一種異胸苷修飾的凝血酶核酸適配體及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種異胸苷修飾的凝血酶核酸適配體及其制備方法和應用，屬于生物醫(yī)藥領域。本發(fā)明通過在合成的凝血酶核酸適配體中摻入化學式I和/或II所示的異胸苷，從而得到一種異胸苷修飾的凝血酶核酸適配體，實驗證明經(jīng)過該方法修飾的人體凝血酶核酸適配體，能夠更好地與凝血酶識別，結合力更強，且具有更強的抗凝效果，因此，有希望將此異胸苷修飾的凝血酶核酸適配體制備成一種高效，高選擇性，低毒副作用的抗凝血藥物。
【專利說明】一種異胸苷修飾的凝血酶核酸適配體及其制備方法和應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種核酸適配體（aptamer)及其制備方法和應用，特別涉及一種異胸 苷修飾的凝血酶核酸適配體（TBA)及其制備方法和應用，所獲得的產品能夠用于疾病治療 特別是能夠應用于制備抗凝藥物中。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域。

【背景技術】
[0002] 抗凝藥物是指一類能夠抑制血液凝固的藥物總稱。根據(jù)功能可分為以下三類：（1) 阻止纖維蛋白形成的藥物如：肝素（UFH)、低分子肝素（LMWH)和華法林（warfarin) ; (2)促 進纖維蛋白溶解的藥物如：尿激酶、鏈激酶、降纖酶、阿替普酶等；（3)抗血小板藥物如：阿 司匹林、前列環(huán)素、雙嘧達莫、氯吡格雷、阿那格雷登等。目前所指的抗凝藥物主要是指能夠 阻止纖維蛋白形成的藥物。
[0003] 抗凝藥物被廣泛用于血栓栓塞性疾病的預防和治療，如腦卒中、房顫（AF)、急性冠 脈綜合征（ACS)、彌散性血管內凝血、肺栓塞（PE)、風心病換瓣術后、外科手術后靜脈血栓 栓塞癥（VTE)、腫瘤、血液透析等。這些疾病均需要應用抗凝藥物來防治血栓栓塞形成和/ 或復發(fā)。
[0004] 以靜脈血栓栓塞（VTE)為例，其包括深靜脈血栓（DVT)及肺動脈栓塞（PE)。是臨 床常見病，嚴重者可危及生命。據(jù)統(tǒng)計，美國每年新發(fā)深靜脈血栓（DVT)病例約200萬人， 并發(fā)肺動脈栓塞（PE)約60萬人，其中致死性肺動脈栓塞（PE) 20萬人，死亡約5萬人，占人 口總死亡原因的第三位，僅次于腫瘤及心肌梗死，而發(fā)展中國家每年約有3-6千萬人發(fā)生 深靜脈血栓（DVT)。靜脈血栓栓塞（VTE)發(fā)生與血流淤滯、血液高凝狀態(tài)及血管壁損傷有 關，主要見于創(chuàng)傷手術和長期制動或高凝的內科患者。靜脈血栓栓塞（VTE)致殘率與致死 率高，并發(fā)大面積PE時可立即致命，約1 / 3患者遺留靜脈炎綜合征。
[0005] 目前常用的抗凝劑包括肝素、低分子肝素和華法林。它們預防和治療血栓栓塞性 疾病的效果已被眾多的臨床試驗所證明而廣泛用于臨床實踐。然而，這些藥物或多或少具 有明顯的缺點，如藥效學或藥動學存在不可預測性，容易導致出血；需要實驗室監(jiān)測以調 整劑量（如肝素、華法林）；肝素誘導的血小板減少癥及骨質疏松癥；非胃腸道給藥（如肝 素、低分子肝素）等等。
[0006] 肝素是一種硫酸化的糖胺聚糖混合物，分子量為3_15kD。其被廣泛應用于防治血 栓栓塞性疾病、彌漫性血管內凝血的早期治療及體外抗凝。通過增加抗凝血酶III (AT-III) 與凝血酶的親和力而發(fā)揮抗凝作用，體內外均有強大的抗凝作用，靜推后立即起效，半衰期 3-4h。普通肝素有其獨特的優(yōu)點：（1)起效快，可完全被魚精蛋白中和，目前它仍是體外循 環(huán)抗凝的首選；（2)通過非腎臟途徑代謝，腎功能不全相對安全；（3)肝素可鈍化IXa、XIa、 XIIa因子，進而阻滯內源性凝血激活通路，故理論上，肝素對導管、支架、瓣膜抗凝效果更 佳。肝素的缺點也很明顯，由于其分子量不均一，與血漿蛋白的結合，及對X因子選擇性差， 導致其安全性差，抗凝效果不穩(wěn)定；其次需依賴AT-III而起作用，在AT-III活性不足或缺 乏的情況下作用受影響；另外還會導致肝素相關性血小板減少（HIT)、骨質疏松、嗜酸性粒 細胞增多等副作用。
[0007] 低分子肝素是由肝素裂解和純化后得到的低分子量肝素（相對分子質量2000? 10000)組成的混合物。前者和比后者具有更好的藥效學和藥動學特性。目前絕大多數(shù)UFH 的適應癥可用LMWH取代，一般不需要監(jiān)測來調整劑量。LMWH的主要不良反應有出血、注射 部位淤點和淤斑等，一般不需特殊處理，LMWH減量即可，嚴重者可用拮抗劑魚精蛋白中和。 此外，LMWH也不能抑制已經(jīng)與血塊結合的凝血酶，仍有引起血小板減少和骨質疏松的危險， 胃腸道外給藥同樣給患者帶來不便。
[0008] 華法林是過去惟一的口服抗凝劑，目前仍是靜脈血栓栓塞癥（VET) -級和二 級預防的標準治療藥物。華法林為香豆類口服抗凝劑，通過干擾肝臟合成依賴于維生 素 K的凝血因子（II，VII，IX，X)從而抑制血液凝固。華法林主要不良反應是出血，如 皮膚出血、鼻衄、牙齦出血、胃腸道出血等，重者可有腦出血。需監(jiān)測以調整劑量，一般 INR(International Normalized Ratio)2?3為宜，治療窗口狹窄。起效慢，用藥后20? 30h顯效，3?5天后達到最大抗凝效果。消除也慢，停藥后抗凝作用可持續(xù)4?5天。華 法林抗凝作用受食物因素影響，與其他藥物有相互作用。
[0009] 在以上三中主要的抗凝藥物中，低分子肝素是常見的治療試劑，其活性高，特異性 強。但由于其是一種大分子混合物，質量不易控制，由此導致其副作用也難以克服。能否開 發(fā)一種質量可控，特異性強的大分子化合物用作抗凝劑成為一種新的藥物研發(fā)思路。1992 年R. F. Macaya，通過體外的SELLEX技術篩選得到的一個15個堿基長度的DNA單鏈，它能 夠特異性地與凝血酶結合抑制凝血酶的活性，因此被命名為凝血酶核酸適配體（thrombin binding aptamer，TBA)。與傳統(tǒng)的小分子藥物相比，TBA的特異性性更好，選擇性更強。與 蛋白藥物分子相比，除繼承了大分子藥物的高特異性外，核酸藥物分子的分子量相對蛋白 藥物分子來說小得多。因此可以通過人工合成的辦法合成核酸小分子藥物，這樣既可以保 持其高特異性又可以通過嚴格的質量控制，控制產品質量，降低副反應發(fā)生的概率。核酸分 子作為一種新興的藥物分子具有廣泛的應用前景。
[0010] 核酸分子TBA能夠高選擇性高特異性地與凝血酶結合抑制凝血酶的活性。此外核 酸是人體內自身產生的大分子物質，對人體毒副作用小，并可在人體內降解生產核苷核，而 核苷酸又可以被人體重復吸收利用合成人體需要的DNA或者RNA。因此將TBA開發(fā)成一種 新型的高選擇性無副作用的藥物分子具有遠大的應用前景。


【發(fā)明內容】

[0011] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種異胸苷修飾的凝血酶核酸適配體及其制 備方法和應用，本發(fā)明通過改變凝血酶進核酸適配體與靶標結合部分堿基的空間構象來增 強與靶標的相互作用，從而達到提高核酸適配體與靶標作用的特異性及生物活性目的。
[0012] 具體的，本發(fā)明通過在合成的凝血酶核酸適配體中摻入化學式I和/或II所示的 異胸苷，從而得到一種異胸苷修飾的凝血酶核酸適配體，實驗證明經(jīng)過該方法修飾的人體 凝血酶核酸適配體，能夠更好地與凝血酶識別，結合力更強，且具有更強的抗凝效果，因此， 有希望將此異胸苷修飾的凝血酶核酸適配體制備成一種高效，高選擇性，低毒副作用的抗 凝血藥物。
[0013] 本發(fā)明的一種異胸苷修飾的凝血酶核酸適配體（TBA)，其特征在于是通過在凝血 酶核酸適配體正義鏈的3位、4位、7位、9位、12位或13位其中一位或者多位上摻入化學式 I或化學式II所示的異胸苷，代替天然核苷在相應位置進行偶聯(lián)得到的；
[0014]

【權利要求】
1. 一種異胸苷修飾的凝血酶核酸適配體（TBA)，其特征在于是通過在凝血酶核酸適配 體正義鏈的3位、4位、7位、9位、12位或13位其中一位或者多位上摻入化學式I或化學式 II所示的異胸苷，代替天然核苷在相應位置進行偶聯(lián)而得到的；
其中，修飾前的凝血酶核酸適配體正義鏈的序列為：5' -GGT TGG TGT GGT TGG -3'。
2. 根據(jù)權利要求1所述的異胸苷修飾的凝血酶核酸適配體，其特征在于是通過在凝血 酶核酸適配體正義鏈的3位、9位、12位摻入式I所示的異胸苷或在凝血酶核酸適配體正義 鏈的7位摻入式II所示的異胸苷代替天然核苷在相應位置進行偶聯(lián)而得到的。
3. 根據(jù)權利要求2所述的異胸苷修飾的凝血酶核酸適配體，其特征在于是通過在凝血 酶核酸適配體正義鏈的12位摻入化學式I所示的異胸苷代替天然核苷在相應位置進行偶 聯(lián)而得到的。
4. 一種制備權利要求1-3任一項所述的異胸苷修飾的凝血酶核酸適配體的方法，其特 征在于在凝血酶核酸適配體正義鏈的3位、4位、7位、9位、12位或13位其中一位或者多位 上摻入化學式I或化學式II所示的異胸苷，代替天然核苷在相應位置進行偶聯(lián)；
其中，修飾前的凝血酶核酸適配體正義鏈的序列為：5' -GGT TGG TGT GGT TGG -3'。
5. 根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于在對凝血酶核酸適配體進行化學修飾前， 將化學式I和/或II所示的異胸苷分別制備成化學式III和/或化學式IV所示的異胸苷 亞磷酰胺單體：
6. 根據(jù)權利要求5所述的方法，使用固相合成技術，采用亞磷酰胺法，在DNA合成儀上， 將一個或幾個權利要求4所述的異胸苷亞磷酰胺單體代替天然核苷亞磷酰胺單體在相應 位置進行偶聯(lián)以摻入到所合成的凝血酶核酸適配體正義鏈序列中，每偶聯(lián)一個核苷為一個 循環(huán)，每個循環(huán)包括四個反應：脫DMT、偶聯(lián)、封閉、氧化。
7. 根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于在用天然核苷亞磷酰胺單體進行偶聯(lián)時， 每個循環(huán)總偶聯(lián)時間為9分鐘，180秒/次，偶聯(lián)3次；在用異胸苷亞磷酰胺單體進行偶聯(lián) 時，每次進樣后的偶聯(lián)時間增加至300秒/次，偶聯(lián)3次，每個循環(huán)總偶聯(lián)時間增加至15分 鐘。
8. 根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于在凝血酶核酸適配體正義鏈的3位、9位、 12位摻入式I所示的異胸苷或在凝血酶核酸適配體正義鏈的7位摻入式II所示的異胸苷 代替天然核苷在相應位置進行偶聯(lián)。
9. 根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于在凝血酶核酸適配體正義鏈的12位摻入化 學式I所示的異胸苷代替天然核苷在相應位置進行偶聯(lián)。
10. 權利要求1-3任一項所述的異胸苷修飾的凝血酶核酸適配體在制備抗凝藥物中的 應用。
【文檔編號】A61K48/00GK104278035SQ201310286784
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月9日 優(yōu)先權日:2013年7月9日
【發(fā)明者】楊振軍, 蔡報彬, 李理宇, 范鑫萌, 武蕓, 張禮和 申請人:北京大學