半乳糖凝集素?3基因序列、Galectin?3蛋白及制備方法與流程

文檔序號：12108795閱讀：644來源：國知局

導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>有機(jī)化合物處理,合成應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種人工合成的半乳糖凝集素-3基因序列、Galectin-3蛋白及制備方法。

背景技術(shù)：

半乳糖凝集素-3(Galectin-3)基因位于人14q21-22位點，由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成，長約17kb。Galectin-3是Galectin(半乳糖凝集素)家族的一員，Galectin家族的成員需要滿足2個標(biāo)準(zhǔn)：對β-半乳糖的親和力和在糖識別域(Carbohydrate recog-nition domain，CRD)有顯著序列相似性。Galectin-3具有識別并結(jié)合可溶性的β-半乳糖苷，能識別糖蛋白和糖脂的特異性低聚糖結(jié)構(gòu)。

總之，Galectin-3對多種生理和病理過程、細(xì)胞生長和凋亡、細(xì)胞黏附、血管形成、炎癥和腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移等方面的研究以及心血管和某些腫瘤的診斷、治療和預(yù)后評價有重要意義。因此制備的Galectin-3及相應(yīng)的鼠抗血清，對Galectin-3的臨床檢測試劑的制備和治療性藥物研發(fā)具有廣泛的應(yīng)用價值和市場前景?，F(xiàn)有技術(shù)中，為了獲得Galectin-3蛋白，采用的方法是：根據(jù)基因庫(GenBank)中Galectin-3基因的序列，設(shè)計合成引物，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)擴(kuò)增Galectin-3基因后，構(gòu)建包含擴(kuò)增后的Galectin-3目的基因的表達(dá)載體，并表達(dá)獲得Galectin-3蛋白。

但是，上述采用PCR擴(kuò)增所獲得的Galectin-3片段存在突變的因素，獲得的Galectin-3蛋白并不穩(wěn)定，且表達(dá)量少、溶解性低、不容易純化。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種人工合成的半乳糖凝集素-3基因序列、Galectin-3蛋白及制備方法，能夠獲得穩(wěn)定的半乳糖凝集素-3蛋白，且表達(dá)量多、溶解性好、易純化。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個技術(shù)方案是：提供一種人工合成的Galectin-3基因序列，所述Galectin-3基因序列包括SEQ ID NO：1。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的另一個技術(shù)方案是：提供一種Galectin-3蛋白，所述Galectin-3蛋白是通過人工合成的Galectin-3基因序列表達(dá)而獲得的，所述Galectin-3基因序列包括SEQ ID NO：1。

其中，所述Galectin-3蛋白是采用CHO細(xì)胞、對包含所述Galectin-3基因序列的表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)而獲得的。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的又一個技術(shù)方案是：提供一種Galectin-3蛋白的制備方法，所述方法包括：人工合成Galectin-3基因序列，其中，所述Galectin-3基因序列包括SEQ ID NO：1；構(gòu)建包含所述Galectin-3基因序列的表達(dá)載體；表達(dá)包含所述Galectin-3基因序列的表達(dá)載體，獲得所述Galectin-3蛋白。

其中，所述表達(dá)包含所述Galectin-3基因序列的表達(dá)載體，獲得所述Galectin-3蛋白的步驟，包括：采用CHO細(xì)胞表達(dá)包含所述Galectin-3基因序列的表達(dá)載體，獲得所述Galectin-3蛋白。

其中，所述表達(dá)載體為pCMV-EGFP質(zhì)粒。

其中，所述表達(dá)包含所述Galectin-3基因序列的表達(dá)載體，獲得所述Galectin-3蛋白的步驟之后，包括：采用鎳瓊脂糖凝膠Ni Sepharose親和層析柱純化所述Galectin-3蛋白。

本發(fā)明的有益效果是：區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的情況，本發(fā)明采用經(jīng)過專門設(shè)計的、采用人工方式合成Galectin-3基因序列，穩(wěn)定性好；該基因序列刪除原始序列上的跨膜區(qū)序列，使得Galectin-3蛋白分泌到細(xì)胞溶液中，提高了溶解性；該基因序列設(shè)計有Kozak序列，能夠促進(jìn)表達(dá)，使得蛋白產(chǎn)量提高；該基因序列設(shè)計有純化標(biāo)簽，有利于表達(dá)的Galectin-3蛋白的純化。

附圖說明

圖1是基因的酶切鑒定圖譜；

圖2是推導(dǎo)Galectin-3蛋白氨基酸信號肽的分析示意圖；

圖3是通過合成的Galectin-3基因序列表達(dá)而獲得的Galectin-3蛋白的SDS電泳圖譜示意圖；

圖4是轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)的熒光狀況示意圖。

具體實施方式

在詳細(xì)說明本發(fā)明之前，先介紹一下與本發(fā)明相關(guān)的基本概念。

Galectin-3相對分子質(zhì)量約31 000，含251個氨基酸殘基，有3個不同的結(jié)構(gòu)域：(1)N端結(jié)構(gòu)域由12個氨基酸殘基組成的，其中的Ser6磷酸化位點具有調(diào)節(jié)細(xì)胞靶向的作用；(2)富含Gly、Tyr、Pro串聯(lián)重復(fù)序列的類膠原結(jié)構(gòu)，作為基質(zhì)金屬蛋白酶的底物；(3)C端是糖識別結(jié)構(gòu)域(CRD)，包含Bcl-2家族同源序列BHl中的保守基序NWGR。

Galectin-3是一種強大的炎癥信號，其促炎作用具體表現(xiàn)為：(1)促進(jìn)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的活化；(2)誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)；(3)趨化單核、巨噬細(xì)胞，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的游走；(4)促進(jìn)中性粒細(xì)胞趨化及內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。Galectin-3主要參與先天性免疫反應(yīng)，其在多種免疫細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞、活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞中均有表達(dá)。Galectin-3可與糖基化的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和膜蛋白以凝集素-糖化合物相互作用的方式結(jié)合，前者包括層黏連蛋白、纖維蛋白、黏蛋白以及Mac-2結(jié)合蛋白等，后者包括整合素CD11b/18和α1/β1、神經(jīng)細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞識別分子L1、髓鞘相關(guān)糖蛋白、Lamp-1,2、MP20及CD98等。Galectin-3廣泛表達(dá)于正常組織和腫瘤組織中，參與多種生理和病理過程，包括細(xì)胞生長和凋亡、細(xì)胞粘附及新生血管形成和腫瘤浸潤與轉(zhuǎn)移等，使Galectin-3作為疾病治療的新靶點成為可能。

Galectin-3的功能：Galectin-3可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生長。通過轉(zhuǎn)染Galectin-3反義寡核苷酸或反義cDNA使細(xì)胞系Galectin-3表達(dá)受抑制，則人類乳腺癌細(xì)胞的生長均受到明顯抑制。Galectin-3可以抑制細(xì)胞凋亡。Galectin-3含有與凋亡抑制蛋白Bcl-2顯著的同源序列，在羧基端都含有NWGR基序，而該基序是Bcl-2抑制凋亡所必需的。Galectin-3調(diào)節(jié)細(xì)胞生存是在細(xì)胞內(nèi)與抗凋亡途徑的一些成分相互作用，Galectin-3表達(dá)增高并在體外結(jié)合Bcl-2，有利于細(xì)胞抵抗由各種因素介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Yang等報道認(rèn)為，Galectin-3在人T細(xì)胞株中異位表達(dá)，可以保護(hù)這些細(xì)胞免于抗Fas抗體和十字孢堿所誘導(dǎo)的凋亡。把Galectin-3的NWGR基序的甘氨酸置換為丙氨酸后，則Galectin-3抗凋亡作用受到抑制。Galectin-3介導(dǎo)細(xì)胞黏附，細(xì)胞與基質(zhì)的黏附主要由整合素介導(dǎo)，細(xì)胞表面有許多蛋白可調(diào)節(jié)整合素的活性。Galectin-3可與細(xì)胞表面糖基化的CD98結(jié)合促使整合素在細(xì)胞表面聚集成簇，間接增強整合素與其配體的親和力。Galectin-3也能直接結(jié)合整合素α1β1和CD11b/18，正性或負(fù)性調(diào)節(jié)整合素的活性，影響整合素與細(xì)胞外配體的結(jié)合。而且由于Galectin-3對多聚糖有親和力，它也可以直接結(jié)合糖基化的細(xì)胞外基質(zhì)成分，包括成黏連蛋白、纖維蛋白、黏蛋白和Mac-2結(jié)合蛋白等，介導(dǎo)細(xì)胞與基質(zhì)的黏附。Galectin-3與腫瘤細(xì)胞表面的Mac-2結(jié)合蛋白、Lamp-1和Lamp-2等蛋白相互作用，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞間的同型聚集。Galectin-3與T抗原相互作用，介導(dǎo)人類乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435與內(nèi)皮細(xì)胞的異型黏附。Galectin-3還可以成為基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)如MMP-2和MMP-9的底物，MMPs可以將Galectin-3進(jìn)行有效切割，切割后生成一個糖識別域，保留完整的相對分子質(zhì)量為22 000的片段；與完整的蛋白相比，切割后的Galectin-3對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的親和力增加了20倍，在腫瘤的侵襲和血管的發(fā)生中具有重要作用。Galectin-3參與腫瘤介導(dǎo)的血管形成。Nangia-Makker等研究結(jié)果表明，Galectin-3在體外刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形成毛細(xì)管，并且對其移動有趨化作用，在體內(nèi)促進(jìn)新生血管的形成。

心力衰竭(Heart failure，HF)是由多種原因的初始心肌損傷引起的心肌結(jié)構(gòu)和功能的變化，最終表現(xiàn)為心室泵血和(或)充盈功能下降。心肌纖維化是心力衰竭病理生理發(fā)展中的關(guān)鍵因素。Galectin-3通過誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)Ⅰ型膠原沉積進(jìn)而導(dǎo)致心室功能不全，是反應(yīng)纖維化和心肌重塑的新型生物標(biāo)志物，直接參與心力衰竭的發(fā)病機(jī)制。目前在國際上，Galectin-3是取代BNP或NT-ProBNP的全新的指標(biāo)，來作為診斷、評估心衰標(biāo)志物，并已獲得美國FDA的批準(zhǔn)而用于臨床。美國BG Medicine Inc第一個開發(fā)成功Galectin-3的產(chǎn)品，方法學(xué)是ELISA(2010年11月7日獲批)。第二家是Fujirebio Diagonostics在去年底(2014年12月23日)獲批用全自動化學(xué)發(fā)光的Galectin-3產(chǎn)品。他們采用前面BG Medicine公司的Galectin-3產(chǎn)品做對照。從目前的文獻(xiàn)上看，Galectin-3與BNP或者NT-ProBNP相比較有許多的好處。Galectin-3在血中的穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于BNP或者NT-ProBNP，因此檢測出來的結(jié)果更可靠。Galectin-3有指導(dǎo)意義的血中濃度都在ng水平，而BNP或NT-ProBNP的水平卻是在pg水平，需要更敏感的方法學(xué)才能檢測。雖然BNP或NT-ProBNP在急性心衰的診斷上還是很敏感有效，但是對慢性心衰的診斷上，Galectin-3都遠(yuǎn)比BNP或NT-ProBNP好。Galectin-3對病人的預(yù)后評估與治療指導(dǎo)遠(yuǎn)比BNP或NT-ProBNP有意義。

Galectin-3在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起重要作用。Galectin-3在某些腫瘤組織中高表達(dá)，其在不同類型腫瘤，如結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌、甲狀腺癌及肺癌等患者中的高表達(dá)水平，與低生存、腫瘤復(fù)發(fā)、預(yù)后差及對化療藥物敏感性降低相關(guān)。對于某些腫瘤，Galectin-3有可能成為一個有價值的診斷標(biāo)志和治療靶點。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是正常細(xì)胞在生長調(diào)節(jié)機(jī)制紊亂下，產(chǎn)生的惡性轉(zhuǎn)化和異型增生。腫瘤轉(zhuǎn)移是指腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位侵入淋巴管、血管或體腔，遷徙到它處繼續(xù)生長，形成與原發(fā)腫瘤同樣類型的腫瘤的過程。這個過程由一系列復(fù)雜的步驟組成，包括腫瘤細(xì)胞對基底膜和基質(zhì)的浸潤，遷徙能力的增強，免疫監(jiān)視的逃脫，在靶器官的種植和新生血管形成等。Galectin-3表達(dá)增強使某些腫瘤的遷徙能力增強。在正常分化上皮細(xì)胞，Galectin-3的分泌通常是朝著細(xì)胞的頂端而不是基底面，而在某些腫瘤細(xì)胞，Galectin-3的表達(dá)增多，并分布于整個細(xì)胞表面，增強腫瘤細(xì)胞與基底膜和基質(zhì)的黏附，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向基底膜和基質(zhì)浸潤。Galectin-3介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞間的同型聚集有助于腫瘤細(xì)胞形成癌栓，抵抗免疫細(xì)胞的殺傷作用。外源性的Galectin-3與T細(xì)胞表面的糖蛋白結(jié)合，直接介導(dǎo)T細(xì)胞的死亡。Galectin-3介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮的異型黏附，促使轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞在靶器官微血管著床。Galectin-3介導(dǎo)的新生血管形成則為腫瘤細(xì)胞的增殖提供了營養(yǎng)支持。Galectin-3可與結(jié)直腸癌細(xì)胞分泌的結(jié)腸癌黏蛋白和Mac-2結(jié)合蛋白相互作用，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。Galectin-3在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)較正常結(jié)直腸上皮高，其表達(dá)的增加與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移和疾病進(jìn)展呈正相關(guān)。Galectin-3有可能成為結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后評價的一個標(biāo)志。Miyazaki等應(yīng)用免疫組化檢測86例胃癌標(biāo)本，Galectin-3表達(dá)陽性占84％，癌組織的表達(dá)較癌旁胃組織明顯增高，并指出Galectin-3有可能作為胃癌進(jìn)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)志。Galectin-3在甲狀腺癌中的表達(dá)增強，且在不同病理類型或不同細(xì)胞起源的惡性甲狀腺腫瘤表達(dá)略有差異，而在正常組織和腺瘤中的表達(dá)缺乏或微弱。Galectin-3的免疫組化檢測結(jié)合傳統(tǒng)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查和臨床表現(xiàn)可提高甲狀腺癌術(shù)前鑒別診斷的敏感性和可靠性。

總之，Galectin-3對多種生理和病理過程、細(xì)胞生長和凋亡、細(xì)胞黏附、血管形成、炎癥和腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移等方面的研究以及心血管和某些腫瘤的診斷、治療和預(yù)后評價有重要意義。因此制備的Galectin-3及相應(yīng)的鼠抗血清，對Galectin-3的臨床檢測試劑的制備和治療性藥物研發(fā)具有廣泛的應(yīng)用價值和市場前景?，F(xiàn)有技術(shù)為了獲得半乳糖凝集素-3蛋白，采用的方法是：根據(jù)GenBank中Galectin-3基因的序列，設(shè)計合成引物，應(yīng)用PCR擴(kuò)增Galectin-3基因后，構(gòu)建包含擴(kuò)增后的Galectin-3基因的表達(dá)載體，并表達(dá)獲得Galectin-3蛋白。但是，采用PCR擴(kuò)增所獲得的Galectin-3基因片段存在突變的因素，獲得的Galectin-3蛋白并不穩(wěn)定，且表達(dá)量少、溶解性低、不容易純化。

本發(fā)明提供一種人工合成的Galectin-3基因序列、Galectin-3蛋白及制備方法，采用經(jīng)過專門設(shè)計的、采用人工方式合成Galectin-3基因序列，穩(wěn)定性好；該基因序列刪除原始序列上的跨膜區(qū)序列，使得Galectin-3蛋白分泌到細(xì)胞溶液中，提高了溶解性；該基因序列設(shè)計有Kozak序列，能夠促進(jìn)表達(dá)，使得蛋白產(chǎn)量提高；該基因序列設(shè)計有純化標(biāo)簽，有利于表達(dá)的Galectin-3蛋白的純化。

下面結(jié)合附圖和實施方式對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

本發(fā)明提供一種人工合成的Galectin-3基因序列，該Galectin-3基因序列包括SEQ ID NO：1。

Genbank中定義的編碼人Galectin-3的序列之一SEQ ID NO：2為：

(版本VERSION：AB006780.1，Genbank ID號GI：2385451，全長943bp)

gcccgcagca cctcctcgcc agcagccgtc cggagccagc caacgagcgg aaaatggcag 60

acaatttttc gctccatgat gcgttatctg ggtctggaaa cccaaaccct caaggatggc 120

ctggcgcatg ggggaaccag cctgctgggg cagggggcta cccaggggct tcctatcctg 180

gggcctaccc cgggcaggca cccccagggg cttatcctgg acaggcacct ccaggcgcct 240

accctggagc acctggagct tatcccggag cacctgcacc tggagtctac ccagggccac 300

ccagcggccc tggggcctac ccatcttctg gacagccaag tgccaccgga gcctaccctg 360

ccactggccc ctatggcgcc cctgctgggc cactgattgt gccttataac ctgcctttgc 420

ctgggggagt ggtgcctcgc atgctgataa caattctggg cacggtgaag cccaatgcaa 480

acagaattgc tttagatttc caaagaggga atgatgttgc cttccacttt aacccacgct 540

tcaatgagaa caacaggaga gtcattgttt gcaatacaaa gctggataat aactggggaa 600

gggaagaaag acagtcggtt ttcccatttg aaagtgggaa accattcaaa atacaagtac 660

tggttgaacc tgaccacttc aaggttgcag tgaatgatgc tcacttgttg cagtacaatc 720

atcgggttaa aaaactcaat gaaatcagca aactgggaat ttctggtgac atagacctca 780

ccagtgcttc atataccatg atataatctg aaaggggcag attaaaaaaa aaaaaagaat 840

ctaaacctta catgtgtaaa ggtttcatgt tcactgtgag tgaaaatttt tacattcatc 900

aatatccctc ttgtaagtca tctacttaat aaatattaca gtg 943

本發(fā)明實施方式中，SEQ ID NO：1的序列如下：

cccaagctta gatctgccac catgtacagg atgcaactcc tgtcttgcat tgcactaagt 60

cttgcacttg tcacaaacag tatggcagac aatttttcgc tccatgatgc gttatctggg 120

tctggaaacc caaaccctca aggatggcct ggcgcatggg ggaaccagcc tgctggggca 180

gggggctacc caggggcttc ctatcctggg gcctaccccg ggcaggcacc cccaggggct 240

tatcctggac aggcacctcc aggcgcctac cctggagcac ctggagctta tcccggagca 300

cctgcacctg gagtctaccc agggccaccc agcggccctg gggcctaccc atcttctgga 360

cagccaagtg ccaccggagc ctaccctgcc actggcccct atggcgcccc tgctgggcca 420

ctgattgtgc cttataacct gcctttgcct gggggagtgg tgcctcgcat gctgataaca 480

attctgggca cggtgaagcc caatgcaaac agaattgctt tagatttcca aagagggaat 540

gatgttgcct tccactttaa cccacgcttc aatgagaaca acaggagagt cattgtttgc 600

aatacaaagc tggataataa ctggggaagg gaagaaagac agtcggtttt cccatttgaa 660

agtgggaaac cattcaaaat acaagtactg gttgaacctg accacttcaa ggttgcagtg 720

aatgatgctc acttgttgca gtacaatcat cgggttaaaa aactcaatga aatcagcaaa 780

ctgggaattt ctggtgacat agacctcacc agtgcttcat ataccatgat tcaccaccac 840

caccaccact aaggatccgc g 861

SEQ ID NO：1的氨基酸序列：

MYRMQLLSCIALSLALVTNSMADNFSLHDALSGSGNPNPQGWPGAWGNQPAGAGGYPGASYPGAYPGQAPPGAYPGQAPPGAYPGAPGAYPGAPAPGVYPGPPSGPGAYPSSGQPSATGAYPATGPYGAPAGPLIVPYNLPLPGGVVPRMLITILGTVKPNANRIALDFQRGNDVAFHFNPRFNENNRRVIVCNTKLDNNWGREERQSVFPFESGKPFKIQVLVEPDHFKVAVNDAHLLQYNHRVKKLNEISKLGISGDIDLTSASYTMIHHHHHH*

比較上述的SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：2，可以發(fā)現(xiàn)：相較于Genbank中定義的編碼人Galectin-3的序列SEQ ID NO：2，在本發(fā)明的SEQ ID NO：1的序列中：

第一、SEQ ID NO：1人工合成而來，不是采用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)而來，這樣能夠避免基因突變的問題，有助于編碼蛋白Galectin-3蛋白的穩(wěn)定性。

第二、將SEQ ID NO：2中后面C端的編碼跨膜區(qū)(SEQ ID NO：2序列中劃線部分的序列)的序列刪除了。刪除之后，SEQ ID NO：1編碼的蛋白Galectin-3蛋白可以直接分泌到細(xì)胞外的溶液中，這樣可以提高編碼蛋白Galectin-3蛋白的溶解性；

第三、在C端的末端連接了用于純化編碼蛋白的6個組氨酸His標(biāo)簽：caccaccaccaccac，這樣可以通過親和層析柱純化編碼蛋白Galectin-3蛋白；

第四、在N端連接了Kozak序列：gccaccatg，能夠提高轉(zhuǎn)錄和翻譯的效率，提高編碼蛋白Galectin-3蛋白的表達(dá)量。

第五、在N端設(shè)計了兩個酶切位點，分別是Hand III(aagctt)和Bgl II(agatct)，在C端設(shè)計了一個酶切位點Bam H I(ggatcc)，這樣方便在表達(dá)的時候，能夠根據(jù)不同的需要，根據(jù)表達(dá)載體上的酶切位點，從而選擇不同的表達(dá)載體。

第六、在N端具有引導(dǎo)表達(dá)的氨基酸信號肽的基因序列，氨基酸信號肽能夠引導(dǎo)Galectin-3蛋白分泌到細(xì)胞膜外，方便收集表達(dá)后的Galectin-3蛋白。

本發(fā)明還提供一種Galectin-3蛋白，該Galectin-3蛋白是通過上述的Galectin-3基因序列表達(dá)而獲得的。

在實際應(yīng)用中，人工合成上述的Galectin-3基因序列后，可以通過現(xiàn)有的技術(shù)構(gòu)建包含目的基因的表達(dá)載體，然后表達(dá)獲得Galectin-3蛋白。

其中，在一實施方式中，Galectin-3蛋白是采用CHO細(xì)胞、對包含Galectin-3基因序列的表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)而獲得的。

中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美國科羅拉多大學(xué)Dr.Theodore T.Puck從一成年雌性倉鼠卵巢分離獲得，為上皮貼壁型細(xì)胞，是生物工程上廣泛使用的細(xì)胞系。該細(xì)胞具有不死性，可以傳代百代以上。另外CHO細(xì)胞在基因工程使用中還有一個優(yōu)點，該細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞(Fibroblast)，是一種非分泌型細(xì)胞，它本身很少分泌CHO內(nèi)源蛋白，因此對目標(biāo)蛋白分離純化工作十分有利?？尚纬捎谢钚缘亩垠w，具有糖基化的功能，CHO為表達(dá)復(fù)雜生物大分子的理想宿主。用CHO細(xì)胞表達(dá)重組的Galectin-3基因序列，獲得的Galectin-3蛋白具有與人自然產(chǎn)生的蛋白完全相似的生物學(xué)特性。

參見圖1，圖1是基因的酶切鑒定圖譜，其中，從左往右，第1道為DNA標(biāo)準(zhǔn)品DNA ladder，從上往下代表的DNA分子量大小分別是：5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。第2道為連接上合成基因后的質(zhì)粒未經(jīng)過酶切的電泳圖譜，第3道為連接上合成基因后的質(zhì)粒經(jīng)過酶切后的酶切電泳圖譜。酶切結(jié)果顯示，第3道的小基因片段大小為0.8kb左右(第3道從上往下第2條帶的位置)，與目的基因大小相符。

參見圖2，圖2是推導(dǎo)Galectin-3蛋白氨基酸信號肽的分析示意圖，應(yīng)用SignalP 4.1 Server信號肽分析軟件，將Galectin-3基因序列推導(dǎo)出來的氨基酸序列的N端100個氨基酸輸入序列框內(nèi)，提交分析結(jié)果呈現(xiàn)，結(jié)果如圖2所示，橫坐標(biāo)代表氨基酸的位置，縱坐標(biāo)代表計算出來的分?jǐn)?shù)，其中，分?jǐn)?shù)大于0.5才可以被切割，分?jǐn)?shù)越高切割就越好。從圖2可知，Galectin-3分子在第22-23之間被切割開。

參見圖3，圖3是通過上述合成的Galectin-3基因序列表達(dá)而獲得的Galectin-3蛋白的SDS電泳圖譜示意圖(原始圖片為彩色圖片)。其中，第1道為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品Marker的SDS電泳圖譜，從上往下代表的蛋白分子量大小分別是：100kD、80kD、46kD、30kD、23kD、17D，，第二道是純化后的Galectin-3蛋白的SDS電泳圖譜。SDS電泳圖譜結(jié)果顯示，純化后只有一條帶，大小約為30kD，與目的蛋白大小相同。

本發(fā)明還提供一種Galectin-3蛋白的制備方法，該方法包括：

步驟一、人工合成Galectin-3基因序列，其中，Galectin-3基因序列包括SEQ ID NO：1；

步驟二、構(gòu)建包含Galectin-3基因序列的表達(dá)載體；

步驟三、表達(dá)包含Galectin-3基因序列的表達(dá)載體，獲得Galectin-3蛋白。

本發(fā)明實施方式采用經(jīng)過專門設(shè)計的、采用人工方式合成Galectin-3基因序列，穩(wěn)定性好；該基因序列刪除原始序列上的跨膜區(qū)序列，使得Galectin-3蛋白分泌到細(xì)胞溶液中，提高了溶解性；該基因序列設(shè)計有Kozak序列，能夠促進(jìn)表達(dá)，使得蛋白產(chǎn)量提高；該基因序列設(shè)計有純化標(biāo)簽，有利于表達(dá)的Galectin-3蛋白的純化。

其中，步驟三具體可以是：采用CHO細(xì)胞表達(dá)包含Galectin-3基因序列的表達(dá)載體，獲得Galectin-3蛋白。

用CHO細(xì)胞表達(dá)重組的Galectin-3基因序列，獲得的Galectin-3蛋白具有與人自然產(chǎn)生的蛋白完全相似的生物學(xué)特性。

其中，表達(dá)載體為pCMV-EGFP質(zhì)粒。

該表達(dá)載體包含增強綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)標(biāo)簽的融合蛋白。該質(zhì)粒含有CMV啟動子，可以高效啟動目的基因在細(xì)胞中的表達(dá)。在多克隆位點的后面有一個EGFP的完整編碼序列，因此在多克隆位點根據(jù)閱讀框插入目的基因就可以表達(dá)含有EGFP標(biāo)簽的融合蛋白。利用EGFP的熒光特性可以比較容易地觀察融合蛋白的表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)定位，也可以利用EGFP抗體來檢測或免疫沉淀融合蛋白。該質(zhì)粒為卡那霉素抗性。

在本發(fā)明實施方式中，將人工合成的Galectin-3基因序列置于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的啟動子下游，在轉(zhuǎn)錄起始點處添加用來增強真核基因的翻譯效率的Kozak序列、Galectin-3序列、純化標(biāo)簽和終止密碼，以BglII和BamH I為酶切位點，克隆至哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體pCMV-EGFP的多克隆位點(Multiple cloning site，MCS)內(nèi)，后面連接了內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(int ernal ribosome entry site，IRES)和EGFP序列及SV40polyA，通過雙酶切鑒定和測序鑒定證明pCMV-Galectin-3-EGFP表達(dá)載體構(gòu)建完全正確。

其中，步驟三之后，還可以包括：采用鎳瓊脂糖凝膠Ni Sepharose親和層析柱純化Galectin-3蛋白。

下面通過具體的實驗步驟來說明上述方法，需要說明的是，下述的步驟僅僅只是一個具體的實驗步驟，并不用來限定本發(fā)明的方法，例如：表達(dá)載體、表達(dá)的宿主細(xì)胞、具體的實驗條件等均可以采用現(xiàn)有技術(shù)中的其他表達(dá)載體、其他表達(dá)的宿主細(xì)胞、其他具體的實驗條件等。

總體來說，本發(fā)明的方法具體包括如下步驟：

(1)Galectin-3基因的克隆和序列分析

本發(fā)明應(yīng)用的基因是根據(jù)Genbank中人源Galectin-3分子序列分析比較后，對Galectin-3信號肽序列、跨膜區(qū)序列、影響體內(nèi)可溶性的膜內(nèi)區(qū)、酶切位點、G+C含量和純化標(biāo)簽等大量序列信息進(jìn)行序列優(yōu)化設(shè)計后，由南京金斯瑞公司直接合成Galectin-3(質(zhì)粒為C6615BH190-2)。

Genbank中可溶性人源Galectin-3序列為SEQ ID NO：2，優(yōu)化設(shè)計后的Galectin-3序列為SEQ ID NO：1。

(2)哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

用無菌接種環(huán)直接從本實驗室凍存的DH5α感受態(tài)細(xì)胞(Solarbio,C1100)在培養(yǎng)基表面劃線，于37℃倒置培養(yǎng)16～20小時(h)，挑取一個單菌落擴(kuò)展培養(yǎng)制備實驗所需的感受態(tài)細(xì)胞，將合成的含有目的基因的pUC57-Galectin-3及pCMV-EGFP質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，從瓊脂平板上挑取轉(zhuǎn)化pUC57-Galectin-3的一個單菌落，接種到含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中生長。同時挑取pCMV-EGFP的一個單菌落，接種到含有氨芐卡那霉素的液體培養(yǎng)基中生長，于37℃轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)每分鐘(rpm)振蕩培養(yǎng)擴(kuò)增至一定密度，使用AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒(AP-MN-P-50)提取質(zhì)粒，用Bgl II和BamH I同時雙酶切，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AP-GX-50)，回收目的基因Galectin-3基因和目的質(zhì)粒pCMV-EGFP，使用T4噬菌體DNA連接酶于16℃溫育12～16h，進(jìn)行連接，將目的基因克隆到pCMV-EGFP多克隆位點Bgl II和BamH I之間。將連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有卡那霉素的平板，于37℃過夜后，挑取5個菌落，置于5毫升(mL)含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h，提取質(zhì)粒。將質(zhì)粒純化后用Bgl II和BamH I雙酶切，能夠切得861bp片段的克隆(如圖1所示)，進(jìn)行序列測定，再次進(jìn)行目的基因的確定。將測定的序列用DNAMANV6進(jìn)行序列分析。

將構(gòu)建的載體進(jìn)行序列測定，結(jié)果顯示與設(shè)計的完全相符，應(yīng)用DNAMAN6分析軟件，與Genbank中登錄的Galectin-3基因序列進(jìn)行了序列比對，結(jié)果顯示完全相同。

(3)CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

將(2)中構(gòu)建的pCMV-Galectin-3-EGFP，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、細(xì)菌增殖和質(zhì)粒的提取、核酸測定儀(Nanodrop One)測定濃度及純度后，用TurboFect Transfection Reagent(Thermo)直接轉(zhuǎn)染生長狀態(tài)良好的用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的CHO細(xì)胞中，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8h后，將轉(zhuǎn)染孔換成含有5％胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)的DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Media:Nutrient Mixture F-12)細(xì)胞生長液，繼續(xù)培養(yǎng)觀察熒光信號。轉(zhuǎn)染36h后原培養(yǎng)基棄去，加CHO細(xì)胞無血清無蛋白化學(xué)培養(yǎng)基，繼續(xù)觀察熒光狀況(參見圖4，原始圖片為彩色圖片)。將需擴(kuò)大培養(yǎng)或傳代的轉(zhuǎn)染細(xì)胞原孔中的培養(yǎng)基吸出，加入胰酶清洗一遍后再加入胰酶消化30秒(s)，將胰酶吸棄，加入培養(yǎng)基吹散細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入至T-75的培養(yǎng)瓶中，添適量CHO細(xì)胞無血清無蛋白化學(xué)培養(yǎng)基，置37℃，在5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)擴(kuò)增。

將構(gòu)建的pCMV-Galectin-3-EGFP載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后，48h后顯微鏡觀察即可見熒光蛋白的表達(dá)，轉(zhuǎn)染72h后顯示50％以上的細(xì)胞有較強的綠色熒光，見圖4所示。因為熒光蛋白基因和目的基因Galectin-3在同一個開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)，只是用IRES將兩者隔開，理論上位于GFP上游的Galectin-3基因應(yīng)該表達(dá)。

(4)重組Galectin-3的純化檢驗

由(3)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h觀察細(xì)胞生長狀態(tài)和熒光蛋白表達(dá)強度，在轉(zhuǎn)染后72h收集細(xì)胞上清，在轉(zhuǎn)速為5000rpm，4于℃下離心15分鐘(min)以上，棄掉細(xì)胞碎片后，上清液直接用NiSepharose親和層析柱純化表達(dá)的Galectin-3蛋白，流速控制在15毫升每小時(mL/h)左右，收集純化后的Galectin-3蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定(如圖3所示)。

在一實施方式中，具體的實驗步驟和實驗過程如下：

(一)Galectin-3基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建

1.1 DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備

用無菌接種環(huán)直接從凍存的DH5α感受態(tài)細(xì)胞在培養(yǎng)基表面劃線，于37℃倒置培養(yǎng)16～20h，挑取一個單菌落于1mL LB(無抗生素)培養(yǎng)基中，制作2～3管，于37℃，轉(zhuǎn)速為180rpm振蕩使其分散，然后加入到30～100mL LB(無抗生素)培養(yǎng)基中稀釋培養(yǎng)，于37℃，轉(zhuǎn)速為200rpm下，培養(yǎng)大約2.5～3h，檢測培養(yǎng)物的生長情況。取培養(yǎng)物置于40mL的滅菌的一次性的冰預(yù)冷的離心管中，冰浴10min，使培養(yǎng)物冷卻至0℃，在轉(zhuǎn)速4000rpm下，于4℃離心10min，棄上清。每50mL初始培養(yǎng)液重懸于30mL預(yù)冷的0.1mol/L CaCl₂-MgCl₂溶液(80mmol/L MgCl₂，20mmol/L CaCl₂)中，輕吹，冰浴10min，在轉(zhuǎn)速4000rpm下，于4℃離心10min，棄上清。每50mL初始培養(yǎng)液重懸于2mL預(yù)冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，輕吹，每2mL重懸細(xì)胞液加70微升(μL)二甲基亞砜(Dimethyl Sulphoxide，DMSO)，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，將懸液置于冰上15min。每份懸液再加70μL DMSO，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，將懸液置于冰上15min。迅速將懸液分裝到預(yù)冷的無菌微量離心管中，封口，投入液氮中快速冰凍感受態(tài)細(xì)胞，于-70℃下保存，需要時從-70℃中取出。

1.2 pCMV-Galectin-3-EGFP載體的構(gòu)建

將合成的含有目的基因的pUC57-Galectin-3，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，用Bgl II和BamH I雙酶切，回收目的基因，克隆到pCMV-EGFP多克隆位點Bgl II和BamH I之間。

1.2.1 pUC57-Galectin-3轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞

將感受態(tài)細(xì)胞(100μL)置于冰上融化。向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入需轉(zhuǎn)化的pUC57-Galectin-3，加入體積≤1μL。輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，冰浴放置30min。將離心管置于42℃水浴中熱沖擊60～90s，不要搖動管，然后快速轉(zhuǎn)移到冰浴中冷卻2～3min，注意不要搖動離心管。向離心管中加入500μL無菌無抗生素的LB培養(yǎng)基，于37℃下，轉(zhuǎn)速為180rpm振蕩培養(yǎng)1h，取適量已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布含相應(yīng)抗生素的LB平板，于37℃倒置培養(yǎng)12～16h。涂布剩余的菌液可4℃保存，如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過少，可以將剩下的菌液再涂布新的平板。

1.2.2 pUC57-Galectin-3質(zhì)粒的提取

從瓊脂平板上挑取轉(zhuǎn)化的pUC57-Galectin-3的一個單菌落，接種到含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，生長到對數(shù)晚期，就可以大量提純質(zhì)粒。使用AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒(AP-MN-P-50，包含Buffer S1、S2、S3、W1、W2)。取30mL在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌液(若使用豐富培養(yǎng)基，菌液體積應(yīng)減半或更少)，在離心力為12,000g下，離心1min，棄盡上清；加250μL Buffer S1懸浮細(xì)菌沉淀，懸浮需均勻，不應(yīng)留有小的菌塊；加250μL Buffer S2，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)4～6次混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液；加350μL Buffer S3，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合6～8次，在離心力12,000g下，離心10min；吸取離心后的上清液并轉(zhuǎn)移到制備管，在離心力12000g下，離心1min。加500μL Buffer W1，在離心力12000g下，離心1min，加700μL Buffer W2，在離心力12000g下，離心1min，以同樣的方法再用700μL Buffer W2洗滌一次，棄濾液；在離心力12000g下，離心1min，將制備管移入新的1.5mL離心管中，加Eluent或去離子水60μL，室溫靜置1min，在離心力12000g下，離心1min收集，可得到極高純度的質(zhì)粒。

1.2.3載體酶切、片段回收

將提取的含有目的基因的質(zhì)粒pUC57-Galectin-3和表達(dá)質(zhì)粒pCMV-EGFP按照下列體系分別酶切：

37℃酶切2h后電泳，在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，分別回收pUC57-Galectin-3中861bp和pCMV-EGFP的5320bp的片段。使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AP-GX-50，包含Buffer DE-A、DE-B、W1、W2)，用紙巾吸盡凝膠表面液體并切碎。計算凝膠重量(提前記錄1.5mL離心管重量)，該重量為一個凝膠體積(如100mg＝100μL體積)。加入3個凝膠體積的Buffer DE-A，混合均勻后于75℃加熱，間斷混合，直至凝膠塊完全熔化(約6～8min)。加0.5個Buffer DE-A體積的Buffer DE-B，混合均勻。轉(zhuǎn)DNA制備管，在離心力12000g下，離心1min。加500μL Buffer W1，在離心力12000g下，離心30s，加700μL Buffer W2，在離心力12000g下，離心30s，以同樣的方法再用700μL Buffer W2洗滌一次，棄濾液；在離心力12000g下，離心1min，將制備管移入新的1.5mL離心管中，加Eluent或去離子水15μL，室溫靜置1min，12000g，離心1min收集。

1.2.4片段的連接、轉(zhuǎn)化和鑒定

將2μL回收酶切的pCMV-EGFP載體DNA片段及回收的Galectin-3基因片段轉(zhuǎn)移到無菌微量離心管中。加水5μL，于45℃加溫5min以使粘端解鏈，將混合物冷卻到0℃。加入10xT4噬菌體DNA連接酶緩沖液2μL、1μL T4噬菌體DNA連接酶0.1Weiss單位、5mmol/L ATP 1μL，然后于16℃溫育1～4h。將連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有卡那霉素的平板，37℃過夜后，挑取5個菌落于5mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h，提取質(zhì)粒。將質(zhì)粒純化后用Bgl II和BamH I雙酶切，能夠切除861bp片段的克隆，進(jìn)行序列測定。

(二)細(xì)胞轉(zhuǎn)染

2.1配制轉(zhuǎn)染試劑

每孔加入100μL DMEM/F12、2微克(μg)pCMV-Galectin-3-EGFP質(zhì)粒及4μL轉(zhuǎn)染試劑，緩慢吸打混勻，室溫靜置20min。

2.2處理細(xì)胞板

用24孔CHO細(xì)胞板長滿70～80％時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，pCMV-Galectin-3-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)2孔，先用500μL無血清DMEM洗2個細(xì)胞孔，每孔洗兩次，為待轉(zhuǎn)染孔，每個待轉(zhuǎn)染孔加入300μL無血清DMEM備用。

2.3 CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

將靜置好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物緩慢吸打1～2次后取100μL/孔均勻滴加至待轉(zhuǎn)染孔中，將24孔板置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8h后將轉(zhuǎn)染孔換細(xì)胞生長液DMEM/F12含5％FBS，繼續(xù)培養(yǎng)觀察熒光信號。轉(zhuǎn)染36h后原培養(yǎng)基棄去，加CHO細(xì)胞無血清無蛋白化學(xué)培養(yǎng)基，繼續(xù)觀察熒光狀況。

2.4轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代、換液：

將需擴(kuò)大培養(yǎng)或傳代的轉(zhuǎn)染細(xì)胞原孔中的培養(yǎng)基吸出，加入胰酶清洗一遍后再加入胰酶消化30s，將胰酶吸棄，加入培養(yǎng)基吹散細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入至T-75的培養(yǎng)瓶中，添適量CHO細(xì)胞無血清無蛋白化學(xué)培養(yǎng)基，置37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(三)重組Galectin-3的純化

3.1細(xì)胞上清的收集和保存

將轉(zhuǎn)染pCMV-Galectin-3-EGFP的CHO細(xì)胞用無血清無蛋白化學(xué)培養(yǎng)基的培養(yǎng)72h，收集細(xì)胞上清，5000rpm/min，4℃離心15min以上。取上清，置于冰上備用或-20℃保存。

3.2層析

將NTA樹脂裝入合適的層析柱，層析用10倍NTA體積的NTA-0 Buffer洗。將樣品加到NTA層析柱中，流速控制在15mL/h左右，收集穿透部分，用于SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。層析用5倍NTA體積的NTA-0 Buffer洗，流速控制在30mL/h左右。分別用5倍NTA體積的NTA-20，NTA-40，NTA-60，NTA-80，NTA-100，NTA-200，NTA-1000 Buffer洗脫，流速控制在15mL/h左右，收集洗脫液，每管收集一個NTA體積。確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況，然后用SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)的分布。

其中，層析溶液配方如下：

NTA-0 Buffer：20mM Tris-HCl，pH為7.9，0.5M NaCl，10％Glycerol；

NTA-20 Buffer：20mM Tris-HCl，pH為7.9，0.5M NaCl，10％Glycerol，20mM咪唑(Imidazole)；

NTA-40 Buffer：20mM Tris-HCl，pH為7.9，0.5M NaCl，10％Glycerol，40mM Imidazole；

NTA-60Buffer：20mM Tris-HCl，pH為7.9，0.5M NaCl，10％Glycerol，60mM Imidazole；

NTA-80Buffer：20mM Tris-HCl，pH為7.9，0.5M NaCl，10％Glycerol，80mM Imidazole；

NTA-100Buffer：20mM Tris-HCl，pH為7.9，0.5M NaCl，10％Glycerol，100mM Imidazole；

NTA-200Buffer：20mM Tris-HCl，pH為7.9，0.5M NaCl，10％Glycerol，200mM Imidazole；

NTA-1000 Buffer：20mM Tris-HCl，pH為7.9，0.5M NaCl，10％Glycerol，1000mM Imidazole。

以上所述僅為本發(fā)明的實施方式，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 奧普金生物科技（深圳）有限公司

<120> 半乳糖凝集素-3基因序列、Galectin-3蛋白及制備方法

<160> 3

<210> 1

<211> 861

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_difference

<222> (1)…(861)

<400> 1