選擇適配體的組合物和方法
【專利摘要】本發(fā)明涵蓋選擇適配體的組合物和方法。
【專利說(shuō)明】選擇適配體的組合物和方法
[0001]政府權(quán)利
[0002]本發(fā)明是在國(guó)家心臟、肺和血液研究所授予的HHSN268201000030C下，受政府支持進(jìn)行。政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涵蓋選擇適配體的組合物和方法。
[0004]發(fā)明背景
[0005]適配體是可以特異性識(shí)別靶分子的單鏈核酸序列。選擇與靶標(biāo)結(jié)合的適配體的方法已知，但是通常很費(fèi)時(shí)且勞動(dòng)密集。因此，在本領(lǐng)域中需要選擇與特定靶標(biāo)結(jié)合的適配體的快速、高效且有效的方法。
[0006]發(fā)明概述
[0007]本發(fā)明的一方面涵蓋最低限度包含3種構(gòu)建體的組合物。組合物可包含橋構(gòu)建體(Hl)、至少一種適配體構(gòu)建體(I1-12-13-14)和表位結(jié)合劑構(gòu)建體(J1-J2-J3)?？蛇x地，組合物可包含橋構(gòu)建體(Hl)和至少兩種適配體構(gòu)建體(11-12-13-14)。
[0008]本發(fā)明的另一方面涵蓋使用本發(fā)明的組合物選擇一種或多種適配體的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括使本發(fā)明的組合物與靶標(biāo)接觸，從反應(yīng)混合物中分離穩(wěn)定復(fù)合物，并且測(cè)定識(shí)別靶標(biāo)的適配體序列的身份。
[0009]下面更全面地描述了本發(fā)明的其它方面和重復(fù)。
[0010]彩圖參考
[0011]申請(qǐng)文件含至少一張以彩色拍攝的照片。將根據(jù)要求和必要費(fèi)用的支付提供帶彩色照片的該專利申請(qǐng)出版物的副本。
[0012]附圖簡(jiǎn)述
[0013]圖1描繪了示出在現(xiàn)有表位結(jié)合劑的幫助下為靶標(biāo)選擇適配體的組合物的插圖。
[0014]圖2描繪了示出用于為靶標(biāo)同時(shí)篩選一對(duì)適配體的組合物的插圖。
[0015]圖3描繪了示出TnI特異性適配體富集的圖表。
[0016]圖4描繪了示出不同適配體對(duì)TnI蛋白的結(jié)合親和力的圖表。
[0017]圖5描繪了示出TnI適配體的特異性的圖表。
[0018]圖6描繪了示出使用多克隆抗體和Tn1-1適配體的夾心ELISA測(cè)定的結(jié)果的圖表。
[0019]圖7描繪了示出適配體對(duì)TnI蛋白的結(jié)合親和力的圖表。
[0020]圖8描繪了示出TnI特異性適配體富集的圖表。
[0021]圖9描繪了示出適配體對(duì)TnI蛋白的結(jié)合親和力的圖表。
[0022]圖10描繪了示出適配體對(duì)TnI蛋白的結(jié)合親和力的圖表。
[0023]圖11描繪了示出IL-10特異性適配體富集的圖表。
[0024]圖12描繪了示出適配體和抗體對(duì)IL-10蛋白的結(jié)合親和力的圖表。
[0025]圖13描繪了示出IL-10適配體的特異性的圖表。[0026]發(fā)明詳述
[0027]本發(fā)明提供了選擇與特定靶標(biāo)或靶標(biāo)結(jié)合的一種或多種適配體的組合物和方法。有利的是，本組合物和方法提供了選擇適配體的高效且有效的方式。
[0028]1.組合物
[0029]本發(fā)明的一個(gè)方面涵蓋選擇適配體的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋在已知表位結(jié)合劑的存在下選擇一種或多種適配體的組合物。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋無(wú)需在已知表位結(jié)合劑的存在下同時(shí)選擇兩種或更多種適配體的組合物。
[0030]在每個(gè)實(shí)施方案中，選擇與特定靶標(biāo)結(jié)合的適配體。如本文所使用，“靶標(biāo)”指一種或多種生物分子，例如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、其組合或其復(fù)合物。
[0031]一般而言，本發(fā)明的組合物最低限度包含3種構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含橋構(gòu)建體(Hl)、至少一種適配體構(gòu)建體(I1-12-13-14)和表位結(jié)合劑構(gòu)建體(J1-J2-J3)。在另一實(shí)施方案中，組合物包含橋構(gòu)建體(Hl)和至少兩種適配體構(gòu)建體(I1-12-13-14)。下面更詳細(xì)地描述了每種構(gòu)建體。
[0032](a)橋構(gòu)建體
[0033]在一個(gè)實(shí)施方案中，橋構(gòu)建體包含構(gòu)建體Hl。在另一實(shí)施方案中，橋構(gòu)建體包含H1-H2-H3。Hl為單鏈核酸，H2為連接Hl和H3的連接子，而H3為固體支持物。下面更詳細(xì)地描述H1、H2和H3的每一個(gè)。
[0034]Hl為包含與組合物中存在的(適配體構(gòu)建體的)每個(gè)Il互補(bǔ)的序列和(若存在)與(表位結(jié)合劑構(gòu)建體的)Jl互補(bǔ)的序列的單鏈核酸?；パa(bǔ)序列的方向可以并且將會(huì)改變?；パa(bǔ)序列可能相鄰，或可能分開(kāi)。例如，在包含適配體構(gòu)建體和表位結(jié)合劑構(gòu)建體的組合物中，Hl包含與Il互補(bǔ)的序列和與Jl互補(bǔ)的序列。與Il互補(bǔ)的序列可位于與Jl互補(bǔ)的序列的3’?？蛇x地，與Jl互補(bǔ)的序列可位于與Il互補(bǔ)的序列的3’。與Il互補(bǔ)的序列可與與Jl互補(bǔ)的序列相鄰，或它們之間可有核酸。在另一實(shí)例中，在包含兩種適配體構(gòu)建體(I11-1lim和I21-122-123-124)的組合物中，Hl包含與I1I互補(bǔ)的序列和與I2I互補(bǔ)的序列。與I1I互補(bǔ)的序列可位于與I2I互補(bǔ)的序列的3’，或可選地，與I2I互補(bǔ)的序列可位于與I1I互補(bǔ)的序列的3’。與I1I互補(bǔ)的序列可與與I2I互補(bǔ)的序列相鄰，或它們之間可有核酸。
[0035]通常，Hl不應(yīng)自身互補(bǔ)，即Hl不應(yīng)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。Hl可包含天然核酸(即A、T、G、C或U)，或Hl可包含經(jīng)修飾或合成的核酸?？赡埽窍抻谠谔荵位、嘧啶的C-5位和嘌呤的8位發(fā)生修飾。適合的經(jīng)修飾DNA或RNA堿基的實(shí)例可包括2'-氟代核苷酸、2’ -氨基核苷酸、5'-氨烯丙基-2'-氟代核苷酸和硫代磷酸酯核苷酸(一硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯)。在一些實(shí)施方案中，Hl可包含核苷酸模擬物。核苷酸模擬物的實(shí)例可包括鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸(PMO)。
[0036]H2為連接Hl和H3的連接子。H2是任選的，意思是在一些實(shí)施方案中，H2可能存在，而在其它實(shí)施方案中，Hl與H3直接連接，沒(méi)有H2，或僅Hl存在。通常，H2有韌性并且可由天然核酸、合成核酸、其它已知連接子例如雙功能化學(xué)連接子或其組合構(gòu)成。例如，H2可由如以上關(guān)于Hl描述的天然或合成核酸構(gòu)成。在一些實(shí)施方案中，H2為雙功能化學(xué)連接子或雙功能化學(xué)連接子的聚合物，例如異雙功能連接子(或其聚合物)、同雙功能連接子(或其聚合物)或其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙功能化學(xué)連接子為異雙功能性。適合的異雙功能化學(xué)連接子可包括sulfoSMCC (磺基琥珀酰亞胺-4-(N-馬來(lái)酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯)和Ic-SPDP (N-琥珀酰亞胺-6- (3' - (2-呲啶二硫代)-丙酰胺基)-己酸酯)。在另一實(shí)施方案中，雙功能化學(xué)連接子為同雙功能性。適合的同雙功能連接子可包括辛二酸二琥珀酰亞胺酯、戊二酸二琥珀酰亞胺酯和酒石酸二琥珀酰亞胺酯。另外的適合連接子可包括由聚乙二醇構(gòu)成的間隔區(qū)18的氨基磷酸酯形式。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，H2可由雙功能化學(xué)連接子和核酸構(gòu)成。
[0037]如果H2為核酸(天然或合成)，H2長(zhǎng)度可介于約O至約100個(gè)核苷酸之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，H2長(zhǎng)度可介于約10至約100個(gè)核苷酸之間。在另一實(shí)施方案中，H2長(zhǎng)度可介于約10至約25個(gè)核苷酸之間。在再一實(shí)施方案中，H2長(zhǎng)度可介于約25至約50個(gè)核苷酸之間。在又一實(shí)施方案中，H2長(zhǎng)度可介于約50至約75個(gè)核苷酸之間。還有一實(shí)施方案中，H2長(zhǎng)度可介于約75至約100個(gè)核苷酸之間。
[0038]在其它實(shí)施方案中，H2長(zhǎng)度可介于約O至約500埃之間。在一些實(shí)施方案中，H2長(zhǎng)度可介于約20至約400埃之間。在其它實(shí)施方案中，H2長(zhǎng)度可介于約50至約250埃之間。
[0039]H3為固體支持物。H3是任選的，意思是在一些實(shí)施方案中，H3可能存在，而在其它實(shí)施方案中，僅Hl存在(如果沒(méi)有H3，則通常沒(méi)有H2)。適合固體支持物的非限制性實(shí)例可包括微量滴定板、試管、珠粒、樹(shù)脂和其它聚合物，以及本領(lǐng)域已知或本文描述的其它表面。固體支持物可為可能經(jīng)改性含適于構(gòu)建體附接或締合的離散單獨(dú)位點(diǎn)并且可受至少一種檢測(cè)方法檢驗(yàn)的材料。固體支持物材料的非限制性實(shí)例包括玻璃、改性或功能化玻璃、塑料(包括丙烯酸樹(shù)脂、聚苯乙烯及苯乙烯和其它材料的共聚物，聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、TeflonJ等)、尼龍或硝化纖維素、多糖、尼龍、樹(shù)脂、硅石或硅基材料(包括硅和改性硅)、碳、金屬、無(wú)機(jī)玻璃和塑料。固體支持物的尺寸和形狀也可在不背離本發(fā)明范圍的前提下改變。固體支持物可為平面，固體支持物可為孔，即384孔板，或可選地，固體支持物可為珠粒或載玻片。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，H3為珠粒。在又一示例性實(shí)施方案中，H3為磁珠。
[0040]如本領(lǐng)域人員所了解，H3可以多種方式附接于H2(或H1，如果H2不存在)。例如，可先合成H2，隨后附接于H3，或可在H3上直接合成?？捎没瘜W(xué)官能團(tuán)衍生化H3，以便隨后附接于H2 (或H1，如果H2不存在)。例如，可用化學(xué)官能團(tuán)，包括但不限于氨基、羧基、氧代基或硫醇基衍生化H3。使用這些官能團(tuán)，可使用官能團(tuán)使Hl經(jīng)由H2直接或間接附接。可選地，H2也可非共價(jià)附接于表面。例如，可制備可與經(jīng)鏈霉親和素共價(jià)涂覆的H3結(jié)合的生物素化H2，導(dǎo)致附接?？蛇x地，可使用例如光致聚合和光刻法的技術(shù)在表面上合成H2。在另一替代方案中，H2可經(jīng)雙功能化學(xué)連接子附接于H3，并且可經(jīng)互補(bǔ)核酸之間的雜交附接于H1。
[0041]使H2 (Hl)附接于H3的另外的方法和在表面合成核酸的方法在本領(lǐng)域中已知，即來(lái)自Affymetrix的VLSIPS技術(shù)(例如，見(jiàn)美國(guó)專利N0.6，566，495，及 Rockett 和 Dix, " DNA arrays !technology,options and toxicologicalapplications, " Xenobiotica30 (2): 155-177,其全部據(jù)此通過(guò)引用整體并入)。
[0042]在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，橋構(gòu)建體可由A和B1-B2-B3構(gòu)成，以致A與Hl相似，BI和B2與H2相似，并且B3與H3相對(duì)應(yīng)。在這點(diǎn)上，除A未與固體支持物直接連接外，A為與Hl定義相同的單鏈核酸。更確切地說(shuō)，A與BI雜交。BI依次經(jīng)由B2(與H2定義相同)與B3(與H3定義相同)連接，或如以上關(guān)于Hl和H3所詳述，BI與B3直接連接。
[0043](b)適配體構(gòu)建體
[0044]本發(fā)明的適配體構(gòu)建體通常包含構(gòu)建體11-12-13-14。Il為與Hl上的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合的單鏈核酸。
[0045]Il的長(zhǎng)度通常以致在約21°C至約40°C的溫度和在約ImM至約IOOmM的鹽濃度下，Il和Hl之間的締合自由能為約-5至約-12kcal / mol。在其它實(shí)施方案中，在約21°C至約40°C的溫度和在約ImM至約IOOmM的鹽濃度下，Il和Hl之間的締合自由能從約_5kcal /mol、約 _6kcal / mol、約 _7kcal / mol、約 _8kcal / mol、約 _9kcal / mol、約-1Okcal /mol、約-1lkcal / mol 或大于約 _12kcal / mol。
[0046]在一些實(shí)施方案中，Il長(zhǎng)度范圍可為約4至約20個(gè)核苷酸。在其它實(shí)施方案中，Il長(zhǎng)度可為約4個(gè)、約5個(gè)、約6個(gè)、約7個(gè)、約8個(gè)、約9個(gè)、約10個(gè)、約11個(gè)、約12個(gè)、約13個(gè)、約14個(gè)、約15個(gè)、約16個(gè)、約17個(gè)、約18個(gè)、約19或大于約10個(gè)核苷酸。
[0047]12為連接Il與13的連接子。12是任選的，意思是在一些實(shí)施方案中，12可能存在，而在其它實(shí)施方案中，Il與13直接連接，沒(méi)有12。12定義與H2相同。在這點(diǎn)上，12通常具韌性并且可由如同對(duì)H2描述的天然核酸、合成核酸、其它已知連接子例如雙功能化學(xué)連接子或其組合構(gòu)成。
[0048]13為潛在適配體序列。如本文所使用，“潛在適配體序列”指以前不知其對(duì)特定靶標(biāo)具有特異性的單鏈核酸序列。在一些實(shí)施方案中，13為隨機(jī)序列。在其它實(shí)施方案中，13源自合成序列庫(kù)。13的長(zhǎng)度可以并且將會(huì)改變，但是一般而言，13長(zhǎng)度介于約10個(gè)核苷酸至約90個(gè)核苷酸之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，13長(zhǎng)度為約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90個(gè)核苷酸。在另一實(shí)施方案中，13長(zhǎng)度為約25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44 或 45 個(gè)核苷酸。13 可由如同對(duì) Hl定義的天然或合成核酸構(gòu)成。
[0049]14為具有可用作PCR反應(yīng)的引物序列的已知序列的單鏈核苷酸序列。如本文所使用，“引物序列”指能夠與引物雜交，以致引物引發(fā)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的序列。14長(zhǎng)度可改變，但是一般而言，長(zhǎng)度將介于10至50個(gè)核苷酸之間。在一些實(shí)施方案中，14長(zhǎng)度可為約
10、15、20、25、30、35、40、45 或 50 個(gè)核苷酸。
[0050]在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，適配體構(gòu)建體包含C1-C2-C3和D1-D2-D3，以致Cl與Il相對(duì)應(yīng)；C2、C3和Dl與12相對(duì)應(yīng)；D2與13相對(duì)應(yīng)；并且D3與14相對(duì)應(yīng)。具體地，C3為與Dl雜交的單鏈核酸。相反，Dl為與C3雜交的單鏈核酸。C3可經(jīng)由C2(與12定義相同)與Cl (與Il定義相同)連接，或C3與Cl直接連接(例如C2不存在)。
[0051]在需要一次選擇一個(gè)以上適配體的某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可包含一個(gè)以上適配體構(gòu)建體。例如，組合物可包含I11-1l-11S-1H和121-122-123-124，其中I1I和I2I各自與Hl上的不同區(qū)域結(jié)合，但是并非相互互補(bǔ)；14和123為不同的潛在適配體序列，并且I14和124各自為已知引物序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物可包含2、3、4、5、6或6個(gè)以上適配體構(gòu)建體。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，組合物可包含2、3或4個(gè)適配體構(gòu)建體。
[0052](c)表位結(jié)合劑構(gòu)建體
[0053]本發(fā)明的表位結(jié)合劑構(gòu)建體通常包含構(gòu)建體J1-J2-J3。Jl為與Hl上的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合的單鏈核酸。重要的是，Il和Jl并非相互互補(bǔ)，并且Il和Jl各自與Hl上的不同區(qū)域結(jié)合。
[0054]Jl的長(zhǎng)度通常以致在約21°C至約40°C的溫度和在約ImM至約IOOmM的鹽濃度下，Jl和Hl之間的締合自由能為約-5至約-12kcal / mol。在其它實(shí)施方案中，在約21°C至約40°C的溫度和在約ImM至約IOOmM的鹽濃度下，Il和Hl之間的締合自由能為約_5kcal /mol、約 _6kcal / mol、約 _7kcal / mol、約 _8kcal / mol、約 _9kcal / mol、約-1Okcal /mol、約-1lkcal / mol 或大于約 _12kcal / mol。
[0055]在一些實(shí)施方案中，Jl長(zhǎng)度范圍可為約4至約20個(gè)核苷酸。在其它實(shí)施方案中，Jl長(zhǎng)度可為約4個(gè)、約5個(gè)、約6個(gè)、約7個(gè)、約8個(gè)、約9個(gè)、約10個(gè)、約11個(gè)、約12個(gè)、約13個(gè)、約14個(gè)、約15個(gè)、約16個(gè)、約17個(gè)、約18個(gè)、約19或大于約10個(gè)核苷酸。
[0056]J2為連接Jl與J3的連接子。J2是任選的，意思是在一些實(shí)施方案中，J2可能存在，而在其它實(shí)施方案中，Jl與J3直接連接，沒(méi)有J2。J2定義與H2相同。在這點(diǎn)上，J2通常具韌性并且可由如同對(duì)J2描述的天然核酸、合成核酸、其它已知連接子例如雙功能化學(xué)連接子或其組合構(gòu)成。
[0057]J3為與靶標(biāo)結(jié)合的表位結(jié)合劑。根據(jù)靶分子，適合表位結(jié)合劑的非限制性實(shí)例可包括選自適配體、抗體、抗體片段、雙鏈DNA序列、經(jīng)修飾的核酸、核酸模擬物、配體、配體片段、受體、受體片段、多肽、肽、輔酶、輔助調(diào)節(jié)因子、變構(gòu)分子和離子的試劑。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，J3為具有長(zhǎng)度范圍從約20至約110個(gè)堿基的序列的適配體。在另一實(shí)施方案中，J3為選自多克隆抗體、腹水、Fab片段、Fab'片段、單克隆抗體、人源化抗體、嵌合抗體和單鏈抗體的抗體。在又一實(shí)施方案中，J3為肽。
[0058]在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，表位結(jié)合劑構(gòu)建體包含E1-E2-E3和F1-F2-F3，以致El與Jl相對(duì)應(yīng)；E2、E3、F1和F2與J2相對(duì)應(yīng)；并且F3與J3相對(duì)應(yīng)。具體地，E3為與Fl雜交的單鏈核酸。相反，F(xiàn)l為與E3雜交的單鏈核酸。E3可經(jīng)由E2(與J2定義相同)與El (與Jl定義相同)連接，或E3可與El直接連接(例如E2不存在)。類似地，F(xiàn)l可經(jīng)由F2(與J2定義相同)與F3(與J3定義相同)連接，或Fl可與F3直接連接(例如F2不存在)。
[0059](d)與靶標(biāo)的穩(wěn)定復(fù)合物
[0060]本發(fā)明的組合物設(shè)計(jì)為與靶標(biāo)形成穩(wěn)定復(fù)合物。本發(fā)明的穩(wěn)定復(fù)合物需要至少3種構(gòu)建體，構(gòu)成至少4個(gè)結(jié)合事件:1)適配體構(gòu)建體與靶標(biāo)，2)適配體構(gòu)建體與橋構(gòu)建體，及3)第二適配體構(gòu)建體與靶標(biāo)和4)第二適配體構(gòu)建體與橋構(gòu)建體或3)表位結(jié)合劑構(gòu)建體與靶標(biāo)和4)表位結(jié)合劑構(gòu)建體與橋構(gòu)建體。
[0061]當(dāng)至少一種適配體構(gòu)建體連同至少一種表位結(jié)合劑構(gòu)建體一起使用時(shí)，在一些實(shí)施方案中，13和J3與同一靶生物分子上的不同位點(diǎn)結(jié)合。在這點(diǎn)上，J3與靶標(biāo)上的位點(diǎn)結(jié)合，并且選擇潛在適配體(即13)與同一靶標(biāo)上不同于J3結(jié)合位點(diǎn)的位點(diǎn)結(jié)合。在其它實(shí)施方案中，13可與第一生物分子結(jié)合，J3可與第二生物分子結(jié)合，并且第一和第二生物分子可相互結(jié)合以形成復(fù)合物。在這點(diǎn)上，穩(wěn)定復(fù)合物將需要5個(gè)結(jié)合事件:第一生物分子與第二生物分子，13與第一生物分子，J3與第二生物分子，Il與Hl和Jl與Hl。在另一實(shí)施方案中，13可與第一生物分子結(jié)合，J3可與第二生物分子結(jié)合，并且第一和第二生物分子可各自與第三生物分子結(jié)合以形成復(fù)合物。在這點(diǎn)上，穩(wěn)定復(fù)合物將需要6個(gè)結(jié)合事件:第一生物分子與第三生物分子，第二生物分子與第三生物分子，13與第一生物分子，J3與第二生物分子，Il與Hl和Jl與H1。其它實(shí)施方案可能，例如，為靶標(biāo)的特定構(gòu)象選擇適配體。這可通過(guò)在利于靶標(biāo)特定構(gòu)象的條件下(例如在特定金屬、結(jié)合伴侶、鹽濃度等的存在下)與靶標(biāo)一起培育本發(fā)明的組合物完成。
[0062]當(dāng)使用至少兩種適配體構(gòu)建體，無(wú)需表位結(jié)合劑構(gòu)建體時(shí)，存在相同靶標(biāo)可能性，包括，在一些實(shí)施方案中，14和123與同一靶生物分子上的不同位點(diǎn)結(jié)合。在這點(diǎn)上，14與靶標(biāo)上的位點(diǎn)結(jié)合并且選擇123與同一靶標(biāo)上不同于P3結(jié)合位點(diǎn)的位點(diǎn)結(jié)合。在其它實(shí)施方案中，1:3可與第一生物分子結(jié)合，123可與第二生物分子結(jié)合，并且第一和第二生物分子可相互結(jié)合以形成復(fù)合物。在這點(diǎn)上，穩(wěn)定復(fù)合物將需要5個(gè)結(jié)合事件:第一生物分子與第二生物分子，1'3與第一生物分子，123與第二生物分子，I1I與Hl和I2I與Hl。在另一實(shí)施方案中，1:3可與第一生物分子結(jié)合，123可與第二生物分子結(jié)合，并且第一和第二生物分子可各自與第三生物分子結(jié)合以形成復(fù)合物。在這點(diǎn)上，穩(wěn)定復(fù)合物將需要6個(gè)結(jié)合事件:第一生物分子與第三生物分子，第二生物分子與第三生物分子，1:3與第一生物分子，123與第二生物分子，I1I與Hl和I2I與H1。其它實(shí)施方案可能，例如，為靶標(biāo)的特定構(gòu)象選擇適配體。這可通過(guò)在利于靶標(biāo)特定構(gòu)象的條件下(例如在特定金屬、結(jié)合伴侶、鹽濃度等的存在下)與靶標(biāo)一起培育本發(fā)明的組合物完成。
[0063]“穩(wěn)定復(fù)合物”是可從反應(yīng)混合物中分離的穩(wěn)定復(fù)合物。通過(guò)非限制性實(shí)例的方式，可從反應(yīng)混合物中分離H3 (如同當(dāng)H3為珠粒時(shí))，可從H3洗去反應(yīng)混合物(如同當(dāng)H3為表面時(shí))，或當(dāng)H3不存在時(shí)，使反應(yīng)混合物沖刷過(guò)濾器以從剩余混合物中分離H1、另外兩種構(gòu)建體和靶標(biāo)的復(fù)合物。因?yàn)榉€(wěn)定復(fù)合物需要至少4種相互作用，本發(fā)明的組合物設(shè)計(jì)為選擇對(duì)靶標(biāo)具有特異性和親和力的適配體序列，以致每個(gè)13 (或13和J3)與靶標(biāo)之間的結(jié)合事件有助于穩(wěn)定復(fù)合物的形成。
[0064](e)示例性實(shí)施方案
[0065]在一個(gè)示例性實(shí)施`方案中，本發(fā)明的組合物包含表A中所列橋構(gòu)建體、適配體構(gòu)建體和表位結(jié)合劑構(gòu)建體的組合物。在一個(gè)特定示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含表 A 的 vii1.號(hào)組合，即 A ；B1-B2-B3 ;C1-C2_C3 ;D1-D2_D3 ;E1-E2_E3 ;和 F1-F2-F3。
[0066]表A:可能組合物組合
[0067]
【權(quán)利要求】
1.一種組合物,所述組合物包含3種組分:橋構(gòu)建體、適配體構(gòu)建體和表位結(jié)合劑構(gòu)建體，其中 a)所述橋構(gòu)建體包含 A和
B1-B2-B3 ； b)所述適配體構(gòu)建體包含 C1-C2-C3 和
D1-D2-D3 ； c)所述表位結(jié)合劑構(gòu)建體包含 E1-E2-E3, F1-F2-F3 ;并且 其中 A為包含B1、Cl和El的結(jié)合位點(diǎn)的單鏈核酸， BI為與A上的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合的單鏈核酸， B2任選地為連接BI與B3的連接子， B3任選地為固體支持物， Cl為與A上的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合的單鏈核酸，以致當(dāng)D2和F3與靶分子結(jié)合時(shí)，Cl與A穩(wěn)定結(jié)合，但是在IE分子不存在時(shí)，Cl不與A穩(wěn)定結(jié)合， C2為連接Cl與C3的連接子， C3為與Dl互補(bǔ)的單鏈核酸， Dl為與C3互補(bǔ)的單鏈核酸， D2為結(jié)合靶標(biāo)的潛在適配體序列， D3為引物序列， El為與A上的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合的單鏈核酸，以致當(dāng)D2和F3與靶分子結(jié)合時(shí)，El與A穩(wěn)定結(jié)合，但是在IE分子不存在時(shí)，El不與A穩(wěn)定結(jié)合， E2為連接El與E3的連接子， E3為與Fl互補(bǔ)的單鏈核酸。 Fl為與E3互補(bǔ)的單鏈核酸， F2為連接Fl和F3的連接子，并且 F3為與靶標(biāo)結(jié)合的表位結(jié)合劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中B3為珠粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中D3的長(zhǎng)度為約20個(gè)核苷酸至約40個(gè)核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中B2、C2、E2和F2各自由雙功能連接子構(gòu)成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中B2、C2、E2和F2各自由間隔區(qū)18構(gòu)成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中F3為抗體或抗體片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中F3為適配體。
8.—種組合物， 所述組合物包含3種組分:一種橋構(gòu)建體和兩種適配體構(gòu)建體,其中 a)所述橋構(gòu)建體包含 A和B1-B2-B3 ； b)所述第一適配體構(gòu)建體包含 C11-Cm 和 D11-D^-D1S ； c)所述第二適配體構(gòu)建體包含 C21-C22-C23 和 D21-D22-D23 ； 其中 A為包含B1、C1I和C2I的結(jié)合位點(diǎn)的單鏈核酸， BI為與A上的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合的單鏈核酸， B2為連接BI與B3的連接子， B3為固體支持物， C1I為與A上的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合的單鏈核酸，以致當(dāng)Dl和D22與靶分子結(jié)合時(shí)，C1I與A穩(wěn)定結(jié)合，但是在IE分子不存在時(shí)，C1I不與A穩(wěn)定結(jié)合， C'2為連接C1I與63的連接子， C'3為與D1I互補(bǔ)的單鏈核酸， D1I為與CS互補(bǔ)的單鏈核酸， DJ2為結(jié)合靶標(biāo)的潛在適配體序列， D4為引物序列， C2I為與A上的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合的單鏈核酸，以致當(dāng)Dl和D22與靶分子結(jié)合時(shí)，C2I與A穩(wěn)定結(jié)合，但是在IE分子不存在時(shí)，C2I不與A穩(wěn)定結(jié)合， C22為連接C2I與C23的連接子， C23為與D2I互補(bǔ)的單鏈核酸， D2I為與C23互補(bǔ)的單鏈核酸， D22為結(jié)合靶標(biāo)的潛在適配體序列，并且 D23為引物序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中B3為珠粒。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中D4和D23各自長(zhǎng)度為約20個(gè)核苷酸至約40個(gè)核苷酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中B2、C'2和C22各自由雙功能連接子構(gòu)成。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中B2、CJ2和C22各自由間隔區(qū)18構(gòu)成。
13.—種組合物，所述組合物包含3種組分:一種橋構(gòu)建體和兩種適配體構(gòu)建體,其中 a)所述橋構(gòu)建體包含 H1-H2-H3 ； b)所述第一適配體構(gòu)建體包含 I11-1m-1H ； c)所述第二適配體構(gòu)建體包含 I21-122-123-12 4 ； 其中Hl為包含I1I和I2I的結(jié)合位點(diǎn)的單鏈核酸， H2為連接Hl與H3的連接子， H3為固體支持物， I1I為與Hl上的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合的單鏈核酸，以致當(dāng)14和123與靶分子結(jié)合時(shí)，I1I與Hl穩(wěn)定結(jié)合，但是在靶分子不存在時(shí)，I1I不與Hl穩(wěn)定結(jié)合， Il為連接I1I與P3的連接子， IJ3為結(jié)合靶標(biāo)的潛在適配體序列， IH為引物序列， I2I為與Hl上的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合的單鏈核酸，以致當(dāng)123和123與靶分子結(jié)合時(shí)，I2I與Hl穩(wěn)定結(jié)合，但是在靶分子不存在時(shí)，I2I不與Hl穩(wěn)定結(jié)合， 122為連接I2I與123的連接子， 123為結(jié)合靶標(biāo)的潛在適配體序列，并且 124為引物序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中H3為珠粒。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中14和123各自長(zhǎng)度為約20個(gè)核苷酸至約40個(gè)核苷酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中H2、1'2和122各自由雙功能連接子構(gòu)成。
17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中H2、IJ2和122各自由間隔區(qū)18構(gòu)成。
18.—種組合物，所述組合物包含3種組分:橋構(gòu)建體、適配體構(gòu)建體和表位結(jié)合劑構(gòu)建體，其中 a)所述橋構(gòu)建體包含 H1-H2-H3 ； b)所述適配體構(gòu)建體包含 I1-12-13-14 ； c)所述表位結(jié)合劑構(gòu)建體包含 J1-J2-J3 其中 Hl為包含Il和Jl的結(jié)合位點(diǎn)的單鏈核酸， H2為連接Hl與H3的連接子， H3為固體支持物， Il為與Hl上的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合的單鏈核酸，以致當(dāng)13和J3與靶分子結(jié)合時(shí)，Il與Hl穩(wěn)定結(jié)合，但是在IE分子不存在時(shí)，Il不與Hl穩(wěn)定結(jié)合， 12為連接Il與13的連接子， 13為結(jié)合靶標(biāo)的潛在適配體序列， 14為引物序列， Jl為與Hl上的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合的單鏈核酸，以致當(dāng)13和J3與靶分子結(jié)合時(shí)，Jl與Hl穩(wěn)定結(jié)合，但是在IE分子不存在時(shí)，Jl不與Hl穩(wěn)定結(jié)合， J2為連接Jl與J3的連接子，并且 J3為與靶標(biāo)結(jié)合的表位結(jié)合劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，其中H3為珠粒。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，其中13長(zhǎng)度為約20個(gè)核苷酸至約40個(gè)核苷酸。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中H2、12和J2各自由雙功能連接子構(gòu)成。
22.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中H2、12和J2各自由間隔區(qū)18構(gòu)成。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中J3為抗體或抗體片段。
24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中J3為適配體。
25.一種選擇適配體的方法，所述方法包括使根據(jù)權(quán)利要求1、8、13或18所述的組合物于反應(yīng)混合物中并且在適合產(chǎn)生穩(wěn)定復(fù)合物的條件下與靶標(biāo)接觸，從所述反應(yīng)混合物中分離所述組合物和靶標(biāo)的復(fù)合物，并 且鑒定結(jié)合了所述靶標(biāo)的適配體。
【文檔編號(hào)】G01N33/53GK103842521SQ201280038577
【公開(kāi)日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2012年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月22日
【發(fā)明者】Y-H.張, L.田, R.王 申請(qǐng)人:美迪奧米克斯有限責(zé)任公司