(qū)域的多核苷酸，包括互補(bǔ)得足以雜交到置換延伸產(chǎn)物的3’端的序列，從而可結(jié)合到置換引物延伸產(chǎn)物上。啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄(通過(guò)依賴于DNA的RNA聚合酶)，從而生成有義DNA產(chǎn)物。因此，本發(fā)明提供了對(duì)靶多核苷酸序列進(jìn)行至少一次復(fù)制的方法(通常是擴(kuò)增靶多核苷酸序列的方法)，該方法包括對(duì)以下組分進(jìn)行組合和反應(yīng)(a)包括靶序列的單鏈靶多核苷酸；(b)包括RNA部分和3’ DNA部分的組合引物；(c)DNA聚合酶；(d)脫氧核糖核苷三磷酸或合適的類似物；(e)從RNA/DNA雙鏈體上裂解RNA的酶(例如RNaseH)；以及(f) 通常(但是任意地)，包括終止序列的多核苷酸，例如本文所描述的任一種，其包括雜交到模板多核苷酸上的一部分(或區(qū)域)。如果還采用基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增(參見下文)，則使用終止序列。該組合服從適當(dāng)?shù)臈l件，以便(a)組合引物(并且任意地，包括終止序列的多核苷酸)雜交到模板上；(b)由組合引物產(chǎn)生的引物延伸，從而形成雙鏈體；(C)RNaseH從RNA/DNA雙鏈體上裂解組合引物的RNA ； (d)另一組合引物雜交到模板上，并且產(chǎn)生引物延伸(由DNA聚合酶介導(dǎo))的另一循環(huán)，從而置換已經(jīng)由模板復(fù)制的鏈。任意地，在能夠發(fā)生置換鏈轉(zhuǎn)錄的條件下，以下組分也包括在擴(kuò)增反應(yīng)中(與以上所列出的那些組分同時(shí)或分別加入)(e)包括前啟動(dòng)子序列(如本文所述，可以是許多方式中的任何一種)和雜交到置換引物延伸產(chǎn)物上的區(qū)域的多核苷酸；(f)核糖核苷三磷酸或適當(dāng)?shù)念愃莆?；以?g)RNA聚合酶。以下提供了與本發(fā)明方法的不同組分有關(guān)的細(xì)節(jié)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了測(cè)序核酸(DNA或RNA)的方法。對(duì)于這些測(cè)序方法，使用標(biāo)記或未標(biāo)記的適當(dāng)dNTPs (或者rNTPs，當(dāng)采用基于轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增的實(shí)施例時(shí))。因此，本發(fā)明提供了測(cè)序靶核苷酸序列的方法(包括上述那些方法)，其中使用標(biāo)記或未標(biāo)記的作為引物延伸終止物的dNTPs和dNTP，和/或標(biāo)記或未標(biāo)記的作為引物延伸終止物的 rNTPs和rNTP，并且如下所述，分析擴(kuò)增產(chǎn)物，以便得到序列信息。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供了檢測(cè)核酸序列突變和/或鑒定一個(gè)或多個(gè)靶序列的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，利用本發(fā)明的方法、采用組合引物、基于擴(kuò)增靶多核苷酸的能力檢測(cè)靶多核苷酸突變的存在或缺少，引物的RNA部分也含有或缺少突變序列。在另一實(shí)施例中，擴(kuò)增產(chǎn)物用于利用特異性探針通過(guò)雜交而檢測(cè)突變。在又一實(shí)施例中，擴(kuò)增產(chǎn)物用于檢測(cè)和/或鑒定靶多核苷酸中的單鏈構(gòu)象多態(tài)性。在又一實(shí)施例中，本發(fā)明提供了利用本發(fā)明線性或加強(qiáng)線性核酸擴(kuò)增方法的擴(kuò)增產(chǎn)物制備核酸(DNA或RNA)微陣列的方法。以下提供了使用本文所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的其它方法。本發(fā)明的擴(kuò)增方法的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的擴(kuò)增方法比核酸擴(kuò)增的其它方法具有幾個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)。引物模板的形成、引物的延伸和以前產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物的置換取決于由核糖核酸酶活性導(dǎo)致的雜交引物的 RNA部分的裂解。這樣，引物延伸產(chǎn)物缺少引物的5’最大部分。因此，由延伸產(chǎn)物與模板切換寡核苷酸或啟動(dòng)子模板寡核苷酸的復(fù)合而產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在其3’端并不包含與引物的這一部分互補(bǔ)的序列。于是，擴(kuò)增產(chǎn)物不能雜交到用于生產(chǎn)性擴(kuò)增的引物上，從而使本發(fā)明的擴(kuò)增方法不能進(jìn)行由于以前擴(kuò)增反應(yīng)生成的產(chǎn)物的污染而造成的非特異擴(kuò)增。這個(gè)特性使其明顯區(qū)別于其它公知的靶擴(kuò)增方法例如PCR、NASBA以及類似方法，并且使本發(fā)明的方法適合于臨床實(shí)驗(yàn)室、高流通量的試驗(yàn)場(chǎng)地以及類似場(chǎng)所所用的公共開口平臺(tái)。為了進(jìn)一步實(shí)施靶核酸序列的擴(kuò)增，利用核糖核酸酶如Rnase H裂解雜交及延伸形式的組合引物的RNA部分的獨(dú)特需求，導(dǎo)致DNA靶物的不相容擴(kuò)增。這樣，在過(guò)量mRNA的存在下，本發(fā)明的方法可用于基因組靶物的擴(kuò)增。該特性對(duì)于準(zhǔn)確定量基因劑量是有用的。 當(dāng)測(cè)試靶核酸序列是RNA時(shí)，首先轉(zhuǎn)錄該靶物，從而生成能夠用本發(fā)明的方法擴(kuò)增的cDNA。本發(fā)明的方法還可以相對(duì)于模板的高準(zhǔn)確度擴(kuò)增靶核酸。每一擴(kuò)增產(chǎn)物是輸入模板DNA (在線性擴(kuò)增方法中)的靶序列或者輸入模板DNA與輸入模板DNA (在增強(qiáng)的線性擴(kuò)增方法中)的引物延伸產(chǎn)物的直接拷貝。本發(fā)明的方法無(wú)需可以等溫實(shí)施擴(kuò)增的熱循環(huán)。該特性具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括易于實(shí)施自動(dòng)化以及適合于高流通量的擴(kuò)增和/或核酸的分析。例如，通過(guò)進(jìn)行等溫反應(yīng)而使基于本發(fā)明的擴(kuò)增方法的測(cè)序方法簡(jiǎn)化了。業(yè)已報(bào)道的其它方法需要熱循環(huán)，以便使引物延伸產(chǎn)物與靶序列分離。等溫反應(yīng)比熱循環(huán)提供的反應(yīng)快并適于在微型化裝置中進(jìn)行靶核酸的測(cè)序。本發(fā)明方法的另一優(yōu)點(diǎn)是，只需要一個(gè)引物。利用一個(gè)引物來(lái)提供導(dǎo)致模板核酸擴(kuò)增的單向引物延伸。這避免了與使用引物對(duì)有關(guān)的許多缺陷，例如設(shè)計(jì)成本和制備兩個(gè)引物、需要提前知道模板核酸內(nèi)的其它序列區(qū)域，以及增加了擴(kuò)增產(chǎn)物是非特異引發(fā)結(jié)果的可能性。本發(fā)明的線性等溫?cái)U(kuò)增方法還適用于檢測(cè)核酸靶物、定量確定的核酸序列以及制備用于確定核酸序列的探針。本發(fā)明的方法可用于定性檢測(cè)核酸序列、定量測(cè)定靶核酸序列的量、檢測(cè)確定序列變異的存在(正如基因分型所需的)以及測(cè)序。按照本發(fā)明方法的擴(kuò)增產(chǎn)物是單鏈的并且易于用不同的公知核酸檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)。本發(fā)明的方法還用于核酸序列的多重分析。也就是說(shuō)，不同的靶序列可以在一個(gè)反應(yīng)混合物中同時(shí)擴(kuò)增。不同的靶序列可以是部分單基因組DNA，或者代表不同核酸靶物的特定序列，這些不同的靶序列可以存在于一個(gè)測(cè)試樣品中。例如，本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)一個(gè)生物樣品中不同病原體的存在。同樣，可以在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)測(cè)定一個(gè)基因組樣品中的不同多態(tài)位置。應(yīng)該理解,關(guān)于本文所述的所有實(shí)施例，正如通常“包括(comprising) ”組分或方面，本發(fā)明還包括“基本上包括(consist essentially of) ”這些組分或方面的實(shí)施例。本發(fā)明還包括由這些組分或方面“組成(consistof)”的實(shí)施例。這可用于本文所述的所有實(shí)施例?！慵夹g(shù)本發(fā)明的實(shí)踐除非另外指出，否則其將利用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些都在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)。文獻(xiàn)[例如 “Molecular Cloning A Laboratory Manual，，，second edition(Sambrook 等人，1989)； “Ologonucleotide Synthesis”(M.J. Gait, ed. ,1984) ;“Animal Cell Culture”(R. I. Freshney, ed. , 1987) ;“Methods in Enzymology(Academic Pres s, Inc. ) ；uCurrent Protocols in Molecular Biology，，(F. M. Ausubel 等人，eds. , 1987) ;“PCR :The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis 等人，eds. , 1994)]中充分解釋了這些技術(shù)?？梢岳帽绢I(lǐng)域內(nèi)公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備本發(fā)明中所用的引物、寡核苷酸和多核苷酸。定義本文中所用的“靶序列”是需要擴(kuò)增的感興趣的多核苷酸序列。該靶序列可以是公知的也可以是未知的，以其實(shí)際序列定義。通常，本文所用的“模板”是含有靶核苷酸序列的多核苷酸。在一些例子中，術(shù)語(yǔ)“靶序列” “模板DNA” “模板多核苷酸” “靶核酸” “靶多核苷酸”以及這些術(shù)語(yǔ)的變型可以互換使用。本文所用的“擴(kuò)增”通常是指產(chǎn)生所需序列的多個(gè)拷貝的過(guò)程。“多個(gè)拷貝”是指至少兩個(gè)拷貝。“拷貝”并不必需指與模板序列的完全互補(bǔ)性或同一性。例如，拷貝可以包括核苷酸類似物例如脫氧肌苷/序列變異(例如通過(guò)包括雜交但不是互補(bǔ)到模板上的序列的引物而介入的序列變異)和/或擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生的序列誤差。本文可以互換使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何長(zhǎng)度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核苷酸、核糖核苷酸、修飾核苷酸或堿基，和/或它們的類似物，或者任何能夠利用DNA或RNA聚合酶摻入聚合物中的底物。多核苷酸可包括修飾核苷酸例如甲基化核苷酸及其類似物。如果存在核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾，那么可以在結(jié)合到聚合物中之前或之后給予該修飾?？梢杂梅呛塑账峤M分來(lái)中斷核苷酸序列。還可以在聚合之后諸如通過(guò)與標(biāo)記組分結(jié)合來(lái)修飾多核苷酸。其它類型的修飾包括例如“帽結(jié)構(gòu)(cap)”、用類似物對(duì)一個(gè)或多個(gè)自然界出現(xiàn)的核苷酸進(jìn)行取代、核苷酸間修飾例如用不帶電的鍵(諸如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺、N-氯甲苯基丙酯等)以及用帶電的鍵(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)進(jìn)行的修飾、含有側(cè)組成成分例如蛋白質(zhì)(例如核酸酶、毒素、抗體、 信號(hào)肽、Ply-L-賴氨酸)的修飾、用嵌入劑(例如丫啶、補(bǔ)骨脂素等)進(jìn)行的修飾、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的修飾、含有烷基化劑的修飾、用修飾鍵 (例如α-端基異構(gòu)核酸等)以及多核苷酸的未修飾形式進(jìn)行的修飾。另外，一般存在于糖類中的任一羥基都可以由例如膦酸酯基、磷酸酯基取代，或者由標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，或者被激活以便將加成鍵配備給加成核苷酸，或者結(jié)合到固相載體上。5’和3’末端OH可以被磷酸化或被胺或1-20碳原子的有機(jī)加帽基團(tuán)組成成分取代。其它羥基也可以被衍生成標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)。多核苷酸還含有本領(lǐng)域內(nèi)一般公知的核糖或脫氧核糖糖類的類似形式，包括例如2’ -O-甲基_、2’ -O-烯丙基、2’ -氟-或2’ -疊氮基-核糖、碳環(huán)糖類似物、α -端基異構(gòu)糖、差向異構(gòu)糖(例如阿拉伯糖、木糖或來(lái)蘇糖)、批喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無(wú)環(huán)類似物以及無(wú)堿基核苷類似物(例如甲基核苷)。一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯鍵可由可變連接基取代。這些可變連接基包括(但不限于)以下這些實(shí)施例在這些實(shí)施例中磷酸酯可以由 P (O) S ( “硫代”)、P (S) S ( “二硫代” )、(O) NR2 ( “酰氨化”)、P (O) R、P (O) 0R，、CO 或 CH2 ( “ 甲酰化”)取代，其中每個(gè)R或R’是獨(dú)立的H或者是取代或非取代烷基(1-20個(gè)C)，這些烷基任意地包含醚(-0-)鍵、芳香基、鏈烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或環(huán)氧樹脂基。并不是多核苷酸中的所有鍵都必需一樣。前面的描述可用于本文所參考的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。本文所用的“寡核苷酸”通常是指短的、一般是單鏈、一般是合成的多核苷酸，這些多核苷酸的長(zhǎng)度通常(但不是必需的)少于大約200個(gè)核苷酸。本發(fā)明的寡核苷酸包括組合引物、TSO、PTO和封閉劑序列。術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”和“多核苷酸”不相互排斥。以上對(duì)多核苷酸的描述可以同等或完全用于寡核苷酸?！耙铩币话闶嵌痰膯捂湺嗪塑账?，一般具有游離的3’_0H，可以利用靶序列通過(guò)雜交結(jié)合到潛在地存在于樣品中的靶物上，然后促進(jìn)與靶物互補(bǔ)的多核苷酸的聚合。本文所互換使用的“終止多核苷酸序列”或“終止序列”是，相對(duì)于包括靶序列的模板起終止由DNA聚合酶進(jìn)行的DNA復(fù)制的作用的多核苷酸序列。末端序列包括一般在距離端點(diǎn)(位點(diǎn))的5’部位雜交到模板上的部分(或區(qū)域)。雜交部分可以也可以不包含整個(gè)末端序列。本文提供了合適的末端多核苷酸序列(例如封閉劑序列和TSOs)的例子。本文所互換使用的“封閉劑序列”或“封閉序列”是一個(gè)末端序列的例子，并且是指這樣的寡核苷酸即該寡核苷酸一般在距離端點(diǎn)(位點(diǎn))的5’部位高親和性結(jié)合到模板核酸上，而且相對(duì)于包括靶序列的模板起終止由DNA聚合酶進(jìn)行的DNA復(fù)制的作用。對(duì)于由DNA聚合酶所進(jìn)行的衍生，可以或無(wú)需封閉其3’端。本文所互換使用的“終止位點(diǎn)”或“終止點(diǎn)”是指，在聚合(通常是引物延伸)或模板切換終止之前由DNA聚合酶最后復(fù)制的模板位點(diǎn)、點(diǎn)或區(qū)域。例如，就TSO而言，它是在將模板從模板多核苷酸切換到TSO的未雜交部分之前與引物延伸產(chǎn)物的3’端互補(bǔ)的靶序列中的部位或區(qū)域。本文所用的“原啟動(dòng)子序列”和“前啟動(dòng)子序列”是指以雙鏈形式能夠介導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄的單鏈DNA序列區(qū)。在一些上下文中，“原啟動(dòng)子序列”、“原啟動(dòng)子”、“前啟動(dòng)子序列”、 “前啟動(dòng)子”、“啟動(dòng)子序列”和“啟動(dòng)子”可以互換使用。文本所用的“模板切換寡核苷酸(TSO) ”是指，包括這樣一個(gè)部分(或區(qū)域)的寡核苷酸即該部分在距離引物延伸的端點(diǎn)的5’位置可雜交到模板上并且能夠在由DNA聚合酶進(jìn)行的引物延伸過(guò)程中起模板切換的作用。TSOs在本領(lǐng)域內(nèi)一般是公知的?！澳０迩袚Q” 是指模板核酸中的變化，一般是在引物延伸的一個(gè)循環(huán)過(guò)程中從靶核酸變?yōu)門SO的未雜交部分。本文所用的“前啟動(dòng)子模板寡核苷酸(PTO) ”是指包括前啟動(dòng)子序列和一個(gè)部分 (一般是3’部分，可雜交到引物延伸產(chǎn)物的3’區(qū)域)的寡核苷酸。前啟動(dòng)子序列和雜交部分可以相同、不同或者是寡核苷酸的重疊核苷酸。與第二序列“對(duì)應(yīng)”的第一序列(例如組合引物的RNA部分)是指，第一序列具有與第二序列具有顯著的序列同源性。該術(shù)語(yǔ)通常在檢測(cè)突變或鑒定靶物序列的上下文中使用。對(duì)于“抑制”是指與參比物相比降低或減小活性、能力和/或量?！皬?fù)合物”是若干組分的組裝。復(fù)合物可以是穩(wěn)定的也可以不是穩(wěn)定的，并且可以直接或間接檢測(cè)。例如，正如本文所述，可以推斷出反應(yīng)的某些給定組分以及反應(yīng)產(chǎn)物的種類、復(fù)合物的存在。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，復(fù)合物一般是相對(duì)于最終擴(kuò)增產(chǎn)物的中間體。多核苷酸或寡核苷酸的本文可互換使用的“部分”或“區(qū)域”是，兩個(gè)或更多堿基的連續(xù)序列。在其它實(shí)施例中，一個(gè)區(qū)域或部分是3、5、10、15、20、25連續(xù)核苷酸中的至少任何一個(gè)?！班徑绷硪恍蛄械膮^(qū)域、部分或序列直接靠近那個(gè)區(qū)域、部分或序列。例如，鄰近組合引物的5’ DNA部分的RNA部分直接靠近那一區(qū)域。對(duì)于該例的圖示說(shuō)明，參見附圖 IA-C?！胺磻?yīng)混合物”是若干組分的集合，在合適的條件下它們發(fā)生反應(yīng)，從而形成一復(fù)合物(可以是中間體)和/或產(chǎn)物。除非另外指出，否則“A”、“an”和“the”包括多種形式?！鞍?Comprising) ” 是指包括(including)?！霸试S”事件(例如雜交、鏈延伸以及類似事件)發(fā)生的條件或者適合于事件發(fā)生的條件，或者“合適的”條件是，不阻止這樣的事件發(fā)生的條件。于是，這些條件允許、增強(qiáng)、 易于和/或有助于事件的實(shí)施。這些條件是本領(lǐng)域內(nèi)公知的并在本文中有所描述，而且取決于核苷酸序列的性質(zhì)、溫度以及緩沖劑的條件。這些條件還取決于需要什么事件(例如雜交、裂解、鏈延伸或轉(zhuǎn)錄)。本文所用的序列“突變”是指與參比序列相比，感興趣的序列中的任何序列變異。 參比序列可以是野生型序列或者希望感興趣的序列與之比較的序列。序列突變包括單個(gè)核苷酸的變異，或者序列中多個(gè)核苷酸的變異，這是由于諸如取代、缺失或插入的緣故。單個(gè)核苷酸的多態(tài)性也是一種序列突變(正如本文所用的)。
本文所用的“單鏈構(gòu)象多態(tài)性”和“SSCP” 一般是指受其特異性核酸序列影響時(shí)的單鏈核酸的特定構(gòu)象。單鏈多核苷酸的序列變異(例如一個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入) 導(dǎo)致單鏈多核苷酸構(gòu)象的變化或多態(tài)性。利用本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法(例如用凝膠電泳、毛細(xì)管電泳測(cè)定的電泳遷移率，和/或易被內(nèi)切核酸酶消化)通?？梢詸z測(cè)、鑒定和/或區(qū)分多核苷酸的構(gòu)象。在本文中可互換使用的“微陣列”和“陣列”是指將核苷酸序列收集在集中部位的布置。陣列可以在固相底物(例如玻片)或者半固相底物(例如硝酸纖維素膜)上。核苷酸序列可以是DNA、RNA或者這些序列的任何變換。術(shù)語(yǔ)“3” 一般是指，從相同多核苷酸或寡核苷酸的另一區(qū)域或部位算起的多核苷酸或寡核苷酸3’(下游)的一個(gè)區(qū)域或部位。術(shù)語(yǔ)“5” 一般是指，從相同多核苷酸或寡核苷酸的另一區(qū)域或部位算起的多核苷酸或寡核苷酸5’(上游)的一個(gè)區(qū)域或部位。術(shù)語(yǔ)“3，-DNA部分”、“3，-區(qū)域”、“3，-RNA部分”和“3，-RNA區(qū)域”是指，位于多核苷酸或寡核苷酸3’端之上的多核苷酸或寡核苷酸的部分或區(qū)域，并且可以也可以不包括固定到相同多核苷酸或寡核苷酸3’最大核苷酸上的一個(gè)或多個(gè)3’最大核苷酸或組成成分。3’最大核苷酸優(yōu)選的是大約I-大約20個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的是大約3-大約18個(gè)核苷酸，甚優(yōu)選的是大約5-大約15個(gè)核苷酸。術(shù)語(yǔ)“5，-DNA部分”、“5，-區(qū)域”、“5，-RNA部分”和“5，-RNA區(qū)域”是指，位于多核苷酸或寡核苷酸5’端之上的多核苷酸或寡核苷酸的部分或區(qū)域，并且可以也可以不包括固定到相同多核苷酸或寡核苷酸5’最大核苷酸上的一個(gè)或多個(gè)5’最大核苷酸或組成成分。5’最大核苷酸優(yōu)選的是大約I-大約20個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的是大約3-大約18個(gè)核苷酸，甚優(yōu)選的是大約5-大約15個(gè)核苷酸。“檢測(cè)”包括檢測(cè)的任何方式(包括直接和間接檢測(cè))。例如，可以直接或間接觀察“可檢測(cè)的較少”產(chǎn)物，并且該術(shù)語(yǔ)指示出任何減少(包括沒(méi)有產(chǎn)物)。同樣，“可檢測(cè)更多的”產(chǎn)物是指任何增加，而無(wú)論該產(chǎn)物是直接還是間接觀察到的。本發(fā)明方法所用的組分和反應(yīng)條件模板核酸要擴(kuò)增的核酸(NA)靶物包括來(lái)自純化或未純化形式的任何來(lái)源的核酸，它可以是DNA (dsDNA和 ssDNA)或 RNA，包括 tRNA、mRNA、rRNA、線粒體 DNA和 RNA、葉綠體 DNA和 RNA、 DNA-RNA雜交體或以上這些核酸的混合物、基因、染色體、質(zhì)粒、生物材料(例如微生物、細(xì)菌、酵母菌、病毒、類病毒、霉菌、真菌、植物、動(dòng)物、人類)的基因組，以及以上這些核酸的片斷。正如本領(lǐng)域內(nèi)所公知的，RNA靶物的擴(kuò)增需要初始cDNA的合成。DNA-RNA雜交體的擴(kuò)增需要使雜交體變性，以便得到ssDNA，或者變性之后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以便得到cDNA。靶核酸可以僅僅是復(fù)合混合物(例如生物樣品)的一個(gè)微小組分并且利用本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同生物材料中獲得。擴(kuò)增靶核酸序列的最初步驟使得該靶物成為單鏈。如果靶核酸是一個(gè)或多個(gè)雙鏈 DNA,則最終步驟是靶物的變性。變性步驟可以是熱變性或本領(lǐng)域內(nèi)公知的任何其它方法例如堿處理。如果靶物是RNA，則最終步驟可以是單鏈cDNA的合成。用于由RNA合成cDNA的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。
組合引物本發(fā)明的擴(kuò)增方法使用了包括RNA和DNA部分的單個(gè)組合引物。引物的這個(gè)組合物設(shè)計(jì)對(duì)于通過(guò)新(其它)組合引物的結(jié)合而隨后置換引物延伸產(chǎn)物以及利用聚合酶進(jìn)行的新引物的延伸是極其重要的。另外，引物延伸產(chǎn)物的RNA部分的裂解導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生，該產(chǎn)物不是由組合引物擴(kuò)增的底物(如下所述)。用于本發(fā)明的方法和組合物的組合引物包括至少一個(gè)RNA部分，該部分能夠(a) 不依賴于DNA部分(或多個(gè)DNA部分)與靶核酸上的序列的雜交，而結(jié)合(雜交)到靶核酸 (模板)的序列上；以及(b)當(dāng)與靶DNA雜交時(shí)用核糖核酸酶裂解。組合引物結(jié)合到靶核酸上，從而形成部分異源雙鏈體，其中只有引物的RNA部分在與核糖核酸酶接觸時(shí)被裂解， 而靶鏈依舊，從而使另一組合引物退火。組合引物還包括3’DNA部分，該部分能夠雜交到靶核酸(模板)的一個(gè)序列上，從而其與靶序列(模板)的雜交優(yōu)于由DNA聚合酶從靶核酸中置換出的核酸鏈?；诠奶匦?這些特性影響核酸結(jié)合的親和力，諸如序列長(zhǎng)度和/或同一性，以及雜交條件)可以隨機(jī)地設(shè)計(jì)這些引物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，組合引物的3’ DNA部分與靶核酸中其互補(bǔ)序列的雜交優(yōu)于置換鏈5’端的同源序列與靶核酸的雜交。適合于通過(guò)聚合進(jìn)行延伸的引物的制備是本領(lǐng)域內(nèi)公知的，諸如W099/42618(以及本文所傳到的文獻(xiàn))中所描述的。組合引物包括RNA與DNA(參見上述定義)的組合體， 并且3’端核苷酸是適合于核酸延伸的核苷酸。3’端核苷酸可以是當(dāng)存在于引物中時(shí)由DNA 聚合酶進(jìn)行延伸的任何核苷酸或類似物。通常，3’端核苷酸有3’-0H。合適的引物包括那些包含至少一個(gè)部分的RNA和至少一個(gè)部分的DNA的引物。如用于一個(gè)基因的圖5(示出了用于E. coli J基因擴(kuò)增的不同引物的相對(duì)性能)所示，組合引物可包括5’-RNA部分和 3’ -DNA部分(其中RNA部分臨近3’ -DNA部分)；或者具有RNA部分的5’ -和3’ -DNA部分。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，組合引物包括5’-RNA部分和3’-DNA部分，優(yōu)選的是，其中RNA 部分臨近3’-DNA部分。在另一實(shí)施例中，組合引物包括具有至少一個(gè)RNA部分(即RNA部分在兩個(gè)DNA部分之間)的5’ -和3’ -DNA部分。在又一實(shí)施例中，本發(fā)明的組合弓I物包括3’ -DNA部分和至少一個(gè)RNA部分(即在兩個(gè)DNA部分之間的RNA部分)。在包括3’ -DNA部分和一個(gè)RNA部分的組合引物中的RNA部分的長(zhǎng)度優(yōu)選的是大約I-大約25個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的是大約3-大約20個(gè)核苷酸，甚優(yōu)選的是大約4-大約15 個(gè)核苷酸，最優(yōu)選的是大約5-大約10個(gè)核苷酸。在包括3’-DNA部分和一個(gè)RNA部分的組合引物的一些實(shí)施例中，RNA部分可以是I、3、4、5個(gè)核苷酸中的至少大約任何一個(gè)，并具有 10、15、20、25、30個(gè)核苷酸中的大約任何一個(gè)的上限。在包括5’ -RNA部分和3’ -DNA部分的組合引物中，5’ -RNA部分的長(zhǎng)度優(yōu)選的是大約3-大約25個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的是大約5-大約20個(gè)核苷酸，甚優(yōu)選的是大約7-大約 18個(gè)核苷酸,優(yōu)選的是大約8-大約17個(gè)核苷酸,最優(yōu)選的是大約10-大約15個(gè)核苷酸。 在包括5’ -RNA部分和3’ -DNA部分的組合引物的其它實(shí)施方案中，5’ -RNA部分可以至少大約是3、5、7、8或10個(gè)核苷酸，并大約具有15、17、18或20個(gè)核苷酸的上限。在包括5’ -RNA部分和3’ -DNA部分并且還包括一個(gè)或多個(gè)非5’ -RNA部分的組合引物的實(shí)施例中，非5’-RNA部分優(yōu)選的是具有大約I-大約7個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的是具有大約2-大約6個(gè)核苷酸，最優(yōu)選的是具有大約3-大約5個(gè)核苷酸。在包括5’ -RNA部分和3’ -DNA部分并且還包括一個(gè)或多個(gè)非5’ -RNA部分的組合引物的某些實(shí)施例中，非5’ -RNA 部分可以是2、3、5個(gè)核苷酸中的至少大約任一個(gè)，并具有5、6、7、10個(gè)核苷酸中的大約任一個(gè)上限。在包括5 ’ -RNA部分和3 ’ -DNA部分并且5 ’ -RNA部分臨近3 ’ -DNA部分的組合弓I物的實(shí)施例中，5’-RNA部分的長(zhǎng)度優(yōu)選的是大約3-大約25個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的是大約5-大約20個(gè)核苷酸,甚優(yōu)選的是大約7-大約18個(gè)核苷酸,優(yōu)選的是大約8-大約17個(gè)核苷酸, 最優(yōu)選的是大約10-大約15個(gè)核苷酸。在包括5’ -RNA部分和3’ -DNA部分并且5’ -RNA 部分臨近3’ -DNA部分的組合引物的某些實(shí)施例中，5’ -RNA部分可以至少大約是3、5、7、8 或10個(gè)核苷酸，并大約具有15、17、18或20個(gè)核苷酸的上限。在包括5’-和3’_DNA部分并具有至少一個(gè)間插RNA部分的組合引物中，間插RNA 部分的長(zhǎng)度優(yōu)選的是大約I-大約7個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的是大約2-大約6個(gè)核苷酸，最優(yōu)選的是大約3-大約5個(gè)核苷酸。在包括5’ -和3’ -DNA部分并且具有至少一個(gè)間插RNA部分的組合引物的某些實(shí)施例中，間插RNA部分可以是1、2、3、5個(gè)核苷酸中的至少大約任一個(gè)，并具有5、6、7、10個(gè)核苷酸中的大約任一個(gè)上限。在包括3’ -DNA部分和至少一個(gè)間插 RNA部分的組合引物中間插RNA部分的長(zhǎng)度優(yōu)選的是大約I-大約7個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的是大約2-大約6個(gè)核苷酸，最優(yōu)選的是大約3-大約5個(gè)核苷酸。在包括3’-DNA部分和至少一個(gè)間插RNA部分的組合引物的某些實(shí)施例中，間插RNA部分可以是1、2、3、5個(gè)核苷酸中的至少大約任一個(gè)，并具有5、6、7、10個(gè)核苷酸中的大約任一個(gè)上限。在包括3’ -DNA部分和至少一個(gè)間插RNA部分并且還包括一個(gè)5’ -RNA部分的組合引物中，該5’ -RNA部分優(yōu)選的是具有大約3-大約25個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的是大約5-大約20個(gè)核苷酸，甚優(yōu)選的是大約
7-大約18個(gè)核苷酸，優(yōu)選的是大約8-大約17個(gè)核苷酸，最優(yōu)選的是大約10-大約15個(gè)核苷酸。在包括3’ -DNA部分和至少一個(gè)間插RNA部分并且還包括一個(gè)5’ -RNA部分的組合弓I物的某些實(shí)施例中，5’-RNA部分可以是3、5、7、8、10個(gè)核苷酸中的至少大約任一個(gè)，并具有15、17、18、20個(gè)核苷酸中的大約任一個(gè)上限。在包括3’ -DNA部分和一個(gè)RNA部分的組合引物中，3’ -DNA部分的長(zhǎng)度優(yōu)選的是大約I-大約20個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的是大約3-大約18個(gè)核苷酸，甚優(yōu)選的是大約3-大約 18個(gè)核苷酸，最優(yōu)選的是大約7-大約12個(gè)核苷酸。在包括3’ -DNA部分和一個(gè)RNA部分的組合引物的某些實(shí)施例中，3’ -DNA部分可以是1、3、5、7、10個(gè)核苷酸中的至少大約任一個(gè)，并具有10、12、15、18、20、22個(gè)核苷酸中的大約任一個(gè)上限。在包括3’ -DNA部分和5’ -RNA部分的組合引物中，3’ -DNA部分的長(zhǎng)度優(yōu)選的是大約I-大約20個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的是大約3-大約18個(gè)核苷酸，甚優(yōu)選的是大約5-大約 15個(gè)核苷酸，最優(yōu)選的是大約7-大約12個(gè)核苷酸。在包括3’-DNA部分和5’-RNA部分的組合引物的某些實(shí)施例中，3’-DNA部分可以至少大約是1、3、5、7或10個(gè)核苷酸，并大約具有10、12、15、18、20或22個(gè)核苷酸的上限。在包括5’ -RNA部分和3’ -DNA部分并且還包括一個(gè)或多個(gè)非3’ -DNA部分的組合引物的實(shí)施例中，非3’ -DNA部分優(yōu)選的是具有大約I-大約10個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的是具有大約2-大約8個(gè)核苷酸，最優(yōu)選的是具有大約3’ -大約6個(gè)核苷酸。在包括5’ -RNA部分和3’ -DNA部分并且還包括一個(gè)或多個(gè)非3’ -DNA部分的組合引物的某些實(shí)施例中，非 3’-DNA部分可以是1、2、3、5個(gè)核苷酸中的至少大約任一個(gè)，并具有6、8、10、12個(gè)核苷酸中的大約任一個(gè)上限。在包括5’ -RNA部分和3’ -DNA部分并且5’ -RNA部分臨近3’ -DNA部分的組合引物的實(shí)施例中，3’ -DNA部分的長(zhǎng)度優(yōu)選的是大約I-大約20個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的是大約
3-大約18個(gè)核苷酸，甚優(yōu)選的是大約5-大約15個(gè)核苷酸，最優(yōu)選的是大約7-大約12個(gè)核苷酸。在包括5’ -RNA部分和3’ -DNA部分并且5’ -RNA部分臨近3’ -DNA部分的組合引物的某些實(shí)施例中，3’ -DNA部分可以至少大約是1、3、5、7或10個(gè)核苷酸，并大約具有10、 12、15、18、20或22個(gè)核苷酸的上限。在包括5 ’ -和3 ’ -DNA部分并具有至少一個(gè)間插RNA部分的組合弓丨物中，非3 ’ -DNA 部分的長(zhǎng)度優(yōu)選的是大約I-大約10個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的是大約2-大約8個(gè)核苷酸，最優(yōu)選的是大約3-大約6個(gè)核苷酸。在包括5’ -和3’ -DNA部分并且具有至少一個(gè)間插RNA部分的引物的某些實(shí)施例中，非3’ -DNA部分可以是1、2、3、5個(gè)核苷酸中的至少大約任一個(gè)， 并具有6、8、10、12個(gè)核苷酸中的大約任一個(gè)上限。在包括5’ -和3’ -DNA部分并具有至少一個(gè)間插RNA部分的組合引物中，3’ -DNA 部分的長(zhǎng)度優(yōu)選的是大約I-大約20個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的是大約3-大約18個(gè)核苷酸，甚優(yōu)選的是大約5-大約15個(gè)核苷酸，最優(yōu)選的是大約7-大約12個(gè)核苷酸。在包括5’ -和 3’ -DNA部分并且具有至少一個(gè)間插RNA部分的組合引物的某些實(shí)施例中，3’ -DNA部分可以是1、3、5、7、10個(gè)核苷酸中的至少大約任一個(gè)，并具有10、12、15、18、20、22個(gè)核苷酸中的大約任一個(gè)上限。在包括3’ -DNA部分和至少一個(gè)間插RNA部分的組合引物中非3’ -DNA部分(即除3’ -DNA部分之外的任何DNA)的長(zhǎng)度優(yōu)選的是大約1_大約10個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的是大約2-大約8個(gè)核苷酸，最優(yōu)選的是大約3-大約6個(gè)核苷酸。在包括3’-DNA部分和至少一個(gè)間插RNA部分的組合引物的某些實(shí)施例中，非3’ -DNA部分可以是1、3、5、7、10個(gè)核苷酸中的至少大約任一個(gè)，并具有6、8、10、12個(gè)核苷酸中的大約任一個(gè)上限。在包括3’-DNA部分和至少一個(gè)間插RNA部分的組合引物中，3’ -DNA部分的長(zhǎng)度優(yōu)選的是具有大約I-大約 20個(gè)核苷酸,更優(yōu)選的是大約3-大約18個(gè)核苷酸,甚優(yōu)選的是大約5-大約15個(gè)核苷酸, 最優(yōu)選的是大約7-大約12個(gè)核苷酸。在包括3’ -DNA部分和至少一個(gè)間插RNA部分的組合引物的某些實(shí)施例中，3 ’ -DNA部分可以是I、3、5、7、10個(gè)核苷酸中的至少大約任一個(gè)，并具有10、12、15、18、20、22個(gè)核苷酸中的大約任一個(gè)上限。應(yīng)該理解，不同部分的長(zhǎng)度可以更大或更小，只要在本發(fā)明方法的反應(yīng)條件下合適即可。在一些實(shí)施例中，組合引物的5’ -DNA部分包括引物的5’ -最大核苷酸。在一些實(shí)施例中，組合引物的5’ -RNA部分包括引物的5’最大核苷酸。在其它實(shí)施例中，組合引物的3’ -DNA部分包括引物的3’最大部分。在其它實(shí)施例中，3’ -DNA部分臨近5’ -RNA部分并包括引物(并且5’ -RNA部分包括引物的5’最大部分)的3’最大核苷酸。組合引物的總長(zhǎng)度優(yōu)選的是大約10-大約40個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的是大約15-大約 30個(gè)核苷酸,最優(yōu)選的是大約20-大約25個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施例中，該長(zhǎng)度可以是10、 15,20,25個(gè)核苷酸中的至少大約任一個(gè)，并具有25、30、40、50個(gè)核苷酸中的大約任一個(gè)上限。應(yīng)該理解，該長(zhǎng)度可以更大或更小，只要在本發(fā)明方法的反應(yīng)條件下合適即可。為了獲得雜交(正如本領(lǐng)域內(nèi)所公知和理解的那樣，該雜交依賴于其它因素例如離子強(qiáng)度和溫度)，本發(fā)明方法及組合物中所用的組合引物與靶核酸的互補(bǔ)優(yōu)選的是至少大約60%，更優(yōu)選的是至少大約75%，甚優(yōu)選的是至少大約90%，最優(yōu)選的是至少大約 95%。組合引物的單個(gè)DNA和RNA部分與靶核酸的互補(bǔ)優(yōu)選的是至少大約60%，更優(yōu)選的是至少大約75%，甚優(yōu)選的是至少大約90%，最優(yōu)選的是至少大約95%。正如本文所描述的，在一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中可以使用一個(gè)或多個(gè)組合引物。包括終止多核苷酸序列的多核苷酸在本發(fā)明方法的一些實(shí)施例中，尤其是如果采用基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增，則包括含有終止多核苷酸序列的多核苷酸，以下給出了這種多核苷酸的例子。模板切換寡核苷酸能夠用于本發(fā)明的擴(kuò)增方法的第二寡核苷酸是終止切換寡核苷酸(TSO)。在一個(gè)實(shí)施例中，TSO用作終止序列。在另一實(shí)施例中，TSO用作終止序列并提供一個(gè)前啟動(dòng)子序列。以前描述的基于模板切換寡核苷酸的擴(kuò)增方法受該寡核苷酸濃度的限制，這是由于當(dāng)該方法被設(shè)計(jì)利用一個(gè)引物樣本時(shí)，第二引物的雜交或者同一引物的第二雜交步驟受到抑制。本發(fā)明的方法不受這個(gè)限制。與以前描述的利用TSOs的方法相反，按照本發(fā)明的方法,為了擴(kuò)增可以使用高濃度的模板切換寡核苷酸。這個(gè)特性確保核苷酸有效地雜交到靶鏈上，并使三分子復(fù)合物、用于引物延伸和模板切換的底物的產(chǎn)率最大。該特性的另一作用是使置換引物延伸產(chǎn)物有效雜交到模板切換寡核苷酸上，從而形成用于RNA聚合酶的底物(正如所描述的)。TSO包括能夠雜交到靶物上的3’部分和被設(shè)計(jì)在聚合(參見圖2A-C)過(guò)程中用于鏈切換的5’部分。起鏈切換作用的TSO設(shè)計(jì)在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的，例如以前在Patel等人的 Proc. Nat，I Acad. Sci. USA 1996,93 :2969-2974 中所描述的。3’部分在模板多核苷酸的位置或區(qū)域的部位5’處雜交到模板上，而該位置或區(qū)域在將模板從模板多核苷酸切換到TSO( “終止位點(diǎn)”)的未雜交部分之前與引物延伸產(chǎn)物的 3’端互補(bǔ)。在一實(shí)施例中，在5’和3’位點(diǎn)緊鄰TSO的雜交與未雜交部分之間的接點(diǎn)的TSO 區(qū)段中彼此互補(bǔ)的短序列的存在，促進(jìn)了鏈切換。沒(méi)有理論根據(jù)，一種解釋是，在引物延伸產(chǎn)物被延伸到與TSO(提供TSO雜交部分的置換)雜交的靶核酸部分中時(shí)，引物延伸產(chǎn)物的 3’端包括能夠結(jié)合到緊鄰TSO的雜交與未雜交部分之間的接點(diǎn)的TSO區(qū)段中互補(bǔ)短序列上的短序列。這通過(guò)增加引物延伸產(chǎn)物切換到作為模板的TSO尾部的可能性而增加了模板切換的效率。短互補(bǔ)序列的長(zhǎng)度優(yōu)選的是大約3-大約20個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的是大約5-大約 15個(gè)核苷酸,最優(yōu)選的是大約7-大約10個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施例中，該長(zhǎng)度是1、3、5、7、 10個(gè)核苷酸中的至少大約任一個(gè)，并且具有10、15、20、25個(gè)核苷酸的大約任一個(gè)的上限。 應(yīng)該理解，該長(zhǎng)度可以更大或更小，只要在本發(fā)明方法的反應(yīng)條件下適合即可。在一些實(shí)施例中，TSO的5’部分包括一個(gè)序列(此后稱作“前啟動(dòng)子序列”)，該序列被設(shè)計(jì)用于形成RNA聚合酶的雙鏈啟動(dòng)子。TSO的這個(gè)實(shí)施例既用作終止序列又提供了一個(gè)啟動(dòng)子模板。在該實(shí)施例中，TSO的前啟動(dòng)子序列用作一個(gè)前啟動(dòng)子序列(通常與模板TSO的前啟動(dòng)子序列互補(bǔ))摻入到引物延伸產(chǎn)物中的模板。包括可雜交到引物延伸產(chǎn)物的前啟動(dòng)子序列上的前啟動(dòng)子序列的TSO的隨后雜交，導(dǎo)致能夠利用合適的RNA聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的雙鏈啟動(dòng)子的形成。使模板DNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列正如獲得和/或制備它們的方法一樣，在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。優(yōu)選的是，選擇前啟動(dòng)子，以便使所用的特定RNA聚合酶具有最佳的轉(zhuǎn)錄活性。對(duì)這種選擇極為重要的是，即，被特定RNA聚合酶所特別支持的特定啟動(dòng)子序列在本領(lǐng)域內(nèi)也是公知的。例如，用于由依賴于RNA聚合酶和SP6的T7DNA所進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。啟動(dòng)子序列可來(lái)自于原核或真核源。在一個(gè)實(shí)施例中，啟動(dòng)子序列鄰近被設(shè)計(jì)用來(lái)使由所用的RNA聚合酶進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)或更加最佳化的序列。在一些實(shí)施例中，該序列與靶核酸不相關(guān)(即基本上不發(fā)生雜交)。當(dāng)來(lái)自可操縱鍵接到所述序列上的啟動(dòng)子的聚合酶的轉(zhuǎn)錄活性大于來(lái)自沒(méi)有如此鍵接的啟動(dòng)子的聚合酶的轉(zhuǎn)錄活性時(shí)，可發(fā)生更優(yōu)的轉(zhuǎn)錄。優(yōu)化轉(zhuǎn)錄所需的這個(gè)序列通常在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的，正如以前在諸如U. S. 5，766，849和5，654，142中對(duì)依賴于RNA聚合酶的不同DNA的描述一樣。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，雜交到模板DNA上的TSO的3’部分(包括雜交到靶物上的整個(gè)3’部分)片段被固定到模板DNA上，以便由起引物延伸作用的聚合酶進(jìn)行的TSO 置換被基本上或至少充分地抑制。用于實(shí)施這種固定的適當(dāng)方法包括本領(lǐng)域內(nèi)公知的技術(shù)，例如使用含有G-閉合雜環(huán)修飾點(diǎn)[在Flanagan等人的Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999，96 (7) =3513-8中有所描述]的胞嘧啶類似物；以及鎖匙核酸[在例如Kumar等人的 Bioorg. Med. Chem Lett. 1998,8 (16) :2219-22 ；以及 Wahlestedt 等人的 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000,97(10) :5633-8中有所描述]。其它適當(dāng)?shù)姆椒òㄊ褂?在合適時(shí))具有高GC含量和/或交聯(lián)的序列。獲得增強(qiáng)固定的這些方法的任一種都可以單獨(dú)使用或聯(lián)合使用。如果聚合酶將模板從靶核酸鏈切換到TSO的未雜交部分，則TSO的置換基本上或充分地被抑制到引物延伸過(guò)程的至少大約25%，優(yōu)選的是至少大約50%，更優(yōu)選的是至少大約75%，最優(yōu)選的是至少大約90%。如果擴(kuò)增方法就所需產(chǎn)物的量而言可導(dǎo)致滿意的結(jié)果，那么也可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)指示出基本或充分抑制TSO的置換。通常，在給定條件下，“被修飾的” TSO相對(duì)于沒(méi)有如此修飾的TSO更緊密地結(jié)合到模板上。雜交到靶核酸鏈上的TSO部分的長(zhǎng)度優(yōu)選的是大約15-50個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的是大約20-45個(gè)核苷酸，最優(yōu)選的是大約25-40個(gè)核苷酸。在其它實(shí)施例中，該長(zhǎng)度是以下10、 15、20、25、30中的至少大約任一個(gè)；并且少于以下35、40、45、50、55中的大約任一個(gè)。應(yīng)該理解，該長(zhǎng)度可以更大或更小，只要在本發(fā)明方法的反應(yīng)條件下合適即可。雜交到靶核酸鏈上的TSO部分與靶核酸上其預(yù)計(jì)結(jié)合的序列的互補(bǔ)優(yōu)選的是至少大約25%，更優(yōu)選的是至少大約50%，甚優(yōu)選的是至少大約75%，最優(yōu)選的是至少大約90%。封閉劑序列在一些實(shí)施例中，由封閉劑序列提供引物延伸終止序列。該封閉劑序列是多核苷酸(通常是合成的多核苷酸)，而且是單鏈并包括一個(gè)與靶序列5’位置的靶核酸片段雜交 (優(yōu)選的是互補(bǔ))的序列，而靶序列的5’位置與引物延伸產(chǎn)物(“終止位點(diǎn)”)的3’端互補(bǔ)。該封閉劑包括以親和性(優(yōu)選的是高親和性)結(jié)合到靶核酸上的核苷酸，從而該封閉劑序列將引物延伸過(guò)程中由DNA聚合酶進(jìn)行的置換抑制到引物延伸過(guò)程的優(yōu)選的30%多，更優(yōu)選的是50%多，甚優(yōu)選的是75%多，最優(yōu)選的是90%多。封閉劑多核苷酸的長(zhǎng)度及組合應(yīng)該是，在本發(fā)明方法的條件下能夠避免多余隨機(jī)的非特異性雜交。封閉劑多核苷酸的長(zhǎng)度優(yōu)選的是大約3-大約30個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的是大約5-大約25個(gè)核苷酸，甚優(yōu)選的是大約8-大約20個(gè)核苷酸，最優(yōu)選的是大約10-大約15個(gè)核苷酸。在其它實(shí)施例中，該封閉劑多核苷酸是以下3、5、8、10、15中的至少大約任一個(gè)；并且少于以下20、25、30、35中的大約任一個(gè)。應(yīng)該理解，該長(zhǎng)度可以更大或更小，只要在本發(fā)明方法的反應(yīng)條件下合適即可。 該封閉劑多核苷酸與靶核酸上其預(yù)計(jì)結(jié)合的序列的互補(bǔ)優(yōu)選的是至少大約25%，更優(yōu)選的是至少大約50%，甚優(yōu)選的是至少大約75%，最優(yōu)選的是至少大約90%。在一實(shí)施例中，封閉劑序列包括一個(gè)片段，該片段雜交到靶DNA上并被固定到靶 DNA上，從而由起引物延伸作用的聚合酶所進(jìn)行的封閉劑序列的置換基本或至少充分被抑制。用于實(shí)施這種固定并測(cè)定置換基本或充分被抑制的合適方式正如以上對(duì)本發(fā)明方法的 TSO所描述的。在一實(shí)施例中，該封閉劑多核苷酸不能有效地用作核酸延伸(即從封閉劑的延伸被減小或抑制)的引物。封閉劑多核苷酸封閉引物的技術(shù)包括阻止由DNA聚合酶將核苷酸加成到引物的3’端的任何技術(shù)。這些技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的，包括例如3’羥基的取代或修飾，或者被修飾核苷酸例如雙脫氧核苷酸在封閉劑多核苷酸的3’ -最大部位的摻入, 這不能錨定由DNA聚合酶進(jìn)行的核苷酸的加成。包括前啟動(dòng)子和一個(gè)雜交到置換引物延伸產(chǎn)物上的區(qū)域的多核苷酸一些實(shí)施例采用了包括前啟動(dòng)子和一個(gè)雜交到被置換引物延伸產(chǎn)物上的區(qū)域的多核苷酸。在一些實(shí)施例中，該多核苷酸是含有前啟動(dòng)子序列的TSO(如上所述)。在其它實(shí)施例中，該前啟動(dòng)子序列被包含在PTO中(如下所述)。前啟動(dòng)子模板寡核苷酸在一些實(shí)施例中，這些方法使用了由前啟動(dòng)子模板寡核苷酸(PTO)提供的用于轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列。用于本發(fā)明方法和組合物的PTO是單鏈多核苷酸(一般是DNA)，它包括被設(shè)計(jì)用于形成RNA聚合酶的ds啟動(dòng)子的前啟動(dòng)子序列以及一個(gè)能夠雜交到引物延伸產(chǎn)物的3’端的部分。在一優(yōu)選實(shí)施例中，該前啟動(dòng)子序列位于寡核苷酸的5’部分并且雜交序列位于寡核苷酸的3’部分。在一實(shí)施例中，最典型的是，啟動(dòng)子和雜交序列是不同的序列。在另一實(shí)施例中，啟動(dòng)子和雜交序列在相同序列處重疊。在又一實(shí)施例中，啟動(dòng)子和雜交序列是相同序列，并因此而在PTO的相同部位上。在PTO與引物延伸產(chǎn)物雜交導(dǎo)致包括突出端(不與被置換引物延伸產(chǎn)物雜交的PTO的5’端，典型地包括整個(gè)或部分前啟動(dòng)子序列)的雙鏈體的那些實(shí)施例中，DNA聚合酶充入突出端，從而產(chǎn)生能夠通過(guò)適當(dāng)?shù)腞NA聚合酶起轉(zhuǎn)錄作用的雙鏈啟動(dòng)子。使模板DNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的并且在上文已經(jīng)有所描述。優(yōu)選的是，選擇啟動(dòng)子序列，以便使所用的特定RNA聚合酶具有最佳的轉(zhuǎn)錄活性。對(duì)這種選擇極為重要的是，即，被特定RNA聚合酶所特別支持的特定啟動(dòng)子序列在本領(lǐng)域內(nèi)也是公知的。例如，用于由依賴于RNA聚合酶和SP6的T7DNA所進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。啟動(dòng)子序列可來(lái)自于原核或真核源。在一些實(shí)施例中，PTO在前啟動(dòng)子序列與一個(gè)能夠雜交到引物延伸產(chǎn)物3’端上的部分之間包括一個(gè)間插序列?？梢愿鶕?jù)經(jīng)驗(yàn)確定間插序列的合適長(zhǎng)度，并且該長(zhǎng)度可以至少是大約1、2、4、6、8、10、12、15個(gè)核苷酸。還可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定與間插序列相同的合適序列，并且相對(duì)于序列的遺漏，該序列被設(shè)計(jì)用來(lái)優(yōu)選地(但不是必需的)增強(qiáng)擴(kuò)增的程度。在一實(shí)施例中，間插序列是一個(gè)被設(shè)計(jì)用來(lái)使由所用的RNA聚合酶進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)或更優(yōu)的序列。通常，該序列與靶核酸不相關(guān)(即基本上不發(fā)生雜交)。當(dāng)來(lái)自可操縱鍵接到所述序列上的啟動(dòng)子的聚合酶的轉(zhuǎn)錄活性大于來(lái)自沒(méi)有如此鍵接的啟動(dòng)子的聚合酶的轉(zhuǎn)錄活性時(shí)，可發(fā)生更優(yōu)的轉(zhuǎn)錄。優(yōu)化轉(zhuǎn)錄所需的這個(gè)序列通常在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的，正如以前在諸如U. S. 5，766，849和5，654，142中對(duì)依賴于RNA聚合酶的不同DNA的描述一樣，并且還可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定該序列。在另一實(shí)施例中，PTO包括一個(gè)是前啟動(dòng)子序列的5’部分的序列，即PTO包括位于前啟動(dòng)子序列的5’處的其它核苷酸(可以是也可以不是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列)。通常(但不是必需的)，該序列不與引物延伸產(chǎn)物雜交。在一實(shí)施例中，PTO不能有效地用作核酸延伸的引物。用于PTO封閉引物的技術(shù)包括阻止由DNA聚合酶進(jìn)行的核苷酸加成到PT03’端的任何技術(shù)。這些技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的，包括例如3’羥基的取代或修飾，或者被修飾核苷酸例如雙脫氧核苷酸在PTO的 3’ -最大部位的摻入，這不能錨定由DNA聚合酶進(jìn)行的核苷酸的加成。還可以利用標(biāo)記物或特異性結(jié)合對(duì)中的一員的小分子(例如生物素)來(lái)封閉3’端。與置換引物延伸產(chǎn)物雜交的PTO部分的長(zhǎng)度優(yōu)選的是大約5-大約50個(gè)核苷酸， 更優(yōu)選的是大約10-大約40個(gè)核苷酸，甚優(yōu)選的是大約15-大約35個(gè)核苷酸，最優(yōu)選的是大約20-大約30個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施例中，雜交部分是以下3、5、10、15、20中的至少大約任一個(gè)；并且少于以下30、40、50、60中的大約任一個(gè)。雜交部分與靶核酸上其預(yù)計(jì)結(jié)合的序列的互補(bǔ)優(yōu)選的是至少大約25%，更優(yōu)選的是至少大約50%，甚優(yōu)選的是至少大約 75 %，最優(yōu)選的是至少大約90 %。DNA聚合酶、核糖核酸酶以及RNA聚合酶本發(fā)明的擴(kuò)增方法采用以下酶DNA聚合酶、核糖核酸酶(例如RNase H)，以及任意的依賴于DNA的RNA聚合酶。用于本發(fā)明方法及組合物的DNA聚合酶按照本發(fā)明的方法能夠有效延伸組合引物。因此，優(yōu)選的聚合酶是能夠沿核酸模板延伸核酸引物的聚合酶，而模板至少由脫氧核苷酸主要構(gòu)成。聚合酶應(yīng)該能夠?qū)⒑怂徭湉亩嗪塑账嶂脫Q到置換鏈被結(jié)合的程度，并且通常， 聚合酶展示(即與沒(méi)有這么大鏈置換能力的其它聚合酸相比)的更大的鏈置換能力是優(yōu)選的。優(yōu)選的是，DNA聚合酶對(duì)在雜交到核酸鏈上的寡核苷酸3’端的結(jié)合具有較高的親和力。 優(yōu)選的是，DNA聚合酶不具有實(shí)質(zhì)的切割活性。優(yōu)選的是，聚合酶具有極少或無(wú)5’- > 3’外切核酸酶活性，從而對(duì)引物、終止或引物延伸多核苷酸的降解最小。通常，外切核酸酶活性取決于諸如pH、鹽濃度、模板是單鏈還是雙鏈等等這些因素(所有這些因素都是本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員熟知的)。已經(jīng)缺乏5’- > 3’外切核酸酶活性的突變DNA聚合酶在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的并且適用于本文所述的擴(kuò)增方法。用于本發(fā)明方法及組合物的合適的DNA聚合酶包括在U. S. 5648211和5744312中所公開的那些物質(zhì)，這些物質(zhì)包括exo_Yent (New England Biolabs)、exo-Deep Vent (New England Biolabs)、Bst (BioRad)、exo-Pfu (Stratagene)、 Bca (Panvera)、測(cè)序級(jí)Taq(Promega),以及來(lái)自熱厭氧菌和熱亞硫酸的熱穩(wěn)性DNA聚合酶。 優(yōu)選的是，DNA聚合酶將引物延伸產(chǎn)物從模板核酸中置換出聚合酶與引物延伸產(chǎn)物的5’端之間的接觸量的至少大約25%，更優(yōu)選的是至少大約50%，甚優(yōu)選的是至少大約75%，最優(yōu)選的是至少大約90%。在一些實(shí)施例中，使用具有鏈置換活性的熱穩(wěn)DNA聚合酶是優(yōu)選的。這些聚合酶在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的，諸如U. S. 5744312(以及本文所提到的參考文獻(xiàn))中所述的。優(yōu)選的是，DNA聚合酶具有極少或無(wú)校正活性。用于本發(fā)明方法及組合物的核糖核酸酶能夠裂解RNA/DNA雜交體中的核糖核苷酸。優(yōu)選的是，無(wú)論鄰近待裂解的核糖核苷酸的核苷酸的同一性與類型如何，核糖核酸酶都裂解核糖核苷酸。優(yōu)選的是，核糖核酸酶不依賴于序列的同一性進(jìn)行裂解。用于本發(fā)明方法及組合物的適當(dāng)?shù)暮颂呛怂崦傅睦邮潜绢I(lǐng)域內(nèi)公知的，包括核糖核酸酶H(RNase H).用于本發(fā)明方法及組合物的依賴于DNA的RNA聚合酶在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的?？梢允褂迷嘶蛘婧司酆厦?。這些例子包括T7、T3和SP6 RNA聚合酶。通常，所選擇的RNA聚合酶能夠從由本文所述的TSO或PTO提供的啟動(dòng)子序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。通常，RNA聚合酶是依賴于DNA的聚合酶，優(yōu)選的是，只要啟動(dòng)子區(qū)域是雙鏈的，其就能夠從單鏈DNA模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄?？傊景l(fā)明方法及組合物所用的酶并不對(duì)所述方法及組合物的核酸組分產(chǎn)生實(shí)質(zhì)降解。反應(yīng)條件及檢測(cè)用于完成本發(fā)明方法的合適反應(yīng)介質(zhì)和條件是按照本發(fā)明的方法能夠使核酸擴(kuò)增。這些介質(zhì)和條件是本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員公知的，并在不同出版物例如U. S. 5，679，512 和W099/42618中有所描述。例如，緩沖劑可以是Tris緩沖劑，雖然只要緩沖劑成分對(duì)本發(fā)明方法的酶組分沒(méi)有抑制就還可以使用其它緩沖劑。PH優(yōu)選的是大約5-大約11，更優(yōu)選的是大約6-大約10，甚優(yōu)選的是大約7-大約9，最優(yōu)選的是大約7. 5-大約8. 5。反應(yīng)介質(zhì)還可以包括二價(jià)金屬離子例如Mg2+或Mn2+，并且游離離子的最終濃度在大約O. 01-大約IOmM 的范圍內(nèi)，最優(yōu)選的是大約l_5mM。反應(yīng)介質(zhì)還可以包括其它鹽(例如KCL)，其可增強(qiáng)介質(zhì)的總離子強(qiáng)度。例如鹽(例如KCL)的范圍優(yōu)選的是大約O-大約IOOmM,更優(yōu)選的是大約
O-大約75mM，最優(yōu)選的是大約O-大約50mM。反應(yīng)介質(zhì)還可以包括能影響擴(kuò)增反應(yīng)性能、 但不是這些方法的酶組分活性所必需的添加劑。這些添加劑包括蛋白質(zhì)(例如BSA)，以及非離子型去污劑(例如NP40和吐溫)。還可以包括能夠使酶活性最大化的試劑例如DTT。 這些試劑在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。只要合適，也可以包括不抑制該方法中所用的RNase活性的RNase抑制劑(例如RNasine)。本發(fā)明方法的任何步驟都可以在相同或不同溫度下進(jìn)行。優(yōu)選的是，等溫實(shí)施反應(yīng)，從而避免了麻煩的熱循環(huán)過(guò)程?？梢栽谑贡景l(fā)明的寡核苷酸 (引物、TS0、封閉劑序列和/或ΡΤ0)與模板多核苷酸雜交并實(shí)質(zhì)上不抑制所用的酶活性的溫度下實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)。該溫度優(yōu)選的是大約25°C -大約85°C，更優(yōu)選的是大約30°C -大約 75°C，最優(yōu)選的是大約37°C -大約70°C。在一些包括RNA轉(zhuǎn)錄的實(shí)施例中，轉(zhuǎn)錄步驟的溫度低于以前步驟的溫度。在這些實(shí)施例中，轉(zhuǎn)錄步驟的溫度優(yōu)選的是大約25°C -大約85°C， 更優(yōu)選的是大約30°C -大約75°C，最優(yōu)選的是大約37°C -大約70°C。能夠用于合成本發(fā)明方法中的引物延伸產(chǎn)物的核苷酸和/或核苷酸類似物(例如脫氧核苷三磷酸)的量?jī)?yōu)選的是大約50-大約2500 μ M，更優(yōu)選的是大約100-大約 2000 μ Μ，甚優(yōu)選的是大約500-大約1700 μ Μ，最優(yōu)選的是大約800-大約1500 μ Μ。在一些實(shí)施例中，包括一個(gè)核苷酸或核苷酸類似物，它們?cè)谝镅由戽溨械拇嬖谠鰪?qiáng)了鏈的置換 (例如通過(guò)產(chǎn)生比常規(guī)AT、CG堿基對(duì)更弱的堿基對(duì))。這些核苷酸或核苷酸類似物包括脫氧肌苷和其它修飾堿，所有這些都是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。能夠用于合成本發(fā)明方法中的RNA轉(zhuǎn)錄物的核苷酸和/或核苷酸類似物(例如脫氧核苷三磷酸)的量?jī)?yōu)選的是大約O. 25-大約6mM，更優(yōu)選的是大約O. 5-大約5mM，甚優(yōu)選的是大約O. 75-大約4mM，最優(yōu)選的是大約
I-大約3mM0本發(fā)明擴(kuò)增反應(yīng)的寡核苷酸組分一般多于待擴(kuò)增的靶核酸序列的數(shù)目。它們是以下10、102、104、106、108、101(1、1012倍于靶核酸的量中的大約或至少大約任一個(gè)。組合引物、TSO、PTO及封閉劑序列的每一個(gè)都可以是以下濃度中的大約或至少大約任一個(gè)50nM、 IOOnM,500ηΜ、ΙΟΟΟηΜ、2500nM、5000nM。在一實(shí)施例中，在擴(kuò)增過(guò)程開始時(shí)同時(shí)加入上述組分。在另一實(shí)施例中，在擴(kuò)增過(guò)程中的適當(dāng)時(shí)間點(diǎn)之前或之后以任何順序加入組分(正如擴(kuò)增反應(yīng)所需和/或所允許的)。 這些時(shí)間點(diǎn)(以下提到其中一些)易于由本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員鑒定。按照本發(fā)明方法用于核酸擴(kuò)增的酶可以在既可以在核酸變性步驟之前加入，也可以在變性步驟或者引物和/或封閉劑序列與靶DNA雜交之后加入，這由其熱穩(wěn)定性和/或本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員所公知的其它特性來(lái)確定。擴(kuò)增反應(yīng)可以在不同的時(shí)間點(diǎn)被終止，并在隨后的時(shí)間被恢復(fù)。所述的時(shí)間點(diǎn)易于由本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員鑒定。終止反應(yīng)的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的，包括例如將反應(yīng)混合物冷卻到能夠抑制酶活性的溫度?；謴?fù)反應(yīng)的方法也是本領(lǐng)域內(nèi)公知的，包括例如將反應(yīng)混合物的溫度升高到使酶激活的溫度。在一些實(shí)施例中，在反應(yīng)恢復(fù)之前或之后補(bǔ)足一種或多種反應(yīng)組分。反之，使反應(yīng)不中斷地進(jìn)行下去(即從開始到結(jié)束)。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)指示出靶序列的存在。定量分析也是切實(shí)可行的。直接或間接檢測(cè)方法(包括定量)在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。例如，通過(guò)將從含有包括靶序列的未知量多核苷酸的測(cè)試樣品擴(kuò)增的產(chǎn)物量與具有包括靶序列的已知量多核苷酸的參比樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行比較，可以測(cè)定測(cè)試樣品中靶序列的量。本發(fā)明的擴(kuò)增方法還被擴(kuò)大到分析序列變異和對(duì)靶核酸進(jìn)行測(cè)序。另外，通過(guò)例如檢查來(lái)自RNA擴(kuò)增產(chǎn)物的翻譯產(chǎn)物，檢測(cè)也是有效的。本發(fā)明的擴(kuò)增方法以下是本發(fā)明擴(kuò)增方法的若干例子。應(yīng)該理解，根據(jù)以上所給出的總的描述，可以實(shí)踐其它不同的實(shí)施例。例如，對(duì)使用一個(gè)組合引物的參考意味著可以使用本文所述的任何組合引物。本發(fā)明一方面，提供了一種用于擴(kuò)增與靶核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的方法。 在該方法中，獲得等溫線性核酸序列的擴(kuò)增。另一方面，提供了一種用于擴(kuò)增靶多核苷酸序列的方法，其中擴(kuò)增產(chǎn)物是有義RNA，該方法有時(shí)稱作“增強(qiáng)”線性擴(kuò)增方法。在一實(shí)施例中，提供了一種基于TSO的增強(qiáng)等溫線性核酸序列擴(kuò)增的方法(此后稱作“方法I”)。在另一實(shí)施例中，提供了一種基于PTO并且是封閉劑序列的增強(qiáng)等溫線性核酸序列擴(kuò)增的方法 (此后稱作“方法2”)。導(dǎo)致互補(bǔ)DNA產(chǎn)物生成的線性核酸擴(kuò)增方法當(dāng)不涉及轉(zhuǎn)錄時(shí)，本發(fā)明的擴(kuò)增方法用于靶核酸序列的等溫線性擴(kuò)增。該方法使用一個(gè)組合引物。在一實(shí)施例中，該方法還采用了終止序列例如方法2中所述的封閉劑序列或者方法I中所述的TS0。以下描述方法I和方法2。由于該線性擴(kuò)增不涉及轉(zhuǎn)錄，因此不包括導(dǎo)致包括用于依賴于DNA的RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列的復(fù)合物形成的組分和步驟。
為了產(chǎn)生確定3’端的產(chǎn)物，加入終止序列(如果使用，則是TSO或封閉劑序列)。 在一些實(shí)施例中，引物結(jié)合位點(diǎn)的模板5’內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)天然序列抑制核酸的聚合，從而使引物延伸終止。這些天然序列是本領(lǐng)域內(nèi)公知的，例如GC豐富序列，或者可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。當(dāng)擴(kuò)增基因組DNA以便提供引物延伸的確定終端時(shí)，使用終止序列尤其是有益的。當(dāng)不需要該特性時(shí)，可以無(wú)需終止序列而完成按照本發(fā)明方法的等溫線性擴(kuò)增。該等溫線性擴(kuò)增還采用兩種酶、一種DNA聚合酶和一種核糖核酸酶(例如RNase H)。圖IA-C示出了對(duì)本發(fā)明的線性等溫核酸擴(kuò)增的示意性描述。類似于如下所述的方法I和2，該線性擴(kuò)增方法被設(shè)計(jì)用來(lái)擴(kuò)增單鏈DNA靶物。當(dāng)待擴(kuò)增的靶物是dsDNA時(shí)，首先使靶物變性，以便產(chǎn)生單鏈靶物。利用本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法 (例如熱或堿處理)可完成靶物的變性。當(dāng)靶物是單鏈RNA(例如mRNA或病毒RNA)時(shí)，利用本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法首先使靶物轉(zhuǎn)錄，以便生成cDNA。如圖IA-C所示，本發(fā)明的線性等溫?cái)U(kuò)增方法包括與以下及圖2A-C和圖3A-D中所述的增強(qiáng)線性擴(kuò)增方法(方法I和2)的初始步驟類似的步驟。首先使組合引物DNA聚合酶、核糖核酸酶(例如RNase H)以及任意的封閉劑序列組分或TSO與靶核酸結(jié)合(如上所述)。在一實(shí)施例中，每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)包括一個(gè)同一序列的組合引物。在另一實(shí)施例中，每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)包括一個(gè)組合引物變異體的混合物，其中該變異體代表兩個(gè)或多個(gè)同源但不同一的序列，并且都能夠與相同的靶核酸序列雜交。該互補(bǔ)優(yōu)選的是至少大約50%，更優(yōu)選的是至少大約75%，最優(yōu)選的是至少大約90%。該實(shí)施例的優(yōu)點(diǎn)包括能夠?qū)⒏信d趣的不同序列引入到引物延伸產(chǎn)物中。在又一實(shí)施例中，每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)包括若干組合引物的混合物，其中引物代表兩個(gè)或多個(gè)低或非同源的不同一的序列，引物優(yōu)選地與不同靶核酸序列或者沿相同的靶核酸鏈進(jìn)行雜交。該實(shí)施例的優(yōu)點(diǎn)包括通過(guò)在一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中對(duì)許多靶核酸樣本進(jìn)行擴(kuò)增而對(duì)靶核酸進(jìn)行多重檢測(cè)和/或分析。圖IA-C示出了一個(gè)包括終止序列的實(shí)施例。組合引物和終止序列(TS0或封閉劑序列組分)與相同的靶鏈雜交，從而形成三分子復(fù)合物xx(圖1A-C)。組合引物的3’ -端利用聚合酶沿靶鏈向上延伸到TSO或封閉劑序列組分雜交的位點(diǎn)，從而產(chǎn)生復(fù)合物XXI (圖 1A-C)。核糖核酸酶(例如RNaseH)裂解復(fù)合物XXI (圖1A-C)的延伸引物的RNA(通常是 5’ -RNA)部分，從而生成復(fù)合物XXII (圖1A-C)。第二組合引物通過(guò)RNA (通常是5’ -RNA) 部分的雜交而與復(fù)合物XXII (圖1A-C)結(jié)合，從而產(chǎn)生復(fù)合物XXIII (圖1A-C)。其次被結(jié)合的組合引物的游離3’部分置換引物延伸產(chǎn)物的5’ -端并與靶物雜交，從而產(chǎn)生復(fù)合物 XXIV (圖1A-C)。組合引物的3’ -端與靶物的雜交通常對(duì)引物延伸產(chǎn)物的5’ -端的雜交是有利的，這是由于引物的被雜交的3’-端是DNA聚合酶結(jié)合的位點(diǎn)，而聚合酶然后又沿靶物延伸引物的3’-端。引物的延伸導(dǎo)致第一引物延伸產(chǎn)物的置換，產(chǎn)生復(fù)合物XXV (圖1A-C)。 重復(fù)該方法，從而產(chǎn)生通常與靶序列互補(bǔ)的多重單鏈DNA置換產(chǎn)物。利用本領(lǐng)域內(nèi)公知的許多檢測(cè)方法的任一種都可容易地檢測(cè)出等溫線性擴(kuò)增方法的單鏈DNA(即置換引物延伸產(chǎn)物)。以前描述了適合于檢測(cè)單鏈核酸分子的不同的同源或異源檢測(cè)方法，包括利用凝膠電泳的尺寸和/或遷移性質(zhì)或者通過(guò)與非特異性探針雜交而進(jìn)行鑒定。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)指示出靶序列的存在。定量分析也是切實(shí)可行的。例如，通過(guò)將從含有未知量的包括靶序列的多核苷酸的測(cè)試樣板中擴(kuò)增的產(chǎn)物的量與具有已知量的包括靶序列的多核苷酸的對(duì)照樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行比較，可以測(cè)定測(cè)試樣品中靶序列的量。 本發(fā)明的擴(kuò)增方法還可擴(kuò)大到分析序列變異以及測(cè)序靶核酸。希望產(chǎn)生模板多核苷酸的每個(gè)拷貝的至少I、至少10、至少大約100、至少大約 1000、至少大約105、至少大約107、至少大約109、至少大約IO12的互補(bǔ)拷貝，由此相對(duì)于模板多核苷酸的每個(gè)拷貝，導(dǎo)致增強(qiáng)至少I、至少10、至少大約100、至少大約1000、至少大約 105、至少大約107、至少大約109、至少大約IO12倍。導(dǎo)致有義RNA產(chǎn)物生成的增強(qiáng)線性擴(kuò)增本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增靶多核苷酸序列的方法，其中擴(kuò)增產(chǎn)物是含有有義序列 (即與靶物相同的序列)的RNA。線性擴(kuò)增與轉(zhuǎn)錄的偶聯(lián)需要按照方法I進(jìn)行靶核酸的擴(kuò)增，從而導(dǎo)致包括靶物及模板切換寡核苷酸(TSO)相關(guān)部分的獨(dú)特中間擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生。 通過(guò)模板切換寡核苷酸與置換引物延伸產(chǎn)物的雜交而形成的復(fù)合物是由RNA聚合酶進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄的底物，從而產(chǎn)生與初試靶序列相同意義的RNA產(chǎn)物。同樣，按照方法I進(jìn)行的核酸靶物的擴(kuò)增導(dǎo)致置換引物延伸產(chǎn)物的形成，當(dāng)該產(chǎn)物與啟動(dòng)子模板寡核苷酸雜交時(shí)，形成了一種復(fù)合物，而該復(fù)合物又是由RNA聚合酶進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄的底物。希望由每個(gè)引物延伸產(chǎn)物優(yōu)選地產(chǎn)生至少I、更優(yōu)選的是至少大約50、甚優(yōu)選的是至少大約75、更甚優(yōu)選的是至少大約100、最優(yōu)選的是至少大約1000個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，由此相對(duì)于不涉及轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法， 導(dǎo)致增強(qiáng)優(yōu)選的是至少I、更優(yōu)選的是至少大約50、甚優(yōu)選的是至少大約75、更甚優(yōu)選的是至少大約100、最優(yōu)選的是至少大約1000倍。以下是兩個(gè)作為例子的方法。 方法I-基于TSO的增強(qiáng)線性核酸擴(kuò)增在一實(shí)施例中，本發(fā)明的基于TSO的增強(qiáng)線性擴(kuò)增方法涉及到從引物延伸產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄，從而提供了增強(qiáng)核酸擴(kuò)增。對(duì)這種新的核酸擴(kuò)增方法(方法I)的示意性描述如圖 2A-C所示。本發(fā)明的基于TSO的核酸擴(kuò)增方法采用一個(gè)組合引物(如上所述)。用于本發(fā)明的擴(kuò)增方法的第二寡核苷酸是模板切換寡核苷酸(TSO)(也如上所述)。本發(fā)明的擴(kuò)增方法使用以下酶=DNA聚合酶、核糖核酸酶(例如RNaseH)、依賴于DNA的RNA聚合酶。待擴(kuò)增的核酸靶物是DNA或RNA。正如本領(lǐng)域所公知的，RNA靶物的擴(kuò)增需要初始cDNA的合成。本發(fā)明的基于TSO的增強(qiáng)線性擴(kuò)增方法可產(chǎn)生與靶DNA序列同源(即有義)的 RNA產(chǎn)物的多個(gè)拷貝。正如本領(lǐng)域內(nèi)所公知的，在適合于核酸雜交及擴(kuò)增的反應(yīng)介質(zhì)內(nèi)，單鏈靶核酸與組合引物、DNA聚合酶、核糖核酸酶(例如RNaseH)、依賴于DNA的RNA聚合酶以及核苷酸 (例如脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)及核糖核苷三磷酸(rNTPs))結(jié)合。合適的反應(yīng)介質(zhì)及條件如上所述。在一實(shí)施例中，在不同溫度下(通常低于其前面步驟的溫度)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。 在另一實(shí)施例中，這些方法的所有步驟都在等溫下進(jìn)行。在一實(shí)施例中，每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)包括一個(gè)同一序列的組合引物。在另一實(shí)施例中，每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)包括組合引物變異體的混合物，其中該變異體代表兩個(gè)或多個(gè)同源但不同一的序列，并且所有序列都能夠與相同的靶核酸序列雜交。該同源(序列同一)優(yōu)選的是至少大約50%，更優(yōu)選的是至少大約75%，最優(yōu)選的是至少大約90%。該實(shí)施例的優(yōu)點(diǎn)包括能夠?qū)⒏信d趣的不同序列引入到引物延伸產(chǎn)物中。在又一實(shí)施例中，每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)包括若干組合引物的混合物，其中引物代表兩個(gè)或多個(gè)低或非同源的不同一序列，并且引物優(yōu)選地與不同靶核酸序列或者沿相同的靶核酸鏈的不同位點(diǎn)進(jìn)行雜交。該實(shí)施例的優(yōu)點(diǎn)包括通過(guò)在一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中對(duì)許多靶核酸樣本進(jìn)行擴(kuò)增而對(duì)靶核酸進(jìn)行多重檢測(cè)和/或分析。在一實(shí)施例中，TSO用作終止序列并提供了一個(gè)前啟動(dòng)子序列。在另一實(shí)施例中， TSO不包括前啟動(dòng)子序列。在該實(shí)施例中，前啟動(dòng)子序列由另一寡核苷酸(例如ΡΤ0)單獨(dú)提供，該寡核苷酸包括一個(gè)前啟動(dòng)子序列并且可與引物延伸產(chǎn)物的3’部分雜交，從而可以進(jìn)行引物延伸產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄。其次，單個(gè)組合引物和TSO雜交到待擴(kuò)增核酸的相同鏈上。在靶核酸變性步驟之前將兩個(gè)寡核苷酸加入到懷疑含有核酸靶物的樣品中。這兩個(gè)寡核苷酸與靶鏈的雜交導(dǎo)致三分子復(fù)合物I (圖2A-C)的形成。DNA聚合酶實(shí)施引物的延伸。引物沿復(fù)合物1(圖2A-C)的靶核酸鏈向上延伸到 TSO雜交的位點(diǎn)。從靶鏈到TSO的5’未雜交部分的模板切換以及沿TSO模板的引物的延伸導(dǎo)致三分子復(fù)合物II的形成。最后的產(chǎn)物包括靶核酸、TSO和第一引物延伸產(chǎn)物。第一引物延伸產(chǎn)物是包括依賴于靶物的部分(即與靶核酸互補(bǔ)的序列)和依賴于TSO的部分(即與TSO的未雜交部分互補(bǔ)的序列)的單一 DNA。復(fù)合物II (圖2A-C)是用于RNA聚合酶及核糖核酸酶(RNase H)的底物。依賴于 DNA的RNA聚合酶與復(fù)合物II的功能性ds啟動(dòng)子結(jié)合并轉(zhuǎn)錄第一引物延伸產(chǎn)物，從而生成有義RNA產(chǎn)物II (圖2A-C)。專門用于RNA/DNA異源雙鏈體的RNA鏈降解的核糖核酸酶 (例如RNase H)使復(fù)合物II中的引物延伸產(chǎn)物降解，從而形成三分子復(fù)合物IV。游離組合引物與復(fù)合物IX(圖2A-C)中的靶核酸引物互補(bǔ)位點(diǎn)雜交。該雜交導(dǎo)致復(fù)合物V(圖2A-C)的形成，其中只有引物的RNA部分(通常是5’ RNA部分)與靶鏈雜交。 部分雜交引物的3’ DNA部分對(duì)引物延伸產(chǎn)物的5’最大部分的置換將導(dǎo)致作為DNA聚合酶底物的復(fù)合物VI (圖2A-C)的形成。引物沿靶鏈(VII ;圖2A-C)的延伸導(dǎo)致第一引物延伸產(chǎn)物從該復(fù)合物中置換出來(lái)。重復(fù)引物的延伸和鏈置換導(dǎo)致至少基本上與靶核酸互補(bǔ)的多核苷酸的多個(gè)拷貝的產(chǎn)生。如上所述產(chǎn)生的引物延伸產(chǎn)物被用作該實(shí)施例中轉(zhuǎn)錄的模板，其中提供了包括前啟動(dòng)子序列的TS0。被置換的引物延伸產(chǎn)物(VIII ;圖2A-C)與游離的TSO掛核苷酸雜交， 從而形成部分雙鏈體IX (圖2A-C)。復(fù)合物(雙鏈體)IX包括位于一端的一個(gè)雙鏈部分和分別從引物延伸產(chǎn)物和TSO衍生的兩個(gè)非互補(bǔ)單鏈。這個(gè)部分雙鏈體的雙鏈部分含有用于依賴于DNA的RNA聚合酶的完全功能性雙鏈啟動(dòng)子。這個(gè)最好生產(chǎn)的產(chǎn)物結(jié)合到部分雙鏈體IX的啟動(dòng)子上并轉(zhuǎn)錄引物衍生產(chǎn)物，從而形成有義RNA產(chǎn)物X(圖2A-C)的多個(gè)拷貝。利用同源或異源檢測(cè)方法可以檢測(cè)上述的擴(kuò)增產(chǎn)物，包括利用凝膠電泳的尺寸和 /或遷移性質(zhì)或者通過(guò)雜交到特異于序列的探針上來(lái)進(jìn)行鑒定。擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)指示出靶核酸的存在。定量分析也是切實(shí)可行的。例如，通過(guò)將從含有未知量的具有靶序列的多核苷酸的測(cè)試樣品擴(kuò)增的產(chǎn)物的量與具有已知量包含靶序列的多核苷酸的對(duì)照樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行比較，可以測(cè)定測(cè)試樣品中靶序列的量。這個(gè)新擴(kuò)增方法還可擴(kuò)大到分析序列變異和測(cè)序靶序列(如下所述)。方法2-基于封閉劑序列的增強(qiáng)核酸擴(kuò)增在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的基于封閉劑序列的線性擴(kuò)增方法涉及從引物衍生產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄，從而提供了增強(qiáng)核酸擴(kuò)增。這個(gè)替代性增強(qiáng)線性擴(kuò)增(方法2:不涉及模板切換步驟)如圖3A-D所示。方法2象方法I那樣采用單個(gè)的組合引物(如上所述)；一個(gè)封閉劑序列組分，該組分既可是寡核苷酸也可是寡核苷酸類似物并且如上所述還能雜交到與單個(gè)引物相同的靶核酸鏈上；以及第三寡核苷酸；啟動(dòng)子模板(PTO)，如上所述，PTO包括能夠與被置換的衍生產(chǎn)物的3’ -端雜交(并且最好是互補(bǔ)的)的3’ -部分和在其5’ -端包括一個(gè)用于依賴于DNA的RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列。正如在上述的TSO中那樣，緊鄰啟動(dòng)子序列的這個(gè)序列被設(shè)計(jì)用來(lái)由按照本發(fā)明方法的擴(kuò)增中所用的RNA聚合酶實(shí)施的優(yōu)選的最佳轉(zhuǎn)錄活性。 該封閉劑序列組分被設(shè)計(jì)用來(lái)在相對(duì)于單個(gè)引物雜交的位點(diǎn)的靶物的5’ -端上游的位點(diǎn)與靶序列雜交?；蛘呤?，如上所述，封閉劑序列雜交到與弓I物衍生產(chǎn)物的3 ’ -端互補(bǔ)的靶序列5位置的靶核酸片段上。封閉劑序列以足夠高的親和力結(jié)合，以便封閉在封閉劑與靶物雜交的位點(diǎn)上的引物延伸。正如方法I中那樣，用于按照方法2擴(kuò)增的靶核酸是單鏈DNA。當(dāng)靶核酸是dsDNA 時(shí)，該靶物首先通過(guò)變性成為單鏈。利用本領(lǐng)域內(nèi)公知的熱或任何其他公知方法例如堿處理可以完成dsDNA靶物的變性。當(dāng)靶核酸是RNA例如mRNA時(shí)，該靶物首先利用本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以便產(chǎn)生隨后要按照本發(fā)明方法進(jìn)行擴(kuò)增的cDNA。正如對(duì)方法I所描述的，單鏈核酸靶物與以下物質(zhì)結(jié)合單個(gè)組合引物、封閉劑組分、前啟動(dòng)子模板(PTO) ,DNA聚合酶、核糖核酸酶例如RNaseH、依賴于DNA的RNA聚合酶以及核苷酸例如NTPs (即dNTPs和rNTPs)。合適的反應(yīng)介質(zhì)與條件如上所述。在一實(shí)施例中，在不同溫度下(通常比以前步驟的溫度低)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。在另一實(shí)施例中，等溫實(shí)施該方法的所有步驟。在一實(shí)施例中，每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)包括一個(gè)同一序列的組合引物、在另一實(shí)施例中，每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)包括組合引物變異體的混合物，其中該變異代表兩個(gè)或多個(gè)同源但不同一的序列并且所有引物能夠與相同的靶核酸序列雜交。同源(序列同一)優(yōu)選的是至少大約50%， 更優(yōu)選的是至少大約75%，最優(yōu)選的是至少大約90%。該實(shí)施例的優(yōu)點(diǎn)包括能夠?qū)⒏信d趣的不同引物引入到引物延伸產(chǎn)物中。在又一實(shí)施例中，每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)包括若干組合引物的混合物，其中這些引物代表兩個(gè)或多個(gè)低或不同源的非同一序列并且這些引物優(yōu)選地與不同靶核酸序列或者沿相同靶核酸鏈的不同位點(diǎn)雜交。該實(shí)施例的優(yōu)點(diǎn)包括通過(guò)在一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中對(duì)多個(gè)靶核酸樣本進(jìn)行擴(kuò)增而對(duì)靶核酸進(jìn)行多重檢測(cè)和/或分析。單個(gè)組合引物和封閉劑序列組分雜交到相同的靶鏈上，從而形成三分子復(fù)合物。 該引物沿靶物向上延伸到封閉劑序列的雜交位點(diǎn)上，從而形成復(fù)合物XII (圖3A-D)。象方法I中那樣，核糖核酸酶例如RNase H裂解復(fù)合物XII的單個(gè)組合引物的RNA部分(通常是5’RNA部分)，從而形成復(fù)合物XIII (圖3A-D)。如上所述，該酶是專門用于裂解RNA/DNA 雜交體的RNA鏈的，并且不消化單鏈RNA。于是，核糖核酸酶不降解游離的組合引物。引物雜交(XIV)、由組合引物(XV)的3’ -DNA部分置換引物延伸產(chǎn)物的5’端、引物延伸和第一引物延伸產(chǎn)物(XVI)的置換這些下述步驟(如圖3A-D所示)象方法I中那樣進(jìn)行，從而產(chǎn)生被置換的延伸產(chǎn)物(XVII)的多個(gè)拷貝。不象方法I的置換產(chǎn)物，XVII與靶序列完全互補(bǔ)并且不包括與靶物不互補(bǔ)的3’端部分。重復(fù)引物延伸和鏈置換可導(dǎo)致與靶核酸互補(bǔ)的多核苷酸的多個(gè)拷貝的產(chǎn)生。
通過(guò)前啟動(dòng)子模板的3’端部分(A)與被置換的引物延伸產(chǎn)物的3’端雜交，啟動(dòng)子模板寡核苷酸(PTO)結(jié)合到被置換的延伸產(chǎn)物上，從而形成復(fù)合物XVIII (圖3A-D)。如上所述，PTO的3’端可以被封閉也可以不封閉。當(dāng)不封閉前啟動(dòng)子模板的3’端時(shí)，將沿被置換的引物延伸產(chǎn)物延伸該模板。利用核苷酸(DNA)聚合酶沿雜交前啟動(dòng)子模板的B部分 (參見圖3A-D)延伸置換產(chǎn)物的3’端，從而形成復(fù)合物XIX，該復(fù)合物在其一端包括被依賴于DNA的RNA聚合酶采用的ds啟動(dòng)子序列。復(fù)合物作為啟動(dòng)子模板的雜交產(chǎn)物如圖3A-D 所示，在該模板中為了由聚合酶進(jìn)行延伸，封閉3’端。或者是，當(dāng)啟動(dòng)子模板的3’端沒(méi)有封閉時(shí)，3’端沿被置換的引物延伸產(chǎn)物的延伸導(dǎo)致完全雙鏈復(fù)合物的形成。依賴于DNA的 RNA聚合酶將以兩種形式(RNA聚合酶的選擇必須考慮到其從ds和/或s sDNA模板轉(zhuǎn)錄的能力)即復(fù)合物的部分雙鏈體或完全雙鏈體形式轉(zhuǎn)錄復(fù)合物XIX的延伸置換引物延伸產(chǎn)物。利用該轉(zhuǎn)錄步驟可產(chǎn)生單鏈RNA產(chǎn)物的多個(gè)拷貝。利用同源或異源檢測(cè)方法可以檢測(cè)上述的擴(kuò)增產(chǎn)物，包括利用凝膠電泳的尺寸和 /或遷移性質(zhì)或者通過(guò)雜交到特異于序列的探針上來(lái)進(jìn)行鑒定。擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)指示出靶核酸的存在。定量分析也是切實(shí)可行的。例如，通過(guò)將從含有未知量的具有靶序列的多核苷酸的測(cè)試樣品擴(kuò)增的產(chǎn)物的量與具有已知量包含靶序列的多核苷酸的對(duì)照樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行比較，可以測(cè)定測(cè)試樣品中靶序列的量。這個(gè)新擴(kuò)增方法還可擴(kuò)大到分析序列變異和測(cè)序靶序列(如下所述)。利用本發(fā)明的擴(kuò)增方法及組合物的方法本發(fā)明的方法及組合物可用于各種目的。為了進(jìn)行示意性說(shuō)明，，描述了測(cè)序方法、基因分型(核酸突變檢測(cè))、利用本發(fā)明方法產(chǎn)生的擴(kuò)增核酸產(chǎn)物進(jìn)行微陣列制備。利用本發(fā)明的線性擴(kuò)增方法等溫測(cè)序確定的核酸靶物本發(fā)明的線性等溫?cái)U(kuò)增方法是有用的，例如可用于測(cè)序確定的核酸靶序列。如本文中所述的擴(kuò)增方法那樣實(shí)施測(cè)序過(guò)程。除了用于按照本發(fā)明的擴(kuò)增方法的核苷酸(例如天然脫氧核糖核苷三磷酸)以外，測(cè)序反應(yīng)混合物還包括合適的核苷三磷酸類似物，這些類似物在摻入到用于終止核苷酸聚合的引物延伸產(chǎn)物中時(shí)可以是標(biāo)記的也可以是未標(biāo)記的。這些類似物共同用于其他測(cè)序方法并且是本領(lǐng)域內(nèi)公知的，例如二脫氧核糖核苷酸。它們可以例如用熒光色團(tuán)或放射性同位素進(jìn)行標(biāo)記。這些標(biāo)記物還可以是適合于質(zhì)子分光計(jì)的標(biāo)記物。該標(biāo)記物還可以是小分子，該小分子是特異性結(jié)合對(duì)(生物素和鏈霉抗生物素蛋白)的一員并且在與特異性結(jié)合對(duì)的另一員結(jié)合之后能夠用與酶共軛的結(jié)合對(duì)的最后一員來(lái)檢測(cè)，該酶催化可以用諸如比色法、熒光法或化學(xué)發(fā)光法這些方法檢測(cè)的可檢測(cè)信號(hào)的產(chǎn)生。以上所有例子在本領(lǐng)域內(nèi)都是公知的。這些物質(zhì)可利用聚合酶并入引物延伸產(chǎn)物中并用于終止沿靶序列的延伸。標(biāo)記所得到的截短延伸產(chǎn)物。根據(jù)每個(gè)類似物的結(jié)合位點(diǎn)，所累積的多個(gè)置換引物延伸產(chǎn)物在長(zhǎng)度上不同，這表示靶序列上互補(bǔ)核苷酸的不同序列部位。利用本領(lǐng)域內(nèi)公知的任何不同方法可實(shí)施為洗脫序列信息而對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的分析。 這些方法包括凝膠電泳以及利用合適的掃描儀檢測(cè)標(biāo)記條帶、測(cè)序凝膠電泳以及利用(例如)對(duì)放射性標(biāo)記條帶直接進(jìn)行檢測(cè)、利用專用于反應(yīng)中所用的標(biāo)記物的檢測(cè)器進(jìn)行毛細(xì)管電泳以及類似方法。標(biāo)記物還可以是結(jié)合蛋白的配體，該蛋白用于檢測(cè)結(jié)合有與結(jié)合蛋白共軛的酶的標(biāo)記物，例如生物素標(biāo)記的鏈終止器以及與酶共軛的鏈霉抗生物素蛋白。利用產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的酶的酶活性可檢測(cè)標(biāo)記物。正如本領(lǐng)域內(nèi)公知的其他測(cè)序方法那樣， 既可在單個(gè)的反應(yīng)容器中也可在分開的若干反應(yīng)容器(每個(gè)代表四個(gè)核苷酸中的一個(gè))中實(shí)施四個(gè)核苷酸類型(A、C、G、T)測(cè)序反應(yīng)。所用方法的選擇取決于本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員顯而易見的實(shí)際考慮因素例如核苷酸三磷酸和/或所用的標(biāo)記物。這樣，例如，當(dāng)每個(gè)類似物標(biāo)記不同時(shí)，在一個(gè)容器中進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。選擇使按照本發(fā)明方法的測(cè)序分析性能最佳的試劑和反應(yīng)條件的考慮因素類似于以前描述的其他測(cè)序方法。試劑和反應(yīng)條件正如以上對(duì)本發(fā)明的線性核酸擴(kuò)增方法所描述的那樣。利用本發(fā)明的增強(qiáng)線性擴(kuò)增方法(方法I和2)對(duì)確定的核酸靶物進(jìn)行等溫測(cè)序以前在例如Sasaki等人的PNAS，95 =3455-3460,1998中描述了基于轉(zhuǎn)錄的測(cè)序方法。當(dāng)標(biāo)記或未標(biāo)記的rNTPs類似物在摻入RNA轉(zhuǎn)錄物中時(shí)，其用于終止反應(yīng)混合物中 rNTP的聚合，從而導(dǎo)致截短RNA產(chǎn)物的生成，這是由于在類似物結(jié)合的位點(diǎn)上封閉RNA聚合酶。適當(dāng)?shù)膔NTP在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。按照所用的方法(方法I或方法2)，在與相關(guān)復(fù)合物中的置換延伸產(chǎn)物上的互補(bǔ)核苷酸相反的方向上摻入最后的物質(zhì)。利用本領(lǐng)域內(nèi)公知的任何不同方法可實(shí)施為洗脫序列信息而對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的分析。 這些方法包括以上描述的利用本發(fā)明的(非增強(qiáng))線性擴(kuò)增方法測(cè)序確定核酸靶物的方法。利用本發(fā)明擴(kuò)增方法的基于RNA部分的等溫突變檢測(cè)用于本發(fā)明的等溫?cái)U(kuò)增方法的組合引物的獨(dú)特性質(zhì)是檢測(cè)靶核酸序列中的確定突變或多態(tài)性位點(diǎn)(例如SNPs)的等溫方法的基礎(chǔ)。該方法用于基因分型、導(dǎo)致抗藥性以及類似情況的突變的檢測(cè)。這些方法可用于定性模板鏈中一個(gè)區(qū)域的序列，該序列通常與組合引物的RNA部分雜交-然后參照“確定”的突變，這些突變一它們的位置來(lái)確定。適合于本發(fā)明方法的靶核酸序列是ss DNA。然而，可以如上所述實(shí)施由ds DNA靶物或RNA靶物制備DNA靶物并且這些制備方法是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。圖4示意性示出了本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施例。在該實(shí)施例中，組合引物的一個(gè)或多個(gè)RNA部分被設(shè)計(jì)用來(lái)與測(cè)試靶核酸序列互補(bǔ)，在該靶核酸序列中懷疑存在序列變異。 或者是，該引物包括一個(gè)或多個(gè)RNA部分，該RNA部分含有與參比序列(例如野生型序列) 互補(bǔ)的序列，測(cè)試靶核酸中的序列要與該參比序列比較。在一些實(shí)施例中，變異序列(即包括序列變異的序列)與參比序列是等位的。序列變異可以是一個(gè)核苷酸取代、缺失或插入。 圖4中的X示意性標(biāo)出了序列變異的位點(diǎn)。在另一實(shí)施例中，組合引物的一個(gè)或多個(gè)RNA部分被設(shè)計(jì)用來(lái)與測(cè)試靶核酸中懷疑存在的變異序列互補(bǔ)。或者是，該引物包括含有一個(gè)序列的RNA部分，該序列與測(cè)試靶核酸互補(bǔ)，并由此不與參比序列(例如野生型序列)互補(bǔ)，而測(cè)試靶核酸中的序列要與該參比序列比較。在一些實(shí)施例中，變異序列(即包括序列變異的序列)和參比序列是等位的。組合引物的RNA部分(通常是5’ RNA部分)包括一個(gè)與已知的正常野生型序列或者已知的突變或多態(tài)性基因型互補(bǔ)的序列。通常，合適的組合引物包括一個(gè)RNA部分，如果相比于是否具有錯(cuò)配序列(即引物具有突變序列并且靶物沒(méi)有或者)，靶核苷酸序列包括一個(gè)與引物的RNA部分互補(bǔ)的序列，則該RNA部分使引物優(yōu)選地與靶核酸雜交，其中靶核酸具有結(jié)合引物延伸產(chǎn)物并已經(jīng)具有被裂解的5’ -RNA部分。如圖4所示，序列變異的存在通常不阻礙擴(kuò)增的初始步驟。該組合引物與靶序列雜交，從而形成第一三分子復(fù)合物，并且該組合引物被延伸。然后核糖核酸酶例如RNase H裂解復(fù)合物的延伸引物的RNA部分。 雖然錯(cuò)配序列堿基對(duì)的存在可能影響RNA/DNA雜交體的裂解圖，但是該裂解無(wú)論如何都可能發(fā)生。通過(guò)5’ RNA部分的雜交而使組合引物與復(fù)合物結(jié)合的下一步驟將被抑制，優(yōu)選的是被錯(cuò)配序列阻礙。這種作用取決于諸如雜交寡核苷酸的大小以及反應(yīng)條件的這些因素。 按照本領(lǐng)域內(nèi)公知的技術(shù)和規(guī)則，在設(shè)計(jì)組合引物時(shí)要考慮這些因素。錯(cuò)配序列還可能抑制組合引物的RNA部分的裂解，由此阻礙靶序列的擴(kuò)增。另一個(gè)可能性是錯(cuò)配序列將導(dǎo)致引物的RNA部分的裂解效率低，由此導(dǎo)致擴(kuò)增效率低或者產(chǎn)生極少的擴(kuò)增產(chǎn)物。在擴(kuò)增的這個(gè)步驟中組合引物不能與靶物雜交，從而阻礙了引物延伸鏈置換及擴(kuò)增產(chǎn)物的多個(gè)拷貝的生產(chǎn)這些其他步驟。應(yīng)該理解，利用本發(fā)明方法檢測(cè)突變是基于引物延伸產(chǎn)物的缺乏或存在，或者累積引物延伸產(chǎn)物的量的定量比較。例如，當(dāng)組合引物包括參比序列(例如野生型)時(shí)，靶鏈中突變的存在可導(dǎo)致沒(méi)有可檢測(cè)的擴(kuò)增產(chǎn)物；或者是，它可導(dǎo)致可檢測(cè)產(chǎn)物的生產(chǎn)，但是少于沒(méi)有突變的模板產(chǎn)生的產(chǎn)物。當(dāng)組合引物包括RNA部分(通常是5-RNA部分)時(shí)(該部分與突變基因型完全互補(bǔ))，正?；蛐托蛄械臄U(kuò)增被抑制，而突變基因型靶物被擴(kuò)增。于是，在這種情形中，擴(kuò)增產(chǎn)物多個(gè)拷貝的檢測(cè)和/或定量測(cè)定指示出突變基因型的靶序列的存在。例如，可以進(jìn)行包括感興趣的核酸樣品或者具有野生型序列的靶核酸參比樣品的平行反應(yīng)。與后一反應(yīng)相比，前者中更多引物延伸產(chǎn)物的積累指示出感興趣樣品中突變基因型的存在。另外，當(dāng)組合弓I物包括與測(cè)試靶物的正?；蛐托蛄型耆パa(bǔ)的序列時(shí)，突變基因型的靶序列的擴(kuò)增比抑制了，并且擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)和/或定量測(cè)定指示出正?；蛐偷拇嬖凇１景l(fā)明的所有擴(kuò)增方法都適合于檢測(cè)突變(如上所述)。利用本發(fā)明擴(kuò)增方法的基于3’ -核苷酸的等溫突變檢測(cè)在該方法中，利用組合引物的3’最大核苷酸的互補(bǔ)性來(lái)鑒定突變序列的存在或缺少。組合引物的3’最大核苷酸與靶核酸的雜交是引物延伸所必需的。因此，產(chǎn)物擴(kuò)增指示出，靶核酸含有由組合引物的3’最大核苷酸確定的序列。另一方面，產(chǎn)物擴(kuò)增的減小或缺少指示出，靶核酸含有包括至少一個(gè)與組合引物的3’最大核苷酸互補(bǔ)的堿基的序列變異。 序列的缺乏是由于位點(diǎn)的突變、單個(gè)核苷酸的多態(tài)性、包含由3’最大核苷酸確定的序列的序列片段的插入或缺失。在一實(shí)施例中，基因型特異的引物(被設(shè)計(jì)具有與變異核苷酸部位(例如由于等位性)的不同序列對(duì)應(yīng)的3’最大核苷酸)被用于按照本發(fā)明方法的擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物的存在指示出，靶核酸包括由所用的特定引物的3’最大核苷酸確定的序列。擴(kuò)增產(chǎn)物的缺失或缺少(與具有由所用的特定引物的3’最大核苷酸確定的序列的參比核酸相比)指示出，靶核酸不包括由所用的特定引物的3’最大核苷酸確定的序列。利用本發(fā)明的擴(kuò)增方法基于單鏈構(gòu)象進(jìn)行突變檢測(cè)正如以下將討論的，與和靶核酸序列同一而不是和序列變異同一的參比核酸序列相比，按照本發(fā)明的方法產(chǎn)生的DNA或RNA擴(kuò)增產(chǎn)物還適合于靶核酸序列中任何變異檢測(cè)的分析。以前描述的線性核酸擴(kuò)增方法的產(chǎn)物(DNA)和增強(qiáng)線性孔增方法的產(chǎn)物(RNA)適合于基于突變檢測(cè)的單鏈構(gòu)象的多態(tài)性(SSCP或rSSCP)。只要新擴(kuò)增方法的RNA產(chǎn)物不是另一擴(kuò)增的底物，按照該新方法進(jìn)行的序列擴(kuò)增就無(wú)需還原單鏈產(chǎn)物中的第二結(jié)構(gòu)的試劑的存在。在還原第二結(jié)構(gòu)的試劑(例如DMS0)的存在下，可進(jìn)行由別人描述的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法，這樣，可以預(yù)料，本發(fā)明的增強(qiáng)線性擴(kuò)增方法與用于檢測(cè)單鏈構(gòu)象多態(tài)性的適當(dāng)方式(例如為了闡明特定序列性質(zhì)的存在或者測(cè)試核酸與參比核酸相比的任何差別的存在， 用于鑒定單鏈RNA產(chǎn)物的特定遷移圖的電泳分離方法)有直接的聯(lián)系?；谀z電泳或毛細(xì)管電泳的方法可以用于不同單鏈構(gòu)象異構(gòu)體的檢測(cè)和分析。 另外，利用識(shí)別依賴于序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸酶也可用于序列特異的構(gòu)象多態(tài)性的測(cè)定。 這些核酸酶在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的，例如裂解酶測(cè)定(Third Wave)。電泳方法潛在地更適合于高流通量的突變或者基因分型的檢測(cè)方法。對(duì)給定核酸序列的序列特異的電泳圖形的測(cè)定可用于檢測(cè)測(cè)試序列的特異性等位基因。而且，希望不同等位基因的電泳遷移圖也有差別，由此可進(jìn)行單個(gè)基因組DNA樣品的兩個(gè)等為基因的檢測(cè)(正如異源基因型或多個(gè)等位基因所需)。測(cè)試核酸序列中的任何變異(例如堿基取代、插入或缺失)可利用該方法檢測(cè)。希望該方法用于檢測(cè)特定單個(gè)堿基的多態(tài)性、SNP以及發(fā)現(xiàn)新的SNPs。制備核酸微陣列的方法以前描述的線性核酸擴(kuò)增方法的產(chǎn)物(DNA)和增強(qiáng)線性擴(kuò)增方法的產(chǎn)物(RNA)的單鏈性質(zhì)特別適合于制備包含擴(kuò)增產(chǎn)物的微陣列。用于將核酸固定到固相底物(例如玻片)上的幾種技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。一種方法是將含有能夠固定到固相底物上的組成成分的修飾堿基或類似物(例如氨基、氨基或其它帶正電荷的基團(tuán)的衍生物)摻入到擴(kuò)增產(chǎn)物中。然后時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物與固相底物(例如玻片)接觸，該底物包覆有醛基或另一將與擴(kuò)增產(chǎn)物上共價(jià)固定到玻片上的反應(yīng)基團(tuán)形成共價(jià)鍵的反應(yīng)基團(tuán)。其它方法(例如利用氨丙基硅烷表面性質(zhì)的方法)在本領(lǐng)域內(nèi)也是公知的，If 如在 http:// www. cmt. corning, com andhttp://cmgm. standord. ecu/pbrownl.中所描述的。還可以利用本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法將基團(tuán)固定到隨后能夠轉(zhuǎn)變成反應(yīng)基團(tuán)的引物上。固定到組合引物的核苷酸上的任何基團(tuán)都將是線性擴(kuò)增方法的單鏈DNA產(chǎn)物的一部分，該產(chǎn)物隨后又被固定到微陣列的固相表面上。正如所用技術(shù)需要和/或運(yùn)行的，在固定到固相底物上之前或之后，通過(guò)對(duì)片段的裂解或可檢測(cè)標(biāo)記物的固定還可以修飾本發(fā)明方法的擴(kuò)增產(chǎn)物。核酸的定性利用本發(fā)明方法得到的擴(kuò)增產(chǎn)物特別適宜進(jìn)一步的定性，這部分由于這些產(chǎn)物是單鏈的。利用本領(lǐng)域內(nèi)公知的探針雜交技術(shù)(例如Southern and Northern印跡法)可分析這些擴(kuò)增產(chǎn)物(既可是DNA也可是RNA)。通過(guò)將擴(kuò)增產(chǎn)物與包括寡核苷酸探針的微陣列接觸也可以分析這些擴(kuò)增產(chǎn)物。探針的身份提供了擴(kuò)增產(chǎn)物序列身份的特性，并由此可外推出懷疑含有所述模板核酸的樣品中存在的模板核酸的身份。本發(fā)明的組合物及藥盒本發(fā)明還提供了用于本文所述方法的組合物及藥盒。這些組合物可以是本文所述的任何一種或多種組分、反應(yīng)混合物和/或中間體。例如，本發(fā)明提供了一種包括一組合引物的組合物，其中該組合引物包括RNA部分和3’DNA部分。在另一例子中，本發(fā)明提供了一種包括一組合引物的組合物，其中該組合引物包括5’ -RNA部分和3’ -DNA部分。在一實(shí)施例中，RNA部分鄰近DNA部分。在另一例子中，，本發(fā)明提供了一種包括一組合引物的組合物，其中該組合引物包括具有至少一個(gè)間插RNA部分的5’ -和3’ -DNA部分。在另一例子中，本發(fā)明提供了一種包括一組合引物的組合物，其中通過(guò)能夠?qū)M合引物的多核苷酸固定到可用于制備核酸微陣列的固相底物上的組成成分的固定而衍生出該組合引物。在一些實(shí)施例中，通過(guò)帶正電荷的組成成分(例如胺)的固定也可衍生出組合引物。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種包括TS0(即本文所述的TSO實(shí)施例的任一種，包括含有一個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)對(duì)模板的結(jié)合的修飾的TSOs)的組合物。在一些實(shí)施例中，這些組合物包括一組合引物和一終止序列。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種包括含有前啟動(dòng)子序列(例如TSO或PTO (即本文所述的那些實(shí)施例的任一種))的多核苷酸以及組合引物和/或封閉劑序列的組合物。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種包括一封閉劑序列(即本文所述的任何實(shí)施例，包括具有修飾的封閉劑序列)的組合物。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供了包括以下組分的組合物(a) —組合引物，其中該組合弓I物包括RNA部分和3 ’ DNA部分(在一些實(shí)施例中，RNA部分鄰近DNA部分)；以及(b) 終止序列。在一些實(shí)施例中，終止序列是TS0。在其它實(shí)施例中，終止序列是封閉序列。在一些實(shí)施例中，組合引物包括5 ’ -DNA部分和3 ’ -DNA部分(在某些實(shí)施例中，RNA部分鄰近 DNA部分)。在其它實(shí)施例中，組合引物包括具有至少一個(gè)間差RNA部分的5’ -及3’ -DNA 部分。在一些實(shí)施例中，組合物包括(a)組合引物；(b)包含終止序列的多核苷酸；(c)包含前啟動(dòng)子序列的多核苷酸。在一些實(shí)施例中，該前啟動(dòng)子序列由PTO提供。在其它實(shí)施例中，該前啟動(dòng)子序列由TSO提供。上述組合物的任一種還包括模板(含有靶序列)和/ 或本文所述的任一種酶(例如DNA聚合酶、RNaseH和/或RNA聚合酶)。這些組合物通常是水溶液形式，最好在適當(dāng)?shù)木彌_液中。本發(fā)明還提供了包括本文所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的組合物。因此，本發(fā)明提供了作為靶序列的若干拷貝并由本文所述的任一方法產(chǎn)生的一群DNA(反義)或RNA(有義)分子。這些組合物雖然可以是凍干形式的，但是它們一般在合適的介質(zhì)中。合適的介質(zhì)包括(但不限于)含水介質(zhì)(例如純水或緩沖液)。本發(fā)明提供了用于實(shí)施本發(fā)明方法的藥盒。因此，各種藥盒在合適的包裝內(nèi)。這些藥盒可用于本文所述的任何一種或多種用途中，并因此而包含用于以下一種或多種用途的說(shuō)明書擴(kuò)增核苷酸序列；測(cè)序被擴(kuò)增的多核苷酸；以及檢測(cè)擴(kuò)增多核苷酸中的序列變異。本發(fā)明的藥盒包括一個(gè)或多個(gè)含有本文所述組分的任何組合的器皿，并且以下是這些藥盒的例子。一種藥盒包括本文所述組合引物的任一種。在一些實(shí)施例中，一種藥盒包括兩種或多種可以也可以不分別包裝的組合引物。在其它實(shí)施例中，一種藥盒包括組合引物和終止序列(本文所述的任一種)。一種藥盒可包括組合引物、含有終止序列的多核苷酸以及含有前啟動(dòng)子序列(可以是PTO或TS0)的多核苷酸。組合引物可以是標(biāo)記或未標(biāo)記的。藥盒還可任意包括本文所述的任何一種或多種酶。藥盒還可包括一種或多種適當(dāng)?shù)木彌_劑(如本文所述)。用于核酸測(cè)序的藥盒可任意包括在摻入到引物延伸產(chǎn)物中時(shí)起終止核酸聚合作用的標(biāo)記或未標(biāo)記核苷酸類似物。藥盒中的一種或多種試劑可以是包括賦興劑的干粉(通常是凍干)形式，干粉在溶解之后變成用于實(shí)施本文所述任一種方法的具有適當(dāng)濃度的試劑溶液。每一組分都可包裝在分開的器皿內(nèi)或者幾個(gè)組分組合在一個(gè)允許交叉反應(yīng)和貯存期限的器皿中。
雖然含有說(shuō)明的電子貯存介質(zhì)(例如磁盤或光盤)也是可以接受的，但是本發(fā)明的藥盒可任意包括一套說(shuō)明書(通常是書面說(shuō)明)，這些說(shuō)明書涉及到本發(fā)明方法的組分在以下用途中的使用說(shuō)明即用于預(yù)計(jì)核酸的擴(kuò)增；和/或合適時(shí)利用擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行諸如核酸測(cè)序及序列突變的檢測(cè)。藥盒所包括的說(shuō)明書通常包括實(shí)施本發(fā)明方法所必需的試劑的信息、如何使用藥盒和/或適當(dāng)反應(yīng)條件的說(shuō)明。藥盒內(nèi)的一種或多種組分可以裝在任何便利適當(dāng)?shù)陌b內(nèi)。這些組分可以分開包裝，也可以一個(gè)或多個(gè)組合的形式包裝。當(dāng)配備用于實(shí)施本發(fā)明的增強(qiáng)線性擴(kuò)增方法的藥盒時(shí)，RNA聚合酶(如果包括的話)最好與轉(zhuǎn)錄步驟之前的步驟中所用的組分分開配備。藥盒內(nèi)不同組分的相對(duì)量可以非常不一樣，從而提供了使為實(shí)施本文所述方法而必需發(fā)生的反應(yīng)實(shí)質(zhì)上優(yōu)化和/或使任何測(cè)定的靈敏度最佳的試劑濃度。本發(fā)明還提供了作用于本文所述方法的系統(tǒng)。這些系統(tǒng)包括以上所討論的那些組分的不同組合體。例如，在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種適合于產(chǎn)生靶多核苷酸序列 (或擴(kuò)增靶多核苷酸序列)的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括(a)組合引物(本文所述的任一種)；(b) DNA聚合酶；以及(C)核糖核酸酶。在一些實(shí)施例中，該系統(tǒng)還包括含有終止序列(本文所述的任一種)的多核苷酸。在一些實(shí)施例中，該系統(tǒng)還包括含有前啟動(dòng)子序列(可以是PTO 或TS0)的多核苷酸以及依賴于DNA的RNA聚合酶。系統(tǒng)實(shí)施例的任何一個(gè)還可包括模板 (靶)序列(如上所述)。本發(fā)明還提供了含有本文所述組分的不同組合體的反應(yīng)混合物(或者是包括反應(yīng)混合物的組合物)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了包括以下組分的反應(yīng)混合物(a)多核苷酸模板；(b)含有3’DNA部分和RNA部分的組合引物；以及(c)DNA聚合酶。正如本文所述，任一種組合引物都可在反應(yīng)混合物(或者許多組合引物)中，包括一種含有鄰近3’DNA 部分的5’ RNA部分的組合弓I物。該反應(yīng)混合物還可包括一種從RNA/DNA雜交體裂解RNA的酶(例如RNase H)。本發(fā)明的反應(yīng)混合物還可包括含有本文所述終止序列的任一種多核苷酸。反應(yīng)混合物的另一個(gè)例子是(a)置換引物延伸產(chǎn)物(并且由此在其5’端含有與組合引物的3’ DNA部分互補(bǔ)的序列，但不含有與組合引物的RNA部分互補(bǔ)的序列)；(b)含有前啟動(dòng)子序列(例如ΡΤ0)的多核苷酸；以及(c)RNA聚合酶。其它反應(yīng)混合物在本文中也有所描述并包括在本發(fā)明中。本發(fā)明還包括含有本文所述的任一種復(fù)合物(是本文所述方法的中間體)的組合物。圖1-4示意性地繪出了這些復(fù)合物。作為一個(gè)例子，本發(fā)明的一種復(fù)合物是包括以下組分的復(fù)合物(a)模板鏈；以及(b)組合引物，所述組合引物包括3’DNA部分和RNA部分。 該組合引物具有是5’ -端并鄰近3’ DNA部分的RNA部分。該復(fù)合物還包括含有終止序列 (例如TSO或封閉劑序列)的多核苷酸。該復(fù)合物還可包括含有前啟動(dòng)子(例如ΡΤ0)的多核苷酸。以下提供的例子是為了說(shuō)明(但不是限制)本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例I : 一般方法該例中所描述的一般方法可用于本文所提供的其它例子中。緩沖劑
用以下材料制備這些例子中所用的緩沖劑TE 緩沖劑10mM Tris 鹽酸，ρΗ8· O, ImM EDTATBE 緩沖劑89mM Tris 堿，89mM 硼酸，2mM EDTA, pH8. 3FX 緩沖劑20mM Tris-SO4, ρΗ9· O, 20mM (NH4) SO4,0. I % NP-40采用單嵌合引物、DNA聚合酶及RNase H的等溫線性擴(kuò)增在含有以下組分的15μ I反應(yīng)體系中進(jìn)行序列擴(kuò)增20mMTris鹽酸，pH8. 5， 6. OmMMgCl2,1. OmM dATP,I. OmM dCTP,I. OmM dTTP,0. 8mM dGTP,0. 2mM dITP(dNTP’ sfrom Amersham), 0-6 % DMSO, 0-8 % 甘油，0-100yg/ml 乙酸化 BSA (Ambion, Austin, TX), 0.6 單位/ μ I重組核糖核酸酶抑制劑(rRNasin, Promega, Madison, WI),0. 5-5 μ M組合引物ΙΑ005,以及100-200ηΜ啟動(dòng)子-模板寡核苷酸(PTO) IA015C。組合引物ΙΑ005是具有 ACGGAUGCG⑶CUCCAGTGT (SEQ ID NO: I)序列的20鏈節(jié)引物。啟動(dòng)子-模板寡核苷酸(PTO) IA015C是具有g(shù)gAATTCTAATACgACTCACTATAgggAgAgCggTACgCTgATCAAAgATCCgTg-生物素(SEQID NO 12)序列的55鏈節(jié)寡核苷酸。反應(yīng)體系具有除兩種酶之外的所有組分。于程序化熱循環(huán)器(GeneAmp 9600， Perkin Elmer)中在70°C或90°C下加熱10秒鐘之后，將反應(yīng)混合物冷卻到55°C、60°C或 65°C之下(正如各個(gè)例子中所述的)。達(dá)到該低溫之后，加入0. 05-0. 24單位的RNase H(利用以下稀釋劑/貯存液對(duì)5U/ul的原液進(jìn)行稀釋=IOmMTris鹽酸，？!18.5，30(%甘油；雜交熱穩(wěn) RNase H, Epicentre Technologies, Madison, WI)和 I. 0-5. O 單位的 Bca DNA 聚合酶 (2U/ul ；Panvera, Madison, WI)。反應(yīng)在55°C _65°C下保溫30分鐘。保溫結(jié)束后，將反應(yīng)體系冷卻到4°C。反應(yīng)體系可維持在4°C，直到需要RNA的轉(zhuǎn)錄步驟為止。由線性擴(kuò)增ssDNA產(chǎn)物的RNA轉(zhuǎn)錄而進(jìn)行的增強(qiáng)線性擴(kuò)增在含有以下組分的IOul反應(yīng)體系中于37°C進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄3小時(shí)2. 5ul的上述線性擴(kuò)增反應(yīng)混合物，以及 40mM Tri s 鹽酸，ρΗ8· 5，70mM KCl，5. OmMDTT，12mM MgCl2, llOug/ml BSA, 3mM 每 rNTP(ATP，UTP, CTP, GTP, Amersham), 7. 5 % DMSO，I 單位 /ul rRNasin (Promega, Madison, WI)以及 20 單位 T7RNA 聚合酶(Ambion, Austin, TX)。DNA 模板選擇E. coli K12的J區(qū)域的序列作為以下幾個(gè)例子的DNA模板。三個(gè)DNA模板被用于這些實(shí)驗(yàn)中合成DNA靶物(IA013)、由PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的初級(jí)單鏈DNA (351個(gè)堿基) 模板以及來(lái)自E. coli (例4中所述的制備)的K12菌株的基因組DNA。合成DNA靶IA013 包括間隔物18-間隔物(SEQ ID NO 18)。間隔物18指的是聚氧乙烯間隔物。這些序列被加入到寡核苷酸中，以便相對(duì)于100-bp ssDNA產(chǎn)物阻止其流動(dòng)。由PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的上述初級(jí)單鏈DNA (351個(gè)堿基)模板序列是CGGTACGCTGATCAAAGATCCGTGCAACAAATGTCATGGTCATGGTCGTGTTGAGCGCAGCAAAACGCTGTCCGTTAAAATCCCGGCAGGGGTGGACACTGGAGACCGCATCCGTCTTGCGGGCGAAGGTGAAGCGGGCGAGCATGGCGCACCGGCAGGCGATCTGTACGTTCAGGTTCAGGTTTAAACAGCACCCGATTTTCGAGCGTGAAGGCAACAACCTGTATTGCGAAGTCCCGATCAACTTCGCTATGGC
GGCGCTGGGTGGCGAAATCGAAGTACCGACCCTTGATGGTCGCGTCAAACTGAAAGTGCCTGGCGAAACCCAGACCGGTAAGCTATTCCGTATGCG (SEQ ID NO : 17)。其中PCR引物是黑體的并具有下滑線，而組合引物是黑體的，RNA部分是斜體的。由PCR擴(kuò)增產(chǎn)物制備ssDNA靶物利用引物IA006和IA004由E. coli J基因的351_bp片段的PCR擴(kuò)增制備用于等溫線性擴(kuò)增的單鏈 DNA 模板。引物 IA006 是具有 CGGTACGCTGATCAAAgATCCGT (SEQ ID NO: 16) 序列的 23 鏈節(jié)。引物 IA004 是具有 CGCATACGGAATAGCTTACCGGTCT(SEQ ID NO :15)序列的 26鏈節(jié)。在含有以下組分的IOOul反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR 20mM Tris-SO4, pH9. 0， 20mM (NH4)2SO4,0. 1% NP-40, 2. OmM MgCl2, 300uM 每 dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)，5 單位 Taq DNA 聚合酶，400nM 引物 IA006，400nM5’-磷酸-引物 IA004，以及(λ 2ul E. coli K12 菌株的粗裂解物。在以下參數(shù)采納修飾“接地PCR”方案95°C 5秒鐘、68°C I分鐘5次循環(huán)； 940C 5秒鐘、60°C 30秒鐘、72°C I分鐘5次循環(huán)；94°C 5秒鐘、55°C 30秒鐘、72°C I分鐘40 次循環(huán)；72°C 15分鐘，然后無(wú)限期地保持在4°C下。用5-磷酸合成引物IA004，以便用α 外切核酸酶(Strandase kit, Novagen, Madison, WI)保護(hù)有義鏈免受消化。按照制造商的指令進(jìn)行Strandase的消化。簡(jiǎn)言之，通過(guò)加入1/10體積的3M醋酸鈉，pH5. 2以及O. 6體積的異丙醇，然后在_20°C下冷卻I小時(shí)并在微離心機(jī)中以最大速度離心30分鐘而將如上所述制備的PCR產(chǎn)物從反應(yīng)混合物中沉淀出來(lái)。DNA沉淀在重新懸浮到80ul水中之前馬上用75%的乙醇洗滌，然后迅速進(jìn)行空氣干燥。在260nm下由O.D.評(píng)估濃度，并加入60單位的α外切核酸酶(Strandase, Novagen)。使消化在37°C下進(jìn)行20分鐘,然后使反應(yīng)體系被加熱到75°C 10分鐘,并冷卻到4°C。在程序化熱循環(huán)器(GeneAmp 9600, Perkin Elmer) 中進(jìn)行保溫。在制造商發(fā)出指令之后利用QiaQuick核苷酸分離柱(Qiagen, Valencia, CA) 以及藥盒(Qiagen, Valencia, CA)所配備的緩沖劑純化剩余的DNA。簡(jiǎn)言之,將10體積的緩沖劑PN(Qiagen)加入到樣品中。然后將整個(gè)體積施加到Qiagen旋轉(zhuǎn)柱上并離心(在微離心機(jī)上6000rmpl分鐘)。棄去濾液，并用500ul緩沖劑PE(Qiagen)將柱洗滌兩次。然后通過(guò)以最大速度離心3分鐘而徹底干燥柱。用50ul緩沖劑EB(IOmM Tris鹽酸，pH8. 5) (Qiagen)洗脫DNA。在260nm下由OD評(píng)估該濃度，大約為2· 5X1012拷貝/5ul。凝膠分析揭示，剩余了顯著量的dsDNA(小于總量的一半)，但是濃度誤差小于2倍。DNA在TE緩沖劑中被稀釋到IOltl拷貝/5ul。正如所需要的，由101°拷貝原液制備連續(xù)的稀釋液。通過(guò)限定稀釋PCR分析確定基于O. D.測(cè)定的濃度。凝膠電泳在Novex 電泳裝置(EI9001_Xcell II Mini Cell，Novex)中，在 IX TBE 緩沖劑 (89mM Tris堿，89mM硼酸，2mMEDTA，pH8. 3)中Novex預(yù)澆鑄的4-20%聚乙酰胺梯度凝膠 (Invitrogen, Carl sbad, CA ；partno. EC62255)上電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物。來(lái)自線性擴(kuò)增或轉(zhuǎn)錄(增強(qiáng)線性擴(kuò)增)的反應(yīng)混合物(5ul)與6X凝膠填充液(40%蔗糖，0.25%溴酚藍(lán)， 0. 25%二甲苯苯胺)混合，并且將全部樣品立刻填充到每個(gè)井中。使凝膠在250V下大約5 分鐘，直到所有樣品進(jìn)入凝膠并將電壓降低到175V45分鐘為止。從塑料盤之間除去凝膠并用 IX TBE 緩沖劑(89mMTris 堿，89mM 硼酸，2mMEDTA，pH8. 3)中的 0. 5ug/ml 溴化 3，8- 二氨基-5-乙基-6-苯基啡啶嗡對(duì)凝膠進(jìn)行染色。在每個(gè)凝膠運(yùn)行的一個(gè)通道內(nèi)包括dsDNA分子大小標(biāo)記器(Hi-Lo DNA標(biāo)記器，Bionexus, San Leandro, CA)。該標(biāo)記器含有以下尺寸中的 16 個(gè)片段50、100、200、300、400、500、750、1000、1400、1550、20000。30000、40000、 60000,80000以及l(fā)OOOOObp。典型的是，所用的凝膠上包括50_2000bp。雜交用于雜交例(用于ssDNA產(chǎn)物的IA010 ;用于ssRNA產(chǎn)物的IA014)的寡核苷酸探針是采用T4多核苷酸激酶(New England Biolabs, Beverly, MA)以及Y-32P-ATP(腺苷 5’ -[ Y -32P]三憐酸、三乙氨鹽，Amersham, Piscataway, NJ ；PB10218, > SOOOCi/mmo I, 10mCi/ml)標(biāo)記的 5’-端。引物 IA010 是具有 ATGTCATGGTCATGGTCGTGT(SEQ ID NO :13)序列的 21 鏈節(jié)。引物 IA014 是具有 CTCAACACGACCATGACCATGACATTTGTTG(SEQ ID NO :14)序列的 31鏈節(jié)。標(biāo)記反應(yīng)體系(50ul總體積)含有70mM Tris鹽酸，ρΗ7· 6，IOmM MgCl, 5mM DTT, lug 寡核苷酸(用于引物 IA010 是 147pmol，用于引物 IA014 是 IOlpmol)、250uCi y -32P-ATP 以及30單位T4多核苷酸激酶。在37°C下保溫30分鐘，然后用QIA快速核苷酸分離藥盒 (Qiagen, Valencia, CA)除去未結(jié)合的核苷酸。通過(guò)對(duì)Iul的標(biāo)記寡核苷酸進(jìn)行計(jì)數(shù)而在液體閃爍計(jì)數(shù)器上測(cè)定延遲速率(cpm)。在30ul反應(yīng)體系中進(jìn)行雜交。將產(chǎn)物DNA(或RNA) (IOul)加入到20ul的探針混合物中。反應(yīng)體系含有IOOmM NaCl和IO6Cpm探針(利用14. 3天的半衰期校正延遲)。加熱到65°C 15秒之后，使雜交在42°C下進(jìn)行30分鐘，然后冷卻到4°C。在具有熱蓋的程序化熱循環(huán)器(GeneAmp 9600,Perkin Elmer)中實(shí)施這些步驟。在IX TBE緩沖劑(89mM Tris 堿，89mM硼酸，2mMEDTA，pH8. 3)的10%聚乙酰胺凝膠中于150V下使整個(gè)體積的雜交反應(yīng)體系電泳3小時(shí)。從玻璃板上去除凝膠，用塑料包裹并用兩個(gè)鑒定屏幕在-20°C下暴露到放射自顯影膠片(BioMax MR, Kodak)中過(guò)夜(大約16小時(shí))。實(shí)施例2-等溫線性擴(kuò)增利用單個(gè)組合引物、DNA聚合酶、RNase H以及TSO或封閉劑實(shí)施等溫線性擴(kuò)增。將合成s sDNA靶物(IA010-例I中所列出的序列)的10拷貝添加到含有所有反應(yīng)組分(如上所述)的反應(yīng)混合物以及沒(méi)有一種關(guān)鍵試劑[例如組合引物、RNase H或Bca DNA聚合酶(Panvera，Madison，WI)]的反應(yīng)混合物中。也包括含有所有試劑但沒(méi)有靶ssDNA的陰性對(duì)照反應(yīng)體系。如上所述實(shí)施靶DNA序列的等溫線性擴(kuò)增。在70°C下進(jìn)行靶物的變性并在 65 °C下進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增。用凝膠電泳(圖5)(第一通道分子量梯度；通道#1-4 :分別無(wú)DNA、無(wú)引物、無(wú) RNase H、無(wú)Bca DNA聚合酶；通道5 :含有所有組分)解析擴(kuò)增產(chǎn)物。在沒(méi)有引物、RNase H 或Bca DNA聚合酶的反應(yīng)混合物中沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物可檢測(cè)。如圖6 (通道1-4 :分別無(wú)DNA、無(wú)引物、無(wú)RNase H、無(wú)Bca DNA聚合酶；通道5:含有所有組分)所示，探針I(yè)A010的雜交以及對(duì)線性擴(kuò)增方法的ssDNA產(chǎn)物的放射自顯影，驗(yàn)證了擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定。該實(shí)驗(yàn)中的合成寡核苷酸靶物的線性擴(kuò)增利用未封閉的啟動(dòng)子-模板寡核苷酸(IA015b)實(shí)施。啟動(dòng)子-模板寡核苷酸IA015b是具有GGAATTCTAATACGACTCA CTATAGGGAGAGCGGTACGCTGATCAAAGATCCGTGSEQ ID NO :11)序列的 55 鏈節(jié)。以上給出了用于該擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)組分。在70°C下進(jìn)行初始變性步驟10秒鐘。將反應(yīng)體系冷卻到65°C以下，在加入RNase H和Bca DNA聚合酶之后再于該溫度下保溫30分鐘。在對(duì)照反應(yīng)(無(wú)DNA、無(wú)引物、無(wú)RNase H、無(wú)Bca)中沒(méi)有雜交可檢測(cè)。
實(shí)施例3-偶聯(lián)有啟動(dòng)子-模板寡核苷酸的等溫線性擴(kuò)增及轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子-模板寡核苷酸(PTO)含有兩個(gè)基本序列基元T7啟動(dòng)子序列(5’-TAATACGACTCACTATAGGGAgGAG(S EQ ID NO 20))以及與ssDNA模板互補(bǔ)的序列。設(shè)計(jì)了 PTO的四種變形(IA012、IA012B、 IA015、IA015b)。IA012PT0是67鏈節(jié)并具有以下序列GGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGATCGAGTAGCTCCGGTACGCTGATCAAAGATCCGTG (SEQ ID NO 8) ο IA012PT0除了核T7啟動(dòng)子以外，還含有兩個(gè)序列:5’_延伸(5，_GGAATTC (SEQ ID NO 21))以及在啟動(dòng)子與靶DNA互補(bǔ)序列之間的間隔物(5’_ATCGAGTAGCTC(SEQID NO :22))。IA015是較短的PT0(48鏈節(jié))，缺少5’ -延伸和間隔物。ΙΑ015ΡΤ0具有以下序列TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGTACGCTGATCAAAGATCCGTG (SEQ ID NO: 10)。 IAO12 PTO是含有間隔物但無(wú)延伸的60鏈節(jié)。IA012b PTO具有以下序列TAATACGACTCACTATAGGGAGAGATCGAGTAGCTCCGGTACGCTGATCAAAGATCCGTG(SEQ ID NO 9)。IA015b含有延伸但無(wú)間隔物。例2中公開了 IA015b序列。除了嵌合寡核苷酸IA005、 IA019和 IA020 以外的所有引物都是由 Keystone (Division of BioSource International, Camarillo，CA)合成的并是PAGE純化的。圖2A-C示出了該擴(kuò)增方法的一般示意圖。通過(guò)比較合成寡核苷酸產(chǎn)物(IA009)與每個(gè)ΡΤ0’ s之間形成的重疊-延伸產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄之后產(chǎn)生的RNA的量，估算IA012、IA012b、IA015、IAO15b ssDNA模板轉(zhuǎn)換成T7RNA聚合酶底物的能力。合成寡核苷酸產(chǎn)物IA009是具有以下序列的100鏈節(jié)(SEQ ID NO :19)。在15ul含有以下組分的反應(yīng)體系中進(jìn)行重疊-延伸20mM Tris 鹽酸，pH8. 5,6mM MgCl，ImM 每個(gè) dNTP 聚合酶(dATP, dTTP, dCTP, dGTP)。反應(yīng)體系不包含 Bca DNA聚合酶，并被加熱到95°C，然后冷卻10分鐘以上達(dá)到60°C。加入DNA聚合酶之后， 在60°C下使反應(yīng)保溫30分鐘。將反應(yīng)混合物的一部分(2. 5ul)加入到標(biāo)準(zhǔn)RNA轉(zhuǎn)錄混合物中并利用凝膠電泳評(píng)估轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。如圖7 (通道I :分子量梯度；通道2-5 :分別來(lái)自IA012、IA012b、IA015、IA015b的重疊延伸產(chǎn)物；通道 6-13 :分別來(lái)自 IA012、IAO12b, IA015、IAO15b, IA012、IAO12b, IA015、 IAO15b的RNA)所示，用由較短ΡΤ0，s (IA015, IA015b)而不是用IAO12或IAO12b產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄底物制備明顯多的RNA。含有5’-延伸但無(wú)間隔物(IA015b)的PTO確實(shí)產(chǎn)生較高產(chǎn)率的 RNA0然而，在所有情形中，除了主要的RNA條帶以外還出現(xiàn)了多種產(chǎn)物。第五個(gè)PTO具有與 IA015b相同的序列，但3’ -封閉基團(tuán)(生物素)取消了游離的3’ -0H，從而證實(shí)3’ -封閉的PTO的性能改進(jìn)了。封閉PTO的3’-0H，從而消除了它啟動(dòng)功能性啟動(dòng)子序列與擴(kuò)增產(chǎn)物的非特異性結(jié)合(導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的非特異產(chǎn)生)的能力。在增強(qiáng)等溫線性擴(kuò)增中的3’-封閉和未封閉PTO的性能可通過(guò)利用標(biāo)準(zhǔn)條件擴(kuò)增合成寡核苷酸靶物來(lái)估算。如圖8(通道 I :分子量梯度；通道2、9 :無(wú)DNA，30分鐘；通道3、10 :無(wú)DNA，I小時(shí)；通道4、11 :無(wú)DNA，2 小時(shí);通道5、12 10拷貝IA013,30分鐘;通道6、13 10拷貝IA013,1小時(shí)；通道7、14 10 拷貝IA013，2小時(shí);通道8、15 :10拷貝IA013,30分鐘；反應(yīng)1-7沒(méi)有封閉(IA015b)，反應(yīng)
8-15被封閉(IA015c))所示，3’-封閉PT0(IA015c)產(chǎn)生了比較大的特異性RNA(IA015)產(chǎn)率，但背景明顯少。利用包括在鏈置換反應(yīng)體系中的IA015b或IA015c，通過(guò)鏈置換30分鐘、I小時(shí)，或者在55°C下2小時(shí)而擴(kuò)增陰性對(duì)照反應(yīng)體系(無(wú)DNA模板)和含有寡核苷酸靶物(IA013)的10拷貝的反應(yīng)體系。當(dāng)不封閉3’-0H時(shí)，在所有反應(yīng)體系中產(chǎn)生非特異的RNA,并且模糊了特異性RNA條帶的鑒定。相反，封閉的PTO主要產(chǎn)生單個(gè)的RNA產(chǎn)物。實(shí)施例4-利用等溫增強(qiáng)線性擴(kuò)增對(duì)E. Coli基因組DNA的J基因序列進(jìn)行擴(kuò)增將DNA 從在 Tryptone-NaCl 介質(zhì)中生長(zhǎng)過(guò)夜的 25ml E. ColiK12(ATCC 10798) 中分離出來(lái)。通過(guò)溶菌酶消化并且在制造商發(fā)出指令之后溶解在離液序列高的裂解液 (Bactozol Kit, Molecular Research Center, Cincinnati, OH)中而分離基因組 DNA。簡(jiǎn)言之，通過(guò)以6000xg離心5分鐘來(lái)收集細(xì)菌。細(xì)胞片被重新懸浮到Bactozyme消化緩沖劑中并在50°C下保溫30分鐘。所生成的裂解物在消化結(jié)束時(shí)是清楚的，而沒(méi)有任何未消化細(xì)胞的可見柱。裂解物與 4 體積的 DNazol 試劑(Molecular Research Center, Cincinnati, OH)混合并在室溫下保溫15分鐘。通過(guò)加入O. 6體積的冰凍乙醇而將DNA從溶液中沉淀出來(lái)。在室溫下保溫5分鐘之后，通過(guò)在微離心機(jī)中以最大速度離心5分鐘而收集沉淀的 DNA0用75%乙醇洗滌DNA片，再進(jìn)行離心并利用頻率振蕩通過(guò)在50_55°C下加熱10分鐘而重新懸浮到1.5ml TE緩沖劑(IOmMTris鹽酸，pH8.0，ImM EDTA)中。所得到的溶液重復(fù)地通過(guò)22 gauge的注射器針頭，以便剪切DNA并減小溶液的黏度。通過(guò)加入1/10體積的5M 醋酸銨及3體積的冰凍乙醇而又沉淀出DNA(EPI005-35)。DNA在_20°C下保溫I小時(shí)之后， 通過(guò)在微離心機(jī)中以最大速度進(jìn)行離心而收集DNA。DNA片用75%乙醇進(jìn)行洗滌，再進(jìn)行離心，并重新懸浮到 150ulTE 緩沖劑中。為 O. D.測(cè)定(Beckman DU640 spectrophotometer) 制備TE緩沖劑中的兩個(gè)稀釋液，通過(guò)估算50ul/ml dsDNA產(chǎn)生260nm處的10. D.而計(jì)算其中的DNA濃度。兩個(gè)稀釋液的DNA濃度是24. 2ug/10ul和24.6ug/10ul。這兩個(gè)測(cè)定值的平均值(24. 4ug/10ul)對(duì)應(yīng)于大約2· 5X 10基因組拷貝/5ul (5fgE. Col i基因組DNA = I 拷貝)。等溫增強(qiáng)線性擴(kuò)增將DNA在TE緩沖劑中連續(xù)稀釋到109、IO8或IO7拷貝/5ul，并加熱到95°C 5分鐘， 然后在冰上迅速冷卻。還將單鏈模板DNA稀釋到IO9拷貝/5ul。使反應(yīng)體系不包含DNA但包含107、IO8或IO9或2. 5xl09的基因組DNA拷貝。在15ul含有以下組分的反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增20mM Tris-鹽酸，pH8. 5，6. OmM MgCl2,1. OmM dATP,I,OmM dCTP,I. OmM dTTP,O. 8mM dGTP,O. 2mM dITP(dNTP’s from Amersham) ,6% DMSOj1^ 甘油,lOOug/ml 乙酸化 BSA (Ambion, Austin, TX), 0. 6 單位 /ul 重組核糖核酸酶抑制劑(rRNasin, Promega, Madison, WI),5uM組合引物IA005 (例I中所公開的序列)，200nM啟動(dòng)子-模板寡核苷酸(PTO)(例I中所公開的序列)。反應(yīng)體系包含除兩種酶之外的所有組分。將反應(yīng)體系在程序化熱循環(huán)器(GeneAmp 9600,Perkin Elmer)中加熱99°C 10秒鐘之后。在60°C下保溫30分鐘。達(dá)到60°C GeneAmp 9600,Perdin Elmer 之后，加入O. 6ul的RNase H(由IOmM Tris-鹽酸，pH8. 5，30 %甘油中的5U/ul原液稀釋成 O. 05 單位)，Hybr idase, Epicentre Technologies, Madison, WI)和 I. Oul 的 Bca DNA 聚合酶(2. O單位，Panvera, Madison, WI)。在6(TC的保溫結(jié)束時(shí)，將反應(yīng)體系冷卻到4°C。 將5. Oul體積的鏈置換產(chǎn)物加入到每個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(總體積20ul)中。利用標(biāo)準(zhǔn)條件并將反應(yīng)體積增加到20ul來(lái)進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄，以便提供足夠的材料進(jìn)行直接的凝膠分析 (5ul)和探針雜交(IOul)。不象確定的單鏈合成靶物的擴(kuò)增，按照本發(fā)明方法的基因組DNA的擴(kuò)增需要形成確定的終點(diǎn)，以便形成具有確定3’ -端的ssDNA產(chǎn)物。利用封閉劑可實(shí)現(xiàn)引物延伸的確定終點(diǎn)的形成，所述封閉劑與靶鏈上的確定位點(diǎn)雜交并不為聚合酶所置換?；蛘呤牵笤诒纠心菢?，引物位點(diǎn)上游的GC豐富序列為引物延伸提供了終止點(diǎn)，由此導(dǎo)致具有確定3’ -端的ssDNA的形成。圖9 (通道I “無(wú)DNA ;通道2 107拷貝E. coli基因組DNA ;通道3 :空的；通道4 IO8拷貝E. coli基因組DNA)示出了利用本發(fā)明的增強(qiáng)等溫線性擴(kuò)增方法對(duì)基因組DNA的確定序列的成功擴(kuò)增。SsRNA產(chǎn)物被示出，以便與特異性寡核苷酸探針進(jìn)行雜交。實(shí)施例5 :評(píng)估引物設(shè)計(jì)在實(shí)施增強(qiáng)等溫線性擴(kuò)增中的作用評(píng)估在本發(fā)明的擴(kuò)增方法中三個(gè)組合引物的每一個(gè)的性能。在含有以下組分的 15ul反應(yīng)體系中進(jìn)行等溫線性擴(kuò)增20mM Tris-鹽酸，pH8. 5,6. OmM MgCl2,1. OmM dATP, LOmM dCTP, I. OmM dTTP, O. 8mM dGTP, O. 2mM dITP(dNTP’s from Amersham)，6 % DMSO， 8 %甘油，lOOug/ml乙?；疊SA (Ambion, Austin, TX), 0. 6單位/ul重組核糖核酸酶抑制劑(rRNasin, Promega, Madison, WI), 5uM 組合引物，200nM 啟動(dòng)子-模板寡核苷酸(PTO) IA015C。例I公開了 PTO IA015c的序列。例I公開了組合引物IA005 (20鏈節(jié))的序列。 具有字母數(shù)字命名的其它組合引物序列如下所示 IA019 (20 鏈節(jié))ACGGAUGCG⑶CUCCAGTGT (SEQ ID NO 2)IA020(21 鏈節(jié))GACGGAUGCG⑶CUCCAGTGT(SEQ ID NO 3)還使用四個(gè)其它組合引物序列，但是這些引物序列沒(méi)有字母數(shù)字命名。它們的序列分別是(Dgcaagacggaugcg⑶cuccagtgt (seq id no 4)(2)GACGATGCGUCTCCAGTGT(SEQ ID NO :5)(3)GACGGATGCGGUCTCCAGUGT(SEQ ID NO :6)(4)GACGGATGCGGUCTCCAGUGUCCA(SEQ ID NO :7)這些組合引物由Dharmacon Research, Inc. (Boulder, CO)合成。利用與遇酸易變的2’ -原酸酯保護(hù)基團(tuán)(2’ -雙(乙酸基乙氧基)-甲酯或“2-ACE” (Scaringe, S. A.等人的 J.Am. Chem. Soc. 120 :11820-11821(1998)和 Scaringe, S. A. RNA 寡核苷酸合成))共軛的 5-甲硅烷基合成寡核苷酸的RNA部分。引物是PAGE純化的引物。反應(yīng)體系包含除兩種酶之外的所有組分。將反應(yīng)體系在程序化熱循環(huán)器(GeneAmp 9600,Perdin Elmer)中加熱70°C 10秒鐘之后。冷卻到50_65°C。達(dá)到這個(gè)低溫之后，加入 0. 05單位的RNase H(利用以下稀釋劑/貯存液由5U/ul原液稀釋得到的10mM Tris-鹽酸，pH8. 5,)和 2. O 單位的 Bca DNA 聚合酶(2U/ul ；Panvera, Madison, WI)。使反應(yīng)體系在 55-65°C下保溫30分鐘。在保溫結(jié)束時(shí)，將反應(yīng)體系冷卻到4°C，直到RNA轉(zhuǎn)錄開始為止。 在含有以下組分的IOul反應(yīng)體系中于37°C下進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄3小時(shí)。用凝膠電泳解析由每種組合引物產(chǎn)生的增強(qiáng)線性擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果如圖10(通道I : 分子量梯度；通道 1,2 IA015,60°C ;通道 3，4 ΙΑ019, 55°C ;通道5，6 ΙΑ019,60°C ;通道 7， 8 :1八015，651;通道9，10 :IA020，55°C;通道 11，12 :IA020，60°C;通道 12，14 IA020,65°C；) 所示。組合引物被設(shè)計(jì)用來(lái)在靶鏈的相同位點(diǎn)上雜交，并由3-端上的脫氧核苷酸的數(shù)目來(lái)區(qū)分。利用引物IA020、隨后同等地使用IA005和IA019，可產(chǎn)生最高產(chǎn)率的RNA產(chǎn)物。其它四個(gè)組合引物只產(chǎn)生極少的RNA產(chǎn)物。正如所希望的，等溫線性擴(kuò)增步驟的最佳溫度對(duì)于不同引物是不一樣的。
實(shí)施例6 :利用線性擴(kuò)增方法對(duì)核酸靶物進(jìn)行等溫測(cè)序待分析的核酸序列首先被從其來(lái)源中分離出來(lái)。本例中所用的來(lái)源的非限定例子是動(dòng)物、植物、細(xì)菌、病毒、酵母或真菌。如果核酸(DNA或RNA)的來(lái)源是動(dòng)物組織，那么需要對(duì)該組織進(jìn)行均化或超聲或作用一些力，以便使單個(gè)細(xì)胞從相連的組織中分離出來(lái)。要小心操作，以便避免DNA和RNA(尤其是mRNA)的降解以及避免在出來(lái)組織的過(guò)程中剪切基因組DNA。還可從商業(yè)來(lái)源(即Gibco BRL)或非盈利來(lái)源(即American Tissue Type Culture(ATCC))得到動(dòng)物細(xì)胞。根據(jù)所需要的核酸的形式，通過(guò)利用在Sambrook等人的supra中找到的步驟方法可分離基因組DNA、總RNA或mRNA。在Current Protocols in Molecular Biology supra中還發(fā)現(xiàn)了從植物細(xì)胞中分離核酸的方案。如果核酸源是來(lái)自非哺乳動(dòng)物源例如細(xì)菌、酵母、真菌或病毒，則使用稍微不同的方案來(lái)分離核酸。對(duì)于細(xì)菌、酵母、真菌和病毒，這些分離方案可以在Sambrook等人或Current Protocols in Molecular Biology 中找到。正如本文所述，象等溫線性擴(kuò)增所描述的那樣進(jìn)行確定靶核酸序列的擴(kuò)增。大約 IO2到IO12拷貝用于模板。除了用于擴(kuò)增方法的天然脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)之外，該測(cè)序反應(yīng)混合物還包括標(biāo)記的三磷酸類似物。如果每個(gè)類似物都單獨(dú)標(biāo)記，那么這四種物質(zhì)可加入到同一反應(yīng)管內(nèi)。另外，如果每個(gè)核苷酸類似物用相同的標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記，則在四個(gè)不同的反應(yīng)管中進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，其中每一反應(yīng)混合物都含有核苷酸類似物中的一個(gè)。這些類似物利用聚合酶摻合到引物延伸產(chǎn)物中并用于終止沿靶序列的延伸。標(biāo)記所得到的截短延伸產(chǎn)物。按照每一類似物摻合的位點(diǎn)，累積的多個(gè)置換引物延伸產(chǎn)物在長(zhǎng)度上是不同的， 這表示靶序列上互補(bǔ)核苷酸的不同序列部位。通過(guò)在凝膠上運(yùn)動(dòng)產(chǎn)物可進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物的分析，以便闡明序列信息。另外，還可以使用其它分析方法。正如其它測(cè)序方法那樣，該測(cè)序反應(yīng)既可在一個(gè)反應(yīng)容器中進(jìn)行，也可在若干分開的反應(yīng)容器中進(jìn)行。所要用的方法的選擇取決于所用的核苷酸三磷酸類似物。由此當(dāng)每一類似物被不同標(biāo)記時(shí)，可以在一個(gè)容器中進(jìn)行測(cè)序方法。為了使按照本發(fā)明方法的測(cè)序分析性能最佳而選擇試劑和反應(yīng)條件時(shí)所要考慮的因素類似于以前描述的其它方法。根據(jù)加長(zhǎng)終止劑的特異摻合而在尺寸上不同的多個(gè)引物延伸產(chǎn)物可利用本領(lǐng)域內(nèi)公知的各種方法的任一種進(jìn)行尺寸分離。由每一終止劑類似物產(chǎn)生多個(gè)引物延伸產(chǎn)物的現(xiàn)象指示出測(cè)試核酸序列的核苷酸序列實(shí)施例7 :利用增強(qiáng)擴(kuò)增對(duì)核酸靶物進(jìn)行測(cè)序象等溫線性擴(kuò)增所述的那樣進(jìn)行確定靶核酸序列的擴(kuò)增，如本文所述，這涉及到轉(zhuǎn)錄?？梢岳肨S0’ S或ΡΤ0’ S將前啟動(dòng)子序列添補(bǔ)到等溫線性擴(kuò)增產(chǎn)物上。除了用于按照本發(fā)明的增強(qiáng)擴(kuò)增方法的天然核糖核苷三磷酸(rRTPs)之外，該測(cè)序反應(yīng)混合物還包括適當(dāng)標(biāo)記的三磷酸類似物，這些物質(zhì)都可用于本領(lǐng)域內(nèi)公知的其它測(cè)序方法。這些物質(zhì)利用聚合酶摻合到延伸產(chǎn)物中并用于終止沿靶序列的延伸。標(biāo)記所得到的截短延伸產(chǎn)物。 按照每一類似物摻合的位點(diǎn)，累積的多個(gè)置換引物延伸產(chǎn)物在長(zhǎng)度上是不同的，這表示靶序列上互補(bǔ)核苷酸的不同序列部位。正如以上測(cè)序例子中所述的那樣，進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物的分析，以便闡明序列信息。實(shí)施例8 :利用等溫增強(qiáng)線性擴(kuò)增和基因型特異組合引物進(jìn)行基因分型利用以前的例子中所述的方法或者本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員公知的其它方式將基因組DNA從測(cè)試細(xì)胞中分離出來(lái)。對(duì)包括(但不限于)細(xì)菌、病毒、真菌、酵母、植物和動(dòng)物的不同的器官進(jìn)行基因分型?；蛐吞禺愐锏脑O(shè)計(jì)使其既可包括與特異性核酸序列的一個(gè)基因型雜交的3’ -端核苷酸，也可與對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)基因型雜交。確定特異的基因型的序列變異是點(diǎn)突變、單個(gè)核苷酸的多態(tài)性(SNP)、插入缺失以及類似性質(zhì)。象以上例中對(duì)基因組E. coli序列的擴(kuò)增所述的那樣，進(jìn)行確定靶核酸序列的擴(kuò)增。利用基因型特異引物和無(wú)校正活性的DNA聚合酶，擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生指示出確定基因型靶序列的存在。避免引物的3’-端與靶核酸序列雜交的序列變異將阻礙擴(kuò)增。利用本領(lǐng)域內(nèi)公知的、用于檢測(cè)單鏈核酸序列的不同方法的任一種來(lái)檢測(cè)該擴(kuò)增產(chǎn)物。例如，利用凝膠電泳檢測(cè)特異性標(biāo)記的寡核苷酸探針與擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交。在需要對(duì)二倍體細(xì)胞進(jìn)行基因分型的情形(例如測(cè)定同原或異原基因型)中，利用特異性引物進(jìn)行特異性核酸靶序列的擴(kuò)增是切實(shí)可行的，這些特異性引物既可是野生型和突變基因型，也可是一個(gè)基因型與另一個(gè)基因型。在若干分開的反應(yīng)容器內(nèi)利用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。只在一個(gè)反應(yīng)管中有擴(kuò)增產(chǎn)物檢出或者只有極少的擴(kuò)增產(chǎn)物被檢出， 這指示出純合子基因型(即野生型或突變純合子)的存在。這兩個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)指示出純合子基因型的存在。實(shí)施例9 :利用擴(kuò)增方法進(jìn)行基于RNA部分的等溫突變檢測(cè)本文所公開的等溫?cái)U(kuò)增方法可用于檢測(cè)靶核酸序列中的確定突變或多態(tài)位點(diǎn) (例如SNPs)。這些方法用于基因分型或?qū)е驴顾幮缘耐蛔兊臋z測(cè)。該靶核酸序列是單鏈 (ss) DNA。利用本文所述的等溫?cái)U(kuò)增方法由雙鏈DNA靶物或RNA靶物來(lái)制備單鏈DNA靶物。如圖4所示，與野生型DNA序列互補(bǔ)的組合引物用于和ss DNA靶物結(jié)合，通過(guò)仔細(xì)檢查該靶物具有或懷疑有等位基因的突變。使用大約IO2至大約IO12的ss DNA靶物的拷貝和大約O. 05-5 μ M的組合引物。序列變異的存在不會(huì)阻制擴(kuò)增的初始步驟，由此組合引物與靶序列雜交，從而形成第一個(gè)三分子復(fù)合物，而且延伸產(chǎn)物生成。然后核糖核酸酶、 RNase H裂解復(fù)合物的延伸引物的RNA部分。錯(cuò)配序列的存在影響了 RNase H對(duì)組合引物或者引物延伸產(chǎn)物的RNA部分的裂解。這可以避免裂解、改變裂解親權(quán)或者減小裂解效率。 由于以上原因的錯(cuò)配序列可阻礙通過(guò)5’ RNA部分的雜交而使組合引物與復(fù)合物結(jié)合的下一步驟。組合引物不能與靶物雜交，從而避免了引物延伸鏈置換和產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的多個(gè)拷貝的步驟。利用凝膠電泳或者其它同等方法可目測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物或其缺乏?？梢种埔镫s交的因素包括雜交寡核苷酸的尺寸和嚴(yán)格的反應(yīng)條件。按照本領(lǐng)域內(nèi)公知的技術(shù)和規(guī)則，在設(shè)計(jì)組合引物時(shí)要考慮這些因素。與突變DNA序列互補(bǔ)的組合引物還用于同上述的等溫?cái)U(kuò)增方法中的野生型ss DNA靶物結(jié)合。在這種情形下，引物與靶DNA結(jié)合并發(fā)生延伸。然而，由于寡核苷酸的錯(cuò)配序列，更多的引物在用RNase H處理之后不能與野生型DNA結(jié)合，由此極少或沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物生成。利用凝膠電泳或者其它同等方法可目測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物或其缺乏。還要進(jìn)行包括感興趣的核酸樣品或者具有野生型序列的靶核酸的參比樣品的平行反應(yīng)。與后一反應(yīng)相比，前一反應(yīng)中更多的引物延伸產(chǎn)物的積累指示出感興趣的樣品中突變基因型的存在。另外，當(dāng)組合引物包括與測(cè)試靶物的正常基因型序列完全互補(bǔ)的5’RNA 序列時(shí)，可阻礙突變基因型靶序列的擴(kuò)增，并且擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)和/或定量測(cè)定指示出正常的基因型。
實(shí)施例10 :利用等溫?cái)U(kuò)增方法和基因型特異的探針雜交進(jìn)行基因分型在前述例子中描述了利用雜交進(jìn)行測(cè)序的方法。在通過(guò)特異性探針的雜交而測(cè)定序列同一性的過(guò)程中，特別優(yōu)越的是采用本發(fā)明的等溫方法，只要由本發(fā)明方法產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物和單鏈的并容易用于特異性探針的雜交中即可。利用本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法設(shè)計(jì)對(duì)確定基因型特異的探針?？纱_定這樣一個(gè)規(guī)則即，該規(guī)則將支持選擇性探針雜交到由一基因型而不是另一基因型的擴(kuò)增而產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物上。與單核苷酸一樣小的序列變異可阻礙探針的雜交。一些是雜交規(guī)則中要考慮的因素探針長(zhǎng)度、雜交反應(yīng)的溫度和緩沖劑組合物， 特別是二價(jià)離子的濃度。為了分析而用的探針可以在溶液中或者附著到固體表面。而且， 該探針可以直接標(biāo)記或者附著到特異性結(jié)合對(duì)的一員上，并由此能夠特異性結(jié)合到直接或間接標(biāo)記的特異性結(jié)合對(duì)的另一員上。利用本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法或者如上例中所述來(lái)將基因組DNA從測(cè)試樣品中分離出來(lái)。測(cè)試DNA與所述的擴(kuò)增組分、靶物特異的嵌合引物以及前啟動(dòng)子序列(例如ΡΤ0)結(jié)合。將該結(jié)合置于本文所述的保溫條件下，從而產(chǎn)生單鏈RNA擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物與基因型特異的探針的雜交可在具有所附著的基因型特異的探針的溶液或固相中進(jìn)行。由于增強(qiáng)等溫線性擴(kuò)增方法的產(chǎn)物是單鏈的，這些產(chǎn)物理想地適合于固定到固相上例如玻璃片，從而產(chǎn)生一個(gè)空間解析的特異性探針陣列(即基因芯片)。另外，固相包括特異性探針附著的顆粒。利用本領(lǐng)域內(nèi)公知的不同方法(例如)可進(jìn)行探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的檢測(cè)。該特異性探針是標(biāo)記的，并且利用計(jì)算機(jī)算法可檢測(cè)并記錄由于雜交而導(dǎo)致的標(biāo)記空間性質(zhì)的變化。由于特異性探針與擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交而形成的粒子締合現(xiàn)象也可用于探針雜交的檢測(cè)。標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物生成并且利用計(jì)算機(jī)算法可檢測(cè)和記錄其與固定在固體表面的探針的雜交產(chǎn)物。在由rNTP類似物取代四個(gè)rNTPs (是標(biāo)記的)之一的轉(zhuǎn)錄步驟過(guò)程中通過(guò)標(biāo)記 rNTPs的摻合而產(chǎn)生標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物。該標(biāo)記物是染料或者小分子例如生物素，該標(biāo)記物然后通過(guò)與特異性結(jié)合個(gè)體例如標(biāo)記的鏈霉抗生物素結(jié)合而被檢測(cè)。用于檢測(cè)固體表面是的探針雜交的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。實(shí)施例11 :利用rSSCP(RNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性)進(jìn)行基因分型通過(guò)利用本文所述的方法擴(kuò)增特異性靶核酸序列并測(cè)定單鏈RNA產(chǎn)物的電泳區(qū)帶圖可進(jìn)行基因分型，該基因型可影響單鏈構(gòu)象。用于檢測(cè)序列變異的SSCP被廣泛使用。通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行凝膠或毛細(xì)管電泳可測(cè)定基因型特異的單鏈構(gòu)象。通過(guò)按照本發(fā)明方法擴(kuò)增靶核酸序列而導(dǎo)致單鏈產(chǎn)物的生成，使該方法尤其適合于通過(guò)使擴(kuò)增方法與rSSCP分析結(jié)合而進(jìn)行的基因型的測(cè)定。純化的測(cè)試基因組DNA與本發(fā)明擴(kuò)增方法的組分(如上所述)以及靶特異的組合引物和前啟動(dòng)子序列例如PTO結(jié)合。將該結(jié)合置于靶序列的等溫?cái)U(kuò)增條件下。利用本領(lǐng)域內(nèi)公知的儀器和條件，對(duì)含有擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)混合物進(jìn)行凝膠電泳或毛細(xì)管電泳。通過(guò)加入染料嵌入劑而實(shí)現(xiàn)對(duì)寡核苷酸產(chǎn)物的目測(cè)。將擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖與通過(guò)擴(kuò)增從已知基因行細(xì)胞得到的靶核酸序列而產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行比較。電泳遷移圖中的任何變化都指示出序列的變異性。本發(fā)明擴(kuò)增方法與rSSCP的結(jié)合為確定靶序列的序列多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)以及以前確定的基因型的檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)單的方法?？梢灶A(yù)測(cè)已知核酸序列或確定基因型的電泳圖，并且將由測(cè)試DNA擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生的圖形與用于基因型測(cè)定的已知圖形進(jìn)行比較。
權(quán)利要求
1.一種用于擴(kuò)增與祀多核苷酸序列互補(bǔ)的多核苷酸序列的方法，該方法包括(a)使包括靶序列的單鏈DNA模板與一組合引物雜交，所述組合引物包括RNA部分和 3，DNA部分；(b)相對(duì)于組合引物與模板的雜交，將包括終止多核苷酸序列的多核苷酸與模板的5’ 區(qū)域雜交；(c)用DNA聚合酶延伸組合引物；(d)用一種酶裂解退火組合引物的RNA部分，所述酶從DNA/RNA雜交體裂解RNA，以便另一組合引物可與模板雜交并通過(guò)鏈置換重復(fù)引物的延伸，由此產(chǎn)生靶序列的互補(bǔ)序列的多個(gè)拷貝。
2.—種用于擴(kuò)增祀多核苷酸序列的方法，該方法包括(a)使包括靶序列的單鏈DNA模板與一組合引物雜交，所述組合引物包括RNA部分和 3，DNA部分；(b)相對(duì)于組合引物與模板的雜交，將包括終止多核苷酸序列的多核苷酸與模板的5’ 區(qū)域雜交；(c)用DNA聚合酶延伸組合引物；(d)用一種酶裂解退火組合引物的RNA部分，所述酶從DNA/RNA雜交體裂解RNA，以便另一組合引物可與模板雜交并通過(guò)鏈置換重復(fù)引物的延伸，從而產(chǎn)生置換引物延伸產(chǎn)物；(e)使包括前啟動(dòng)子的多核苷酸與一區(qū)域進(jìn)行雜交，該區(qū)域在可發(fā)生由RNA聚合酶進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄的條件下雜交到置換引物延伸產(chǎn)物上，以便生成包括與置換引物延伸產(chǎn)物互補(bǔ)的序列的RNA轉(zhuǎn)錄物，由此產(chǎn)生靶序列的多個(gè)拷貝。
3.權(quán)利要求I或2的方法，其特征在于組合引物的RNA部分是相對(duì)于3’DNA部分的5’ 部分。
4.權(quán)利要求3的方法，其特征在于5’RNA部分鄰近3’ DNA部分。
5.權(quán)利要求I或2的方法，其特征在于采用多個(gè)組合引物。
6.權(quán)利要求I或2的方法，其特征在于包括終止序列的多核苷酸是模板切換寡核苷酸 (TSO)。
7.權(quán)利要求6的方法,其特征在于TSO在與模板雜交的區(qū)域上包括一修飾,其中在一系列給定的條件下，與沒(méi)有修飾的TSO相比，該TSO更緊密地結(jié)合到該區(qū)域上。
8.權(quán)利要求I或2的方法，其特征在于包括終止序列的多核苷酸是一封閉序列。
9.權(quán)利要求8的方法,其特征在于該封閉序列在與模板雜交的區(qū)域上包括一修飾,其中在一系列給定的條件下，與沒(méi)有修飾的封閉序列相比，該封閉序列更緊密地結(jié)合到該區(qū)域上。
10.權(quán)利要求I或2的方法，其特征在于裂解RNA的酶是RNaseH。
11.權(quán)利要求2的方法，其特征在于包括前啟動(dòng)子和雜交到置換引物延伸產(chǎn)物上的區(qū)域的多核苷酸是模板切換寡核苷酸(TSO)。
12.權(quán)利要求2的方法，其特征在于含有前啟動(dòng)子的多核苷酸在3’端包括一個(gè)區(qū)域，該區(qū)域雜交到置換引物延伸產(chǎn)物上，由此置換引物延伸產(chǎn)物的DNA聚合酶的延伸產(chǎn)生一個(gè)用于轉(zhuǎn)錄的雙鏈啟動(dòng)子。
13.權(quán)利要求12的方法，其特征在于包括前啟動(dòng)子的多核苷酸是前啟動(dòng)子模板寡核苷酸(PT。)。
14.權(quán)利要求I或2的方法，其特征在于步驟(a)和(b)的進(jìn)行順序可以互換。
15.權(quán)利要求I或2的方法，其特征在于步驟(a)和(b)可同時(shí)進(jìn)行。
16.權(quán)利要求I或2的方法，其特征在于步驟(a)、(b)和(c)可同時(shí)進(jìn)行。
17.權(quán)利要求I或2的方法，其特征在于步驟(a)和(b)可在步驟(c)之前進(jìn)行。
18.權(quán)利要求I或2的方法，其特征在于所有步驟可同時(shí)進(jìn)行。
19.一種測(cè)序IE核苷酸序列的方法,該方法包括(a)使包括靶序列的單鏈DNA模板與組合引物雜交，所述組合引物包括RNA部分和 3’ DNA部分；(b)相對(duì)于組合引物與模板的雜交，將包括終止多核苷酸序列的多核苷酸與模板的5’ 區(qū)域雜交；(c)用DNA聚合酶以及dNTPs和dNTP類似物的混合物將組合引物延伸到一終止位點(diǎn)， 以便在摻入dNTP類似物時(shí)終止引物的延伸；(d)用一種酶裂解退火組合引物的RNA部分，所述酶從DNA/RNA雜交體裂解RNA，以便另一組合引物可與模板雜交并通過(guò)鏈置換重復(fù)引物的延伸，由此產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的靶序列的互補(bǔ)序列的多個(gè)拷貝；(e)分析步驟(a)至(d)的產(chǎn)物，以便測(cè)定序列。
20.—種測(cè)序IE核苷酸序列的方法,該方法包括(b)使包括靶序列的單鏈DNA模板與組合引物雜交，所述組合引物包括RNA部分和 3，DNA部分；(b)相對(duì)于組合引物與模板的雜交，將包括終止多核苷酸序列的多核苷酸與模板的5’ 區(qū)域雜交；(c)用DNA聚合酶延伸組合引物；(d)用一種酶裂解退火組合引物的RNA部分，所述酶從DNA/RNA雜交體裂解RNA，以便另一組合引物可與模板雜交并通過(guò)鏈置換重復(fù)引物的延伸，以便產(chǎn)生置換引物延伸產(chǎn)物；(e)使包括前啟動(dòng)子的多核苷酸與一區(qū)域進(jìn)行雜交，該區(qū)域在這樣的條件下雜交到置換引物延伸產(chǎn)物上即，可發(fā)生由RNA聚合酶、rNTPs與rNTP類似物的混合物進(jìn)行的延伸產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生包括與置換引物延伸產(chǎn)物互補(bǔ)的序列的RNA轉(zhuǎn)錄物，并且當(dāng)摻入rNTP 類似物時(shí)轉(zhuǎn)錄即被終止，由此產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的靶序列的多個(gè)拷貝；(f)分析步驟(a)至(e)的產(chǎn)物，以便測(cè)定序列。
21.權(quán)利要求19或20的方法，其特征在于組合引物的RNA部分是相對(duì)于3’DNA部分的5’部分。
22.權(quán)利要求21的方法，其特征在于5’RNA部分鄰近3’ DNA部分。
23.一種定性靶多核苷酸中感興趣的序列的方法，所述方法包括實(shí)施權(quán)利要求I或2的方法，其中組合引物的RNA部分的序列是公知的，并且(a)與由包括組合引物RNA部分的互補(bǔ)區(qū)域的參比模板得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的量相比，由模板所生成的可檢測(cè)的擴(kuò)增產(chǎn)物的量較少，由此指示出，相對(duì)于組合引物RNA部分的互補(bǔ)序列，該靶多核苷酸不包括與組合引物的RNA部分互補(bǔ)的序列并且是一個(gè)序列變異體；或者(b)與由不包括組合引物RNA部分的互補(bǔ)區(qū)域的參照模板得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的量相比， 由模板所生成的可檢測(cè)的擴(kuò)增產(chǎn)物的量更多，由此指示出，相對(duì)于組合引物RNA部分的互補(bǔ)序列，該靶多核苷酸包括與組合引物的RNA部分互補(bǔ)的序列并且不是序列變異體。
24.權(quán)利要求23的方法，其特征在于組合弓I物RNA部分的序列包括野生型序列，并且感興趣的序列的特征在于可測(cè)定該野生型序列的存在或缺少。
25.權(quán)利要求23的方法，其特征在于組合引物RNA部分的序列包括突變型序列，并且感興趣的序列的特征在于可測(cè)定該突變型序列的存在或缺少。
26.權(quán)利要求23的方法，其特征在于組合弓I物RNA部分的序列包括等位型序列，并且感興趣的序列的特征在于可測(cè)定該等位型序列的存在或缺少。
27.一種檢測(cè)靶多核苷酸中的突變的方法，該方法包括(a)實(shí)施權(quán)利要求I或2的方法；以及(b)對(duì)于單鏈構(gòu)象，分析該方法的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中與參比單鏈多核苷酸相比，構(gòu)象上的差別指示出靶多核苷酸中的突變。
28.權(quán)利要求23的方法，其特征在于組合引物的RNA部分是相對(duì)于3’DNA部分的5’ 部分。
29.權(quán)利要求28的方法，其特征在于5’RNA部分鄰近3’ DNA部分。
30.一種制備微陣列的方法，該方法包括(a)實(shí)施權(quán)利要求I或2的擴(kuò)增方法；以及(b)將擴(kuò)增產(chǎn)物固定到固相底物上，從而產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的微陣列。
31.一種包括一組合引物的組合物，所述組合引物包括5’ RNA部分和3’ DNA部分。
32.權(quán)利要求31的組合物，其特征在于5’RNA部分鄰近3’ DNA部分。
33.權(quán)利要求31的組合物，其特征在于5’RNA部分具有大約5-大約20個(gè)核苷酸，而 3’ DNA部分具有大約5-大約15個(gè)核苷酸。
34.一種包括TSO的組合物，該TSO在雜交到模板上的區(qū)域中包括一修飾，其中在一系列給定的條件下，與沒(méi)有修飾點(diǎn)的TSO相比，TSO更緊密地結(jié)合到該區(qū)域上。
35.一種包括權(quán)利要求31的組合引物和權(quán)利要求34的TSO的組合物。
36.一種包括權(quán)利要求31的組合引物和一封閉序列的組合物。
37.一種包括權(quán)利要求31的組合引物和一前啟動(dòng)子模板寡核苷酸(PTO)的組合物。
38.一種包括以下組分的復(fù)合物的組合物(a) —模板鏈；以及(b) —組合引物，所述組合引物包括3’ DNA部分和RNA部分。
39.權(quán)利要求38的組合物，其特征在于RNA部分是5’部分并鄰近3’DNA部分。
40.權(quán)利要求39的組合物，其特征在于該復(fù)合物還包括一終止序列。
41.權(quán)利要求40的組合物，其特征在于終止序列是TS0。
42.權(quán)利要求40的組合物，其特征在于終止序列是一封閉序列。
43.一種反應(yīng)混合物，包括(a) —多核苷酸模板；(b) —包括3’DNA部分和一 RNA部分的組合引物；以及(C)DNA聚合酶。
44.權(quán)利要求43的反應(yīng)混合物，其特征在于組合引物包括與3’DNA部分鄰近的5’ RNA 部分。
45.權(quán)利要求44的反應(yīng)混合物，其特征在于還包括一種從RNA/DNA雜交體上裂解RNA 的酶。
46.權(quán)利要求45的反應(yīng)混合物，其特征在于該酶是RNaseH。
47.權(quán)利要求44的反應(yīng)混合物，其特征在于還包括含有終止多核苷酸序列的多核苷酸。
48.權(quán)利要求47的反應(yīng)混合物，其特征在于還包括含有前啟動(dòng)子的多核苷酸。
49.權(quán)利要求48的反應(yīng)混合物，其特征在于包括前啟動(dòng)子的多核苷酸是TS0。
50.權(quán)利要求48的反應(yīng)混合物，其特征在于包括前啟動(dòng)子的多核苷酸是前啟動(dòng)子模板寡核苷酸(PTO)。
51.一種用于擴(kuò)增靶多核苷酸序列的藥盒，包括一種具有3’ DNA部分和RNA部分的組合引物。
52.權(quán)利要求51的藥盒，其特征在于RNA部分是相對(duì)于3’DNA部分的5’部分。
53.權(quán)利要求52的藥盒，其特征在于5’RNA部分鄰近3’ DNA部分。
54.權(quán)利要求51的藥盒，其特征在于還包括含有終止多核苷酸序列的多核苷酸。
55.權(quán)利要求54的藥盒，其特征在于終止多核苷酸序列是TS0。
56.權(quán)利要求54的藥盒，其特征在于終止多核苷酸序列是一封閉劑序列。
57.權(quán)利要求51的藥盒，其特征在于還包括含有前啟動(dòng)子的多核苷酸。
58.權(quán)利要求57的藥盒，其特征在于含有前啟動(dòng)子的多核苷酸是TS0。
59.權(quán)利要求57的藥盒，其特征在于含有前啟動(dòng)子的多核苷酸是ΡΤ0。
60.權(quán)利要求51的藥盒，其特征在于還包括一種從DNA/RNA雜交體上裂解RNA的酶。
61.權(quán)利要求60的藥盒，其特征在于該酶是RNaseH。
62.一種用于擴(kuò)增靶多核苷酸序列或其補(bǔ)體的系統(tǒng)，包括(a)包括3’ DNA部分和RNA 部分的組合引物；(b)DNA聚合酶；以及(c)從DNA/RNA雜交體上裂解RNA的酶。
63.權(quán)利要求62的系統(tǒng)，其特征在于該酶是RNaseH。
64.權(quán)利要求62或63的系統(tǒng)，其特征在于組合引物包括鄰近3’DNA部分的5’ RNA部分。
全文摘要
本發(fā)明提供了若干新的等溫單個(gè)引物線性核酸擴(kuò)增方法。提供了若干利用組合引物、引物延伸、鏈置換以及任意的終止序列來(lái)擴(kuò)增互補(bǔ)的DNA的方法。提供了若干利用組合引物、引物延伸、鏈置換、任意的模板切換、前啟動(dòng)子寡核苷酸以及轉(zhuǎn)錄來(lái)擴(kuò)增有義DNA的方法。本發(fā)明還提供了用于實(shí)施所述方法的組合物及藥盒，以及利用擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102586228SQ20121002296
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2000年9月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月13日
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