本發(fā)明屬于分子生物領(lǐng)域，具體涉及一種VP2融合基因、重組狂犬病病毒感染性cDNA克隆pHEP-rdVP2及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：狂犬病病毒（Rabiesvirus，RV）引起的狂犬?。≧abies），一旦發(fā)病致死率幾乎高達100%，我國是狂犬病的高發(fā)區(qū)，發(fā)病人數(shù)僅次于印度。目前對于狂犬病，主要以有效的疫苗防治為主，人或者動物一旦發(fā)病，無特效藥可治。犬只成為我國狂犬病的主要帶毒宿主和傳染源，消滅人狂犬病，就必須減少流浪狗的數(shù)量，普及家養(yǎng)犬只的免疫，使其免疫率達到70%以上，先在動物中消滅狂犬病?，F(xiàn)有技術(shù)中的獸用滅活狂犬疫苗，成本高、免疫后效果仍然不能讓人滿意。犬細小病毒性腸炎引起成年犬嚴重胃腸炎和幼犬心肌炎。CPV（犬細小病毒）滅活疫苗所誘導(dǎo)的血清抗體效價不高。雖然弱毒苗的效果比較理想，但是弱毒株可能發(fā)生突變、毒力返強現(xiàn)象。犬細小病毒（Canineparvovirus，CPV）粒子呈20面體軸對稱，大小25nm，其衣殼蛋白由VP1、VP2和VP3三種結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成。VP2由8個反向平行的β片層基序和4個展示在外的多肽loop組成，loop1和loop3上集中了CPV主要的B細胞表位。已有研究證明僅VP2蛋白可自行組裝成犬細小病毒樣粒子，loop1、loop3和loop4對于病毒樣粒子的組裝起主要作用，而loop2可容許插入外源性抗原表位，不影響病毒粒子裝配，且能將外源表位展示在病毒樣粒子表面。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種VP2融合基因。本發(fā)明的再一目的是提供攜帶所述雙拷貝融合基因的重組狂犬病病毒感染性cDNA克隆rHEP-rdVP2。本發(fā)明的另一目的是提供重組狂犬病病毒感染性cDNA克隆rHEP-rdVP2的構(gòu)建方法，該方法簡單、高效、安全。本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)：一種VP2融合基因，是將狂犬病毒中和線性抗原表位序列替代犬細小病毒VP2基因部分序列后得到的，所述VP2融合基因的序列如SEQIDNO：1所示。含有所述融合基因的質(zhì)粒、細胞。本發(fā)明還提供攜帶雙拷貝VP2融合基因的重組狂犬病病毒感染性cDNA克隆pHEP-rdVP2，是在重組狂犬病病毒感染性cDNA克隆pHEP-rVP2''基因組的G基因和VP2融合基因之間再插入一個拷貝VP2融合基因后得到的。本發(fā)明提供重組狂犬病病毒感染性cDNA克隆pHEP-rVP2''，是在含有狂犬病病毒HEP-Flury株感染性cDNA克隆中的G基因和L基因之間插入VP2融合基因后得到的。本發(fā)明還提供所述重組狂犬病病毒感染性cDNA克隆pHEP-rdVP2的構(gòu)建方法，包括：利用核酸限制性內(nèi)切酶BsiWI和PstI，分別對VP2融合基因和pHEP-rVP2''質(zhì)粒進行酶切，然后將兩者的酶切片段連接，在重組感染性cDNA克隆pHEP-rVP2'中插入VP2融合基因，構(gòu)建攜帶雙拷貝VP2融合基因的重組質(zhì)粒pHEP-rdVP2本發(fā)明還提供重組感染性cDNA克隆pHEP-rVP2'的構(gòu)建方法，優(yōu)選的技術(shù)方案中，利用核酸限制性內(nèi)切酶BsiWI和NheI，分別對VP2融合基因和pHEP-3.0質(zhì)粒進行酶切，然后將兩者的酶切片段連接，獲得所述重組質(zhì)粒pHEP-rVP2'。本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明提供攜帶兩個拷貝融合基因的重組狂犬病病毒感染性cDNA克隆rHEP-rdVP2，由于設(shè)計上在G后面第一個VP2融合基因尾部加入了轉(zhuǎn)錄終止信號U7序列和下一個VP2融合基因的轉(zhuǎn)錄起始信號UUGU序列，該克隆攜帶的兩個拷貝VP2融合基因可以單獨表達。此外，以狂犬病毒線性中和抗原表位序列替代VP2基因的loop2部分序列，可以在有效表達犬細小病毒VP2融合蛋白基礎(chǔ)上展示線性中和表位，該設(shè)計有利于提高VP2融合蛋白的表達量，提高狂犬病毒中和抗體和犬細小病毒中和抗體誘導(dǎo)能力。本發(fā)明重組狂犬病病毒rHEP-rdVP2株的構(gòu)建方法，簡單、高效、安全。附圖說明圖1為VP2融合基因構(gòu)建策略。圖2為pHEP-rVP2'質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。圖3為pHEP-rVP2'質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖，M為DL15000,1，2：pHEP-rVP2'陽性質(zhì)粒酶切片段。圖4為pHEP-rdVP2質(zhì)粒PCR鑒定電泳圖，M為DL2000,1，2,3：PCR擴增VP2目的片段。具體實施方式以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本
技術(shù)領(lǐng)域：
常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。實施例1VP2融合基因的構(gòu)建采用狂犬病病毒（RV）G蛋白第253-275位點之間的線性中和表位（PPDQLVNLHDFRSDEIEHLVVEE）的編碼序列替換VP2基因中l(wèi)oop2的第684-686位點之間的序列，構(gòu)建VP2融合基因，如圖1所示。VP2融合基因的序列如SEQIDNO:1所示。1.引物設(shè)計根據(jù)Genbank注冊的犬細小病毒VP2基因上、下游序列，設(shè)計擴增VP2基因完整序列的正向引物dVP2-P1和反向引物dVP2-P4，正向引物引入BsiWⅠ和PstI酶切位點，反向引物引入NheⅠ酶切位點，引物序列如下：dVP2-P1:5-AGTCGTACGATTCTGCAGATGAGTGATGGA-3；dVP2-P4:5-CCTGCTAGCTTAATATAATTT-3。根據(jù)VP2基因中l(wèi)oop2的第684-686位點上、下游序列，設(shè)計引物23aa-P2和23aa-P3。引物23aa-P2和23aa-P3帶有狂犬病病毒（RV）G蛋白第253-275位點之間線性中和表位的編碼序列。23aa-P2：5'-TCTGAGCGAAAGTCGTGCAAATTCACCAACTGACCTGGAGGAGTTCCAGTATGA-3'，23aa-P3：5'-ACTTTCGCTCAGACGAGATTGAGCATCTCGTTGAGGAAGAGAGTGGCACACCA-3'。2.VP2融合基因的構(gòu)建抽提犬細小病毒（2a亞型毒株）的基因組DNA。（1）以犬細小病毒基因組DNA為模板，采用引物dVP2-P1和23aa-P2進行PCR擴增，所得片段命名為P1P2片段。PCR擴增體系如表1：表1犬細小病毒基因組DNA4μL10×rTaqBuffer2.5μL2.5mMdNTP2μLVP2-P1（20pmol）各1μL23aa-P2（20pmol）各1μLrTaq0.125μLddH2O14.375μLTotal25μL（2）以犬細小病毒基因組DNA為模板，采用引物23aa-P3和dVP2-P4進行PCR擴增，所得片段命名為P3P4片段。PCR體系如表2：表2犬細小病毒基因組DNA模板4μL10×rTaqBuffer2.5μL2.5mMdNTP2μLVP2-P4（20pmol）各1μL23aa-P3（20pmol）各1μLrTaq0.125μLddH2O14.375μLTotal25μL（3）以P1P2片段和P3P4片段為模板，采用引物VP2-P1和VP2-P4進行PCR擴增，得到VP2融合基因。PCR體系如表3：表3P1P2片段和P3P4片段各4μL10×rTaqBuffer2.5μL2.5mMdNTP2μLdVP2-P1（20pmol）各1μLdVP2-P4（20pmol）各1μLrTaq0.125μLddH2O10.375μLTotal25μL（4）參照Omega公司的凝膠回收試劑盒（E.Z.N.A.GelExtractionKitI）使用說明書對PCR產(chǎn)物進行切膠回收、純化，回收片段與克隆載體pTA2（Takara公司）進行連接。連接反應(yīng)體系如表4所示：表42×LigationBuffer5μLPCR純化產(chǎn)物4μLpTA21μLTotal10μL（5）連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，抽提重組質(zhì)粒，酶切鑒定正確。將質(zhì)粒送測序，結(jié)果成功構(gòu)建VP2融合基因。實施例2VP2融合基因克隆至HEP-Flury株全長cDNA將VP2融合基因插入HEP-Flury株全長cDNA中G基因和L基因之間假基因區(qū)域的BsiWI和NheI酶切位點之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pHEP-rVP2''，策略見圖2所示。具體方法如下：將PCR擴增的VP2融合基因進行切膠回收、純化，將純化的VP2基因和pHEP-3.0質(zhì)粒（攜帶HEP-Flury毒株全長cDNA的重組質(zhì)粒，構(gòu)建方法見ItoN.,TakayamaI.M.,YamadaK.,etal.ImprovedrecoveryofrabiesvirusfromclonedcDNAusingavacciniavirus-freereversegeneticssystem[J].MicrobiologyandImmunology,2003,47(8):613-617.）用BsiWI和NheI核酸限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，酶切體系如表5所示：表5VP2融合基因/pHEP-3.04μL10×Tangobuffer2μLNheI1μLBsiWI1μLddH2O13μLTotal20μL上述體系混勻后，先37℃孵育3h，用凝膠回收試劑盒進行回收。將回收產(chǎn)物連接，連接體系如表6所示：表6VP2融合基因酶切產(chǎn)物7μLpHEP-3.0酶切產(chǎn)物1μLT4DNA連接酶10×Buffer1μLT4DNA連接酶1μLTotal10μL上述體系混勻后，置于連接儀中，22℃連接24h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化XL10-Gold感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，抽提重組質(zhì)粒，用BsiWI/NheI進行酶切鑒定，酶切體系如表7所示：表7重組質(zhì)粒5μL（約1μg）10×TangoBuffer2μLBsiWI1μLNheI1μLddH2O11μLTotal20μL將酶切體系混勻，37℃水浴2h。電泳檢測酶切產(chǎn)物，以pHEP-3.0質(zhì)粒做為對照，見圖3，結(jié)果正確。經(jīng)質(zhì)粒抽提和酶切鑒定正確的質(zhì)粒送上海英駿生物工程有限公司進行序列測定，將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pHEP-rVP2''。將含有質(zhì)粒pHEP-rVP2''的克隆參照Qiagen公司質(zhì)粒中量提取試劑盒說明書進行去內(nèi)毒素中提pHEP-rVP2''重組質(zhì)粒，4℃保存待用。實施例3利用重組質(zhì)粒pHEP-rVP2''構(gòu)建攜帶雙拷貝VP2融合基因的重組病毒感染性cDNA克隆pHEP-rdVP21、利用實施例2中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pHEP-rVP2''構(gòu)建pHEP-rdVP2，構(gòu)建方案見圖4。（1）以pHEP-rVP2''質(zhì)粒為模板，利用上游引物dVP2.F（AGTCGTACGATGAGTGATGGA）和下游引物dVP2.R（序列為：CTGCTAGCAACTGCAGAAAGGTGTTAGTTTTTTTCCTTAATATAATTT）進行PCR擴增。在上游引物dVP2.F中，加入BsiWI酶切位點。下游引物在引入PstI酶切位點及U7終止信號序列和UUGU起始信號序列。這對引物以pHEP-Flury(VP2)質(zhì)粒為模板。PCR反應(yīng)條件：94℃2min；94℃30s，54.5℃30s，68℃1.5min，運行25個循環(huán)；68℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，-20℃保存或直接取5μLPCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mLEB)進行電泳檢測，大小正確，產(chǎn)物命名為dVP2。（2）產(chǎn)物的dVP2和pHEP-rVP2''質(zhì)粒分別用BsiWI/PstI進行雙酶切，將酶切產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化XL10-gold感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆pHEP-rdVP2。以小量堿裂解法抽提質(zhì)粒，HEP-rdVP2質(zhì)粒進行PCR鑒定，見圖4。（3）將酶切正確的質(zhì)粒送上海英駿生物工程有限公司進行序列測定，正確，質(zhì)粒命名為pHEP-rdVP2。將酶切鑒定和測序均正確的克隆參照Qiagen公司質(zhì)粒中量提取試劑盒說明書進行去內(nèi)毒素中提重組質(zhì)粒pHEP-rdVP2)。待拯救用。SEQUENCELISTING<110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院<120>一種VP2融合基因、重組狂犬病病毒感染性cDNA克隆及其構(gòu)建方法<130>20161031<160>2<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1824<212>DNA<213>artificial<220><223>VP2融合基因<400>1atgagtgatggagcagttcaaccagacggtggtcaacctgctgtcagaaatgaaagagca60acaggatctgggaacgggtctggaggcgggggtggtggtggttctgggggtgtggggatt120tctacgggtactttcaataatcagacggaatttaaatttttggaaaacggatgggtggaa180atcacagcaaactcaagcagacttgtacatttaaatatgccagaaagtgaaaattataga240agagtggttgtaaataatttggataaaactgcagttaacggaaacatggctttagatgat300actcatgcacaaattgtaacaccttggtcattggttgatgcaaatgcttggggagtttgg360tttaatccaggagattggcaactaattgttaatactatgagtgagttgcatttagttagt420tttgaacaagaaatttttaatgttgttttaaagactgtttcagaatctgctactcagcca480ccaactaaagtttataataatgatttaactgcatcattgatggttgcattagatagtaat540aatactatgccatttactccagcagctatgagatctgagacattgggtttttatccatgg600aaaccaaccataccaactccatggagatattattttcaatgggatagaacattaatacca660tctcatactggaactcctccaggtcagttggtgaatttgcacgactttcgctcagacgag720attgagcatctcgttgaggaagagagtggcacaccaacaaatatataccatggtacagat780ccagatgatgttcaattttatactattgaaaattctgtgccagtacacttactaagaaca840ggtgatgaatttgctacaggaacatttttttttgattgtaaaccatgtagactaacacat900acatggcaaacaaatagagcattgggcttaccaccatttctgaattctttgcctcaagct960gaaggaggtactaactttggttatataggagttcaacaagataaaagacgtggtgtaact1020caaatgggaaatacaaactatattactgaagctactattatgagaccagctgaggttggt1080tatagtgcaccatattattcttttgaggcgtctacacaagggccatttaaaacacctatt1140gcagcaggacgggggggagcgcaaacagatgaaaatcaagcagcagatggtgatccaaga1200tatgcatttggtagacaacatggtcaaaaaactaccacaacaggagaaacacctgagaga1260tttacatatatagcacatcaagatacaggaagatatccagaaggagattggattcaaaat1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