本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及與表皮生長(zhǎng)因子HER3的胞外域(Her3ECD)特異性結(jié)合的ssDNA適配體及其在診斷治療HER3相關(guān)疾病中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

HER3又稱ErbB3，LCCS2，ErbB-3，c-erbB3，erbB3-S，MDA-BF-1，c-erbB-3，p180-ErbB3，p45-sErbB3，p85-sErbB3，是酪氨酸激酶表皮生長(zhǎng)因子家族成員之一，大小為161kDa。人HER3基因定位于染色體12q13。該家族由4個(gè)成員組成，除HER3外，還有EGFR、HER2、HER4。每位成員又是由三個(gè)部分構(gòu)成，分別是胞外區(qū)配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)激酶區(qū)。HER3的胞外區(qū)有神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點(diǎn)但胞內(nèi)沒(méi)有激酶活性。因此，必須與該家族其他成員形成異源二聚體后才能激活MAPK、PI3K-Akt通路，參與包括乳腺癌、肺癌、頭頸癌等多種腫瘤發(fā)生發(fā)展。

目前，國(guó)內(nèi)外已有多家公司以HER3為靶點(diǎn)著手研發(fā)抗癌藥物，HER3抑制劑包括Merrimack制藥的seribantumab(MM-121)，目前處于III期臨床階段；葛蘭素史克的GKS2849330，處于I期臨床研發(fā)階段；以及羅氏旗下基因泰克的HER3/EGFR雙向抑制劑MEHD7945A，正處于研發(fā)中期。

靶向Her3ECD的抑制劑藥物可以應(yīng)用在HER3過(guò)表達(dá)的疾病模型中，包括：1)HER3在HER2介導(dǎo)的乳腺腫瘤中高表達(dá)。在HER2高表達(dá)腫瘤中敲低HER3表達(dá)后會(huì)引起腫瘤縮減，與敲低HER2效果抑制，而在該腫瘤模型中敲低EGFR則不引起腫瘤的消減，此外臨床標(biāo)本檢測(cè)表明，在HER2高表達(dá)乳腺癌標(biāo)本中，HER3高表達(dá)與HER2的高表達(dá)具有高度一致性，而EGFR與HER2的表達(dá)無(wú)此相關(guān)性，上述研究均強(qiáng)調(diào)了HER3在HER2致癌機(jī)制中的獨(dú)特的、關(guān)鍵作用。2)HER3在黑色素瘤中高表達(dá)。HER3可能作為EGFR和/或HER4的協(xié)同作用分子，在黑色素瘤中顯著高表達(dá)，且與疾病的惡性程度和預(yù)后差相關(guān)。3)HER3在肺癌中的高表達(dá)的發(fā)生率是18％-100％，尤其是對(duì)EGFR酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)吉非替尼(gefitinib)治療耐藥的非小細(xì)胞肺癌(non-small lung cell lung carcinomas，NSCLC)中，與治療敏感的NSCLC比較，其HER3高表達(dá)率為100％，此外，在NSCLC患者中，HER3高表達(dá)與其腦轉(zhuǎn)移、生存期短具有顯著相關(guān)性。4)HER3在兒童骨肉瘤中顯著高表達(dá)；5)HER3在某些類型的前列腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌中高表達(dá)(表達(dá)率在10-90％之間)，盡管其參與機(jī)制尚未闡明，但可以明確HER3高表達(dá)與其高轉(zhuǎn)移、預(yù)后差密切相關(guān)。

近些年來(lái)，寡核苷酸適配體作為抗體分子的前景性替代分子，其研究較為引人注目。適配體是應(yīng)用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution ofligands by exponential enrichment，SELEX)從單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中篩選得到的能與靶標(biāo)高特異性、高親和力結(jié)合的配體。適配體具有靶分子范圍廣泛；高特異性與親和性；與靶分子的結(jié)合條件可調(diào)控，易人工合成；穩(wěn)定性好，易修飾；分子小，空間位阻小等優(yōu)勢(shì)。且作為低免疫原性的“抗體類似物”，適配體類靶向治療藥物已經(jīng)應(yīng)用于多種癌癥、黃斑變性、血管性血友病、糖尿病等疾病的治療，同時(shí)也可作為藥物的靶向配體，開(kāi)發(fā)適配體-藥物偶聯(lián)物(aptamer-drug conjugates，ApDCs)，協(xié)助藥物在特定的組織位點(diǎn)釋放。從目前研究及臨床試驗(yàn)來(lái)看，適配體為靶向治療提供了一個(gè)很好的平臺(tái)。且有些藥物已經(jīng)通過(guò)FDA認(rèn)證批準(zhǔn)上市，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用前景。

目前針對(duì)Her3ECD的適配體研究較少，目前僅有2003年的文獻(xiàn)報(bào)道針對(duì)Her3ECD具有較高親和力的RNA適配體，但后續(xù)再無(wú)報(bào)道?；贖ER3在多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展、耐藥及預(yù)后中扮演著非常重要的角色，本發(fā)明可能應(yīng)用在HER3相關(guān)癌癥的診斷、治療及相關(guān)研究中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種對(duì)Her3ECD具有高親和力高選擇性的ssDNA適配體。

本發(fā)明方法利用指數(shù)級(jí)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX技術(shù))，選Her3ECD為靶蛋白。構(gòu)建Her3ECD適配體-藥物偶聯(lián)物(ApDCs)遞送系統(tǒng)，對(duì)其靶向性、抑瘤作用及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究，為同類藥物的研發(fā)提供參考。

本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下措施達(dá)到：本發(fā)明針對(duì)的靶蛋白Her3ECD抗原通過(guò)將Her3ECD質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到293E細(xì)胞表達(dá)，蛋白大小為100kDa，三天后收集培養(yǎng)基并進(jìn)行鎳柱純化得到。

本發(fā)明溶液中的適配體在靶目標(biāo)分子存在的情況下能發(fā)生適應(yīng)性的折疊，會(huì)形成發(fā)夾、莖環(huán)、假結(jié)、凸環(huán)、G-四聚體等特殊的三維空間結(jié)構(gòu)，通過(guò)氫鍵、疏水堆積作用、范德華力等與靶目標(biāo)分子緊密的結(jié)合，體現(xiàn)出較高的親和力。

一方面，本發(fā)明提供了能特異性識(shí)別Her3ECD的ssDNA適配體。

在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的ssDNA適配體具有選自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

本發(fā)明所述的適配體也可以是RNA，且文獻(xiàn)報(bào)道RNA適配體一般顯示出更高的親和力，但RNA不如ssDNA穩(wěn)定，在篩選及成藥的過(guò)程中存在較大的困難。

本發(fā)明所述針對(duì)Her3ECD的適配體，經(jīng)游離Her3ECD蛋白和兩種HER3高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞系MCF7、BT474驗(yàn)證，具有較好的特異性和親和性。經(jīng)ELISA、細(xì)胞流式、激光共聚焦實(shí)驗(yàn)證實(shí)了本發(fā)明適配體對(duì)Her3ECD高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系具有較好的親和性和特異性。

因此，另一方面，本發(fā)明提供了用于診斷Her3ECD高表達(dá)乳腺癌的試劑，其中含有本發(fā)明所述的ssDNA適配體。

另一方面，本發(fā)明提供了用于診斷Her3ECD高表達(dá)乳腺癌的DNA芯片，其上固定有本發(fā)明所述的ssDNA適配體。

另一方面，本發(fā)明提供了用于治療Her3ECD高表達(dá)乳腺癌的藥物組合物，其中含有本發(fā)明所述的ssDNA適配體。

另一方面，本發(fā)明提供了所述的ssDNA適配體在制備Her3ECD高表達(dá)的乳腺癌診斷試劑中的用途。

另一方面，本發(fā)明提供了所述的ssDNA適配體在制備用于Her3ECD高表達(dá)乳腺癌的靶向治療藥物中的用途。

本發(fā)明的適配體容易獲得，并且能夠大量合成，容易進(jìn)行化學(xué)修飾改造，穩(wěn)定性好，可通過(guò)糖苷2’位加以氟或氧甲基修飾，或連接高分子量的聚乙二醇或膽固醇，降低腎清除率，改善其藥代動(dòng)力學(xué)。穩(wěn)定性修飾后適配體還可與納米粒連接，實(shí)現(xiàn)對(duì)化療藥、核酸等藥物的靶向遞送?？梢?jiàn)適配體無(wú)論在臨床診斷還是藥物研究等方面都有廣泛應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明的Her3ECD高親和力高特異性的適配體，可通過(guò)化學(xué)修飾改造，應(yīng)用于HER3高表達(dá)的相關(guān)疾病診斷和治療，可通過(guò)構(gòu)建靶向遞送系統(tǒng)在提高藥效、減少毒副作用的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)對(duì)化療藥、核酸類藥物的靶向遞送。所示HER3相關(guān)性疾病包括EGFR抗體治療失敗型肺癌、HER2陽(yáng)性型抗體類藥物耐藥型乳腺癌、宮頸癌等。該目標(biāo)適配體還可以用于與HER3相關(guān)的科學(xué)研究、或腫瘤等醫(yī)學(xué)或藥學(xué)的應(yīng)用研究。

本發(fā)明所述序列如下：

7#GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAAGGGTCAAGCTGATTACACTTTGTCCACTATTGGGTCCTTCGACATGAGGCCCGGATC

13#GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAGGCTAACAGCACGCAACGGGGGGGAGTAATCGTGTCTGTTCGACATGAGGCCCGGATC

附圖說(shuō)明

圖1圖示的是本發(fā)明所述Her3ECD適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖；

圖2圖示的是細(xì)胞流式檢測(cè)本發(fā)明所述適配體與MCF-7細(xì)胞的結(jié)合特異性；

圖3細(xì)胞流式檢測(cè)適配體與BT474細(xì)胞的結(jié)合實(shí)驗(yàn)；

定義

本發(fā)明中提到的參考著作、專利、專利申請(qǐng)及科學(xué)文獻(xiàn)，構(gòu)成本領(lǐng)域技術(shù)人員的已有知識(shí)，作為整體在此引入作為參考，與這些文獻(xiàn)專門(mén)單個(gè)引入作為參考時(shí)的范圍相同。在本申請(qǐng)所引入文獻(xiàn)與本說(shuō)明書(shū)特定含義之間如有任何抵觸，都應(yīng)該以后者為準(zhǔn)。另外，本領(lǐng)域?qū)υ~匯和短語(yǔ)定義的已有理解與本說(shuō)明書(shū)中對(duì)該詞匯或短語(yǔ)的專門(mén)解釋而定下的定義之間如有抵觸，都以后者為準(zhǔn)。

在進(jìn)一步闡述本發(fā)明之前，我們有必要認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明并不局限于描述的特定的實(shí)施方案，也就是說(shuō)，在具體形式上可能存在著變化。還有一點(diǎn)需要提醒的是，由于本發(fā)明的范圍受附加的權(quán)利要求書(shū)的限制，因此，本文使用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述特定實(shí)施方案的目的，而不是為了限制本發(fā)明的目的。

另外應(yīng)注意，如本說(shuō)明書(shū)中所使用的，單數(shù)形式包括其所指對(duì)象的復(fù)數(shù)形式，除非清除且明確的限于一個(gè)所指對(duì)象。術(shù)語(yǔ)“或”可與術(shù)語(yǔ)“和/或”互換使用，除非上下文另有清除指明。

在某些實(shí)施方案中，適配體與其靶點(diǎn)之間的親和力用KD(解離常數(shù))來(lái)表征，它低于10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、或者約10^-12M或更低。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開(kāi)了一種針對(duì)Her3ECD的適配體，及其相關(guān)親和力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明該適配體具有較好的親和性及特異性，將為HER3高表達(dá)的相關(guān)疾病的診斷治療提供新的思路。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的應(yīng)用以及通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例

實(shí)施例1.基于SELEX技術(shù)篩選Her3ECD ssDNA適配體

1.1構(gòu)建隨機(jī)單鏈DNA(即ssDNA)寡核苷酸文庫(kù)5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA(N38)TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’，其中N38為38個(gè)堿基的隨機(jī)序列，兩端為序列固定的引物序列，引物upⅠ為5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3’，引物downⅠ為5’-GATCCGGGCCTCATGTCGAA-3’，引物downⅡ?yàn)?’-生物素-GATCCGGGCCTCATGTCGAA-3’，庫(kù)容量為10¹⁴以上，合成的隨機(jī)單鏈DNA寡核苷酸文庫(kù)按照1OD/管分裝，凍干粉于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2將Her3ECD質(zhì)粒用PEI試劑(Invitrogen公司)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293E細(xì)胞，三天后收取細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)鎳柱純化獲得帶有His標(biāo)簽的靶蛋白，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色及Western Blotting鑒定該抗原條帶表達(dá)正確且純度較好，可作為靶蛋白進(jìn)行后續(xù)篩選。

1.3選用帶有His標(biāo)簽的磁珠通過(guò)Binding Buffer(磷酸鈉20mM，氯化鈉50mM，咪唑5mM，PH＝7.4)固化蛋白，并加入相應(yīng)PBST(K₂HPO₄ 50mM，氯化鈉150mM，Tween-20 0.05％，PH＝7.5)放于4℃冰箱保存。

1.4ssDNA文庫(kù)與靶蛋白結(jié)合：取1nmol ssDNA文庫(kù)用100μL PBST溶解，95℃變性5min，冰浴10min后，加入到10mL上述步驟(3)中與靶蛋白連接的磁珠中，于室溫旋轉(zhuǎn)結(jié)合30min，然后利用磁力架棄上清，磁珠用PBST緩沖液洗滌3次，棄上清，用Elution buffer(磷酸鈉20mM，氯化鈉50mM，咪唑500mM，PH＝7.4)將磁珠上的蛋白進(jìn)行洗脫，具有一定親和性的ssDNA會(huì)結(jié)合在蛋白上，將洗脫液當(dāng)做QPCR模板進(jìn)行擴(kuò)增，引物選擇upⅠ和downⅡ，程序：預(yù)變性95℃15min，PCR反應(yīng)：95℃10s變性；58℃20s退火；72℃30s延伸。(注明：做過(guò)相應(yīng)實(shí)驗(yàn)比較將蛋白核酸混合物進(jìn)行qPCR或者將結(jié)合的核酸沉淀回收再進(jìn)行qPCR，通過(guò)較為靈敏的銀染圖鑒定，兩者差別很小，且考慮到核酸回收過(guò)程中存在大量損失，后直接采取磁珠洗脫產(chǎn)物直接作為qPCR模板使用。)

1.5鏈霉親和-生物素磁珠分離dsDNA為ssDNA:取鏈霉親和-生物素磁珠用對(duì)應(yīng)Buffer(Tris-Hcl(PH＝7.5)10mM，EDTA 1mM，氯化鈉1M，Tween-20 0.01％-0.1％)洗滌適量磁珠兩次，加入qPCR產(chǎn)物室溫混勻結(jié)合30～60min，Buffer洗滌三次棄凈上清，加入50μl 0.1mol/L新鮮配制的NaOH，于37℃孵育15min，使得dsDNA解鏈。將含有ssDNA的50μl NaOH溶液直接作為下一輪的篩選文庫(kù)，或加入到1ml PBST中，用10mmol/ml的磷酸二氫緩沖液將pH調(diào)節(jié)至7.5后保存。

1.6不相關(guān)蛋白反篩：取不相關(guān)蛋白進(jìn)行篩選，與正篩的區(qū)別是，我們留取與不相關(guān)蛋白未結(jié)合的緩沖液體系。將該體系通過(guò)加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(25:24:1)抽提兩次(靜置5min，離心12000rpm 5min)，加入等體積遇冷的冰乙醇，混勻后冰上靜置30min，12000rpm離心10分鐘，棄上清，70％乙醇漂洗1遍，棄上清，晾干沉淀。加入ddH₂O溶解作為模板進(jìn)行qPCR。

1.7qPCR溶解曲線結(jié)合銀染條帶比對(duì)，確認(rèn)多次篩選后文庫(kù)的準(zhǔn)確性。

1.8篩選到最后的序列經(jīng)PCR擴(kuò)增純化，酶連克隆測(cè)序得到多條適配體，分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)、自由能、同源性，選出幾條備選序列。

實(shí)施例2.Her3ECD ssDNA適配體親和力鑒定

以Her3ECD包被酶標(biāo)板，設(shè)置不同濃度梯度，依次加入1.25、2.5、5、10、50、100及200pmol蛋白，100μl包被液稀釋，4℃包被過(guò)夜；1％BSA 37℃封閉2h；加入10pmol 5’端生物素修飾Her3ECD適配體，37℃孵育1h；PBST洗滌5遍，加入SA-HRP抗體(1:8000)，37℃孵育1h；PBST洗滌5遍，加入TMB底物顯色。其中以GPC3、BSA為陰性對(duì)照。檢測(cè)結(jié)果顯示篩選的Her3ECD適配體與其余兩種蛋白不結(jié)合，數(shù)值與Blank相一致，進(jìn)一步證明該適配體針對(duì)Her3ECD具有較高的特異性與親和力。擬合親和力曲線得出適配體的KD值，其中7#，13#的KD值分別為116nM、98nM，其序列分別為SEQE ID NO:1、SEQE ID NO:2，其二級(jí)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

實(shí)施例3.Her3ECD ssDNA細(xì)胞結(jié)合特異性鑒定

細(xì)胞流式：選經(jīng)NRG1提前4h刺激的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(MCF7細(xì)胞屬于NRG1刺激陽(yáng)性細(xì)胞，經(jīng)刺激后膜表面HER3表達(dá)提高)及未經(jīng)刺激的乳腺癌細(xì)胞系BT474進(jìn)行適配體的親和性特異性驗(yàn)證，選購(gòu)買商品化的HER3抗體做陽(yáng)性對(duì)照，選低表達(dá)HER3的人胚胎細(xì)胞系293T作為陰性對(duì)照。取消化的細(xì)胞PBS洗兩遍，重懸計(jì)數(shù)，取1×10⁶個(gè)，用100μl PBS重懸，分別取5’端FAM標(biāo)記的適配體100pmol以及APC標(biāo)記的商品化的HER3抗體與細(xì)胞避光孵育1h，PBS洗兩遍，2％多聚甲醛固定，分別用細(xì)胞流式儀檢測(cè)細(xì)胞陽(yáng)性率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，商品化HER3抗體與細(xì)胞的親和力在95％，適配體結(jié)合乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(圖2流式檢測(cè)儀：BD，美國(guó)biosciences)及BT474(圖3流式檢測(cè)儀：Guava，德國(guó)Merck Millipore)的陽(yáng)性率均在75％左右，兩者均對(duì)293T表現(xiàn)出極低的親和性(5％左右)，體現(xiàn)出適配體本身良好的親和力及特異性。

實(shí)施例4.Her3ECD ssDNA靶向入胞

激光共聚焦：商品化的HER3抗體與適配體理論上都與細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)HER3ECD抗原結(jié)合，兩者共孵育形成靶位競(jìng)爭(zhēng)，但是也可以通過(guò)共定位說(shuō)明其與細(xì)胞內(nèi)源抗原結(jié)合特性。將乳腺癌細(xì)胞系MCF-7提前種于24孔板大小圓形玻片上，實(shí)驗(yàn)4h前加入NRG1刺激MCF-7細(xì)胞，PBS洗兩遍去除殘留培養(yǎng)基，加入2％多聚甲醛固定細(xì)胞，PBS洗兩遍，加入FAM標(biāo)記的適配體與商品化的兔源HER3抗體避光共孵育1h，PBS洗兩遍，加入針對(duì)抗體的PE標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗孵育30min，PBS洗兩遍，加入300nM DAPI染核3min，PBS洗兩遍，加入防淬滅劑倒置于蓋玻片上，指甲油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果顯示，F(xiàn)ITC-適配體在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布，PE-HER3商品化抗體在主要分布胞漿中，其次核仁中可見(jiàn)，但是除核仁以外的細(xì)胞核中分布較少。

上述結(jié)果表明，本發(fā)明的適配體和商品化抗體具有共定位，提示兩者均與內(nèi)源性HER3抗原結(jié)合后入胞。值得注意的是，適配體除與該抗體共定位外，在細(xì)胞核仁中高表達(dá)，其核仁定位機(jī)制可能與入胞后微觀分布機(jī)制與抗體不同造成，具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

序列表

<110> 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所 軍科正源（北京）藥物研究有限責(zé)任公司

<120> 一種針對(duì)Her3ECD的ssDNA適配體及其在診斷、治療HER3相關(guān)疾病中的應(yīng)用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(81)

<400> 1

gggagctcag aataaacgct caaagggtca agctgattac actttgtcca ctattgggtc 60

cttcgacatg aggcccggat c 81

<210> 2

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(81)

<400> 2

gggagctcag aataaacgct caaggctaac agcacgcaac gggggggagt aatcgtgtct 60

gttcgacatg aggcccggat c 81