一種用于檢測17β-雌二醇的光電適配體傳感器的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于檢測17β-雌二醇的光電適配體傳感器的制備方法，所述光電適配體傳感器以制備的硒化鎘納米粒子修飾二氧化鈦納米管作為基體電極，用殼聚糖和戊二醛將電極表面功能化后，將17β-雌二醇適配體滴于電極表面，制備得到17β-雌二醇的光電適配體傳感器。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明將具有特異性識別能力17β-雌二醇適配體和超靈敏的光電分析技術(shù)結(jié)合用于對環(huán)境內(nèi)分泌干擾物17β-雌二醇的檢測，不僅能獲得了高的靈敏度，而且能抵制復(fù)雜基體環(huán)境的干擾獲得高的選擇性，在用于低濃度17β-雌二醇的檢測中，獲得了寬的工作曲線范圍5×10-13-15×10-12mol/L，最低檢測限可達3.3×10-14mol/L。且該17β-雌二醇傳感器制備方法簡單，成本低，穩(wěn)定性及重現(xiàn)性好。
【專利說明】—種用于檢測17 β -雌二醇的光電適配體傳感器的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及環(huán)境監(jiān)測【技術(shù)領(lǐng)域】與納米修飾電極，尤其是涉及一種用于檢測17 β -雌二醇的光電適配體傳感器的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]內(nèi)分泌干擾物對人體和其他生物體的內(nèi)分泌功能有嚴重的影響，近幾年倍受關(guān)注，其中17 β-雌二醇被認為是對人體和動物內(nèi)分泌系統(tǒng)危害最大的一種環(huán)境內(nèi)分泌物。它是一種天然的雌性激素，主要來源于人類或家畜的排泄物，以及含有人工合成激素藥物的使用和排放。當17 β-雌二醇通過食物鏈從外部環(huán)境進入人體和其他生物體后會，干擾正常的生理過程，影響人的生長發(fā)育，降低男性出生率，增長腫瘤的病發(fā)機會，近幾年對它的研究受到全世界的廣泛關(guān)注。因此，建立一種快速的，靈敏的分析方法具有非常重要的意義。
[0003]目前，測定17 β -雌二醇的方法主要有傳統(tǒng)儀器分析方法例如HPLC，GC,這些方法具有好的靈敏度和準確性，然而分析過程往往非常復(fù)雜，費力且耗時。Seifert etal提出的酶聯(lián)受體分析法(ELRA)主要利用人類的雌激素受體(hER)結(jié)合雌激素物質(zhì)的特性，測定17 β-雌二醇，然而雌激素受體對其他的外源雌激素均具有強的親和作用，所以該方法無法實現(xiàn)選擇性檢測。之后，報道了基于抗體的酶聯(lián)免疫傳感器對17 β -雌二醇測定，該方法的選擇性比酶聯(lián)受體法有了很大的提高，但是由于抗體本身需要在生物體內(nèi)提取，提取純化過程復(fù)雜、昂貴，且穩(wěn)定性差，限制了其廣泛地使用。
[0004]適配體，它具有類似于抗體的性質(zhì)，是通過SELEX技術(shù)篩選出具有高度專一性結(jié)合靶物質(zhì)的一系列短鏈核苷酸序列，同時它又有大量優(yōu)于抗體的性質(zhì)，如它可在體外化合成，合成周期短，不需要復(fù)雜的提取步驟，且穩(wěn)定性好。由于其獨特的性能，基于不同方法發(fā)展的適配體傳感器具有廣泛地應(yīng)用前景。自17 β-雌二醇適配體被篩選出來后，用于17 β-雌二醇測定的適配體傳感器已有大量報道。如熒光法，比色法，電化學(xué)適配體傳感器等。其中熒光適配體傳感器需要對適配體進行熒光基團標記來獲得響應(yīng)信號，然后標記過程復(fù)雜，費時且可能影響17 β-雌二醇和適配體間的親和性。比色適配體傳感器，方法簡單，快速，但往往靈敏度較低。而電化學(xué)方法由于其方法簡單、快速，且靈敏度高，對環(huán)境友好，宜實現(xiàn)在線監(jiān)測等優(yōu)點受到了越來越多的應(yīng)用。在此基礎(chǔ)上，發(fā)展起來的一光電分析法既具有光學(xué)方法又具有電化學(xué)方法的優(yōu)點，且由于其具有光激發(fā)和電流檢測不同的信號轉(zhuǎn)化形式，所以它是一種超靈敏的分析方法。因此，我們設(shè)想將超靈敏的光電分析方法與具有高親和力的17 β-雌二醇適配體結(jié)合構(gòu)筑一種光電適配體傳感器，用于實現(xiàn)高靈敏度，高選擇性檢測17 β-雌二醇，以此構(gòu)筑的光電適配體傳感器恰好滿足環(huán)境水體中痕量17 β -雌二醇檢測的迫切要求。
[0005]在本發(fā)明中我們選用在Ti基底上直立有序生長TiO2 NTs作為光學(xué)材料，由于TiO2NTs具有好的光電穩(wěn)定性，大的比表面積，好的生物兼容性等優(yōu)點，使其成為光電傳感器設(shè)計的一種理想的傳感材料。然而，由于TiO2 NTs具有較寬的帶隙，只能吸收400納米以下的可見光，這會使修飾在TiO2 NTs表面的生物分子失活，在某種程度上限制了它在生物光電傳感器設(shè)計中的直接應(yīng)用，需要用窄帶的光電材料與TiO2 NTs復(fù)合以實現(xiàn)可見光下下的生物傳感。因此我們將窄帶的半導(dǎo)體材料CdSe通過簡單的電化學(xué)沉積法一步修飾在TiO2NTs的內(nèi)外，之后利用殼聚糖-戊二醛作為交聯(lián)劑通過交連耦合的方法將17 β-雌二醇適配體修飾在復(fù)合的CMSe NPs-TiO2 NTs納米材料電極上成功地構(gòu)筑了光電適配體傳感器。當17 β -雌二醇存在時，在傳感界面形成了 17 β -雌二醇-適配體配合物，使電極表面的空間位阻增大，從而使光電流發(fā)生明顯變化，實現(xiàn)了在可見光下對17 β -雌二醇定量測定。由此建立了一種光電適配體傳感器的方法檢測環(huán)境中低濃度的17 β -雌二醇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種制備簡單、成本低廉、檢測速度快、高靈敏度高選擇性的用于檢測17 β-雌二醇的光電適配體傳感器的制備方法。
[0007]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
用于檢測17 β-雌二醇的光電適配體傳感器的制備方法，所述光電適配體傳感器以硒化鎘納米粒子(CdSe NPs)修飾二氧化鈦納米管(TiO2 NTs)為基體電極，在二氧化鈦納米管內(nèi)外修飾具有專一性識別能力的17 β-雌二醇適配體作為探針，并與光電分析技術(shù)結(jié)合構(gòu)筑了一種簡單、快速的光電適配體傳感器，所述光電適配體傳感器可實現(xiàn)高靈敏度和高選擇性檢測17 β -雌二醇；具體步驟如下:
(I)鈦板依次用不同細度的磨砂紙機械打磨，接著將其放入二次蒸餾水和乙醇溶液中分別進行超聲清洗5?10 min。然后將所得鈦板用18%的HCl刻蝕10 min ;之后將其放在兩電極體系中進行陽極化，鉬片作陰極，鈦板作陽極，兩電極間間距為I cm，外加槽電壓為40 V，在25°C溫度時，陽極化2?3 h ;電解液采用0.3 wt% NH4F和3.0 Vo 1% H2O的乙二醇溶液。陽極化后的TiO2 NTs用二次蒸餾水沖洗并在氮氣氣氛中吹干。之后將其置于管式爐中在氧氣氣氛下500 °C燒結(jié)，得到晶形化的TiO2 NTs。
[0008](2)將步驟⑴制備得到的TiO2 NTs放入三電極體系，TiO2 NTs為工作電極，鉬電極為輔助電極，飽和甘萊電極為參比電極，電解液為0.1 mol/L硫酸鎘,0.1 mol/L無水硫酸鈉和1.0 mmol/L 二氧化硒，在-0.7 V的恒電壓下，沉積I?2 h ;將CdSe NPs均勻的沉積在TiO2 NTs的管內(nèi)外，得到CdSe NPs-TiO2 NTs電極，并將CdSe NPs-TiO2 NTs電極在氮氣氣氛中，300 °C下燒結(jié)；
(3)將步驟⑵得到的CdSe NPs-TiO2 NTs電極留有IcmX Icm大小的電極面積，將I %乙酸的殼聚糖溶液滴在I cm2的CdSe NPs-TiO2 NTs電極上，在40 °C恒溫下干燥。之后用0.1 mol/L NaOH和去離子水沖洗數(shù)次，并干燥。然后將5 %的戊二醛溶液滴在CdSeNPs-TiO2 NTs電極表面，室溫下，反應(yīng)30 min，用去離子水沖洗并干燥。
[0009](4)取末端氨基修飾的17 β-雌二醇適配體，滴于步驟(3)所得附有殼聚糖和戊二醛的NPs-TiO2 NTs電極表面，在4 °C下反應(yīng)12?18 h。并沖洗以去除物理吸附的適配體，然后用牛血清蛋白堵塞未鍵合的戊二醛活性位點，以避免非特性吸附，得到17 β-雌二醇適配體修飾的CdSe NPs-TiO2 NTs的傳感器，不用時，將其置于0.1 mol/L PBS (pH 7.41)的緩沖溶液。
[0010]本發(fā)明中，步驟(I)中二氧化鈦納米管燒結(jié)時的升溫和冷卻速率為2 V /min，步驟(2)中CdSe NPs-TiO2 NTs電極燒結(jié)時的升溫和冷卻速率為2 V /min。
[0011]本發(fā)明中，步驟(4)中所用的牛血清蛋白的濃度為3% (w/v)。
[0012]本發(fā)明制得的光電適配體傳感器對17 β_雌二醇具有專一性的識別能力，避免了檢測過程中其他內(nèi)分泌物的干擾，并且該傳感器具有高的靈敏度和良好的重現(xiàn)性。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點及有益效果:
(I)與現(xiàn)有的生物傳感器相比，本發(fā)明采用CdSe NPs-TiO2 NTs為基體電極材料，不僅具有良好的生物兼容性有利于生物分子適配體的穩(wěn)定負載并保持好的生物活性，而且由于其具有高度有序地納米管陣列，能夠提供大的比表面積和三維管式結(jié)構(gòu)更有利于提高了適配體分子的負載量，進一步改善了傳感器的靈敏度。
[0014](2)本發(fā)明將17 β -雌二醇適配體修飾在CdSe NPs-TiO2 NTs上制備得到的基于適配體的光電傳感器首次用于17 β -雌二醇的檢測。由于適配體對待測物質(zhì)17 β -雌二醇的專一性結(jié)合能力，大大提高了傳感器的選擇性，使得該光電傳感器能夠在100倍于待測物質(zhì)濃度的結(jié)構(gòu)相似的內(nèi)分泌干擾物質(zhì)中選擇性的識別出待測物質(zhì)17 β -雌二醇。
[0015](3)與傳統(tǒng)的檢測17β-雌二醇的方法相比，本發(fā)明的利用了高靈敏的光電分析技術(shù)與高專一性識別能力的適配體有效地結(jié)合，首次實現(xiàn)了超靈敏，高專一性的檢測環(huán)境中低濃度的17 β-雌二醇。
[0016](4)本發(fā)明中采用的儀器廉價便攜，方法簡單易行，檢測限達到10_14 mol/L。適用于復(fù)雜環(huán)境體系中17 β -雌二醇的在線檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明中制備的CdSe NPs-TiO2 NTs的管式納米結(jié)構(gòu)圖；
圖2為本發(fā)明中制備光電適配體傳感器在不同濃度的17 β-雌二醇溶液中的響應(yīng)曲
線.圖3為本發(fā)明中制備的光電適配體傳感器在100倍濃度的干擾物存在體系中對17 β -雌二醇的高選擇性圖。
【具體實施方式】
[0018]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。
[0019]實施例1
一種高靈敏的高選擇性的17 β-雌二醇光電適配體傳感器，該傳感器構(gòu)筑在以CdSeNPs-TiO2 NTs為基體，將17 β-雌二醇的適配體修飾在CdSe NPs-TiO2 NTs的管內(nèi)外。具體制作過程如下:
(I)鈦板依次用不同細度的磨砂紙機械打磨，之后將其放入二次蒸餾水和乙醇溶液中分別進行超聲清洗5?10 min。在陽極化之前，鈦板用18%的HCl刻蝕10 min，之后將其放在兩電極體系中進行陽極化，鉬片作陰極，鈦板作陽極，兩電極間I cm，外加槽電壓為40V，在溫度為25 °C時，陽極化2?3 h。電解液包括0.3 wt% NH4F和3.0 Vo 1% H2O的乙二醇溶液。陽極化后的TiO2 NTs用二次蒸餾水沖洗并在氮氣氣氛中吹干。之后將其置于管式爐中在氧氣氣氛下500 °C燒結(jié)晶形化的TiO2 NTs，升溫和冷卻速率為2 V /min。
[0020](2)將制備的TiO2 NTs放入三電極體系，TiO2 NTs為工作電極，鉬電極為輔助電極，飽和甘萊電極為參比電極，放入0.1 mol/L硫酸鎘,0.1 mol/L無水硫酸鈉，1.0 mmol/L二氧化硒的混合電解液中，在-0.7 V的恒電壓下，沉積I~2 h.將CdSe NPs均勻的沉積在TiO2 NTs管內(nèi)外(CdSe NPs-TiO2 NTs)并將電極在氮氣氣氛中，300 °C下燒結(jié)，升溫和冷卻速率為2 V /min，制備得到了晶形化的CdSe NPs-TiO2 NTs，如圖1所示。
[0021](3)將上述方法制備得到的CdSe NPs-TiO2 NTs留有IcmX Icm大小的電極面積，將I %乙酸的殼聚糖溶液滴在I cm2的CdSe NPs-TiO2 NTs上，在40 °C恒溫下干燥。之后用0.1 mol/L NaOH和去離子水沖洗數(shù)次，并干燥。然后將5 %的戊二醛溶液滴在電極表面，室溫下，反應(yīng)30 min,用去離子水沖洗并干燥。然后將20 μ L, 2 X l(T6mol/L的17 β -雌二醇適配體溶液滴涂到功能化的電極表面，在4 °C下組裝12~18 h，并沖洗以去除物理吸附的適配體，然后用牛血清蛋白堵塞未鍵合的戊二醛活性位點，以避免非特性吸附。制備了 17 β-雌二醇適配體修飾的 CdSe NPs-TiO2 NTs，不用時置于 0.1 mol/L PBS (pH 7.41)的緩沖溶液。 [0022]實施例2
采用無水乙醇作溶劑配制I mmol/L 17 β -雌二醇的母液后，用0.1 mol/L PBS緩沖液(pH 7.41)稀釋配制一系列不同濃度的17 β-雌二醇標準溶液。以0.1 mol/L PBSCpH 7.41)與0.1 mol/L抗壞血酸(AA)的緩沖液為電解液，在這里AA是作為一種電子犧牲劑。在0.0V電壓下，電極與可見光源保持5 cm。以核酸適配體修飾的CdSe NPs-TiO2 NTs為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲為對電極的三電極體系中，在電化學(xué)池加入不同濃度的17 β-雌二醇時，每個樣品加入需反應(yīng)30 min后進行安培1-t曲線測定。由于適配體與其靶物質(zhì)的專一性識別作用，17 β -雌二醇被捕獲在電極表面，形成了適配體-17 β -雌二醇配合物，阻止AA向電極表面擴散，致使光電流降低。根據(jù)光電適配體傳感器光電流隨濃度的變化對其進行定量分析。且光電流的變化和17 β -雌二醇的濃度在5.0X 10_14~15Χ 10_12mol/L范圍內(nèi)成良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)0.9920.最低檢測限為3.3 XlO^4 mol/L (3S/Μ)。這個最低檢測限低于已報道的其他分析方法，且足以檢測水體中微量存在的17β-雌二醇，如圖2所示。
[0023]實施例3
將 17 β-雌二醇適配體修飾的 CdSe NPs-TiO2 NTs 放置于 0.1 mol/L PBS +0.1 mol/L AA (pH 7.41)作為電解液，將1.0X 10_12 mol/L 17 β -雌二醇分別與不同濃度的干擾物兩兩混合進行測定?？疾炝艘胰泊拼迹迫?，壬基酚，間苯二酚，雙酚Α，阿特拉津，鄰苯二甲酸二乙酯六種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對17 β -雌二醇測定的干擾實驗。采用實施例2中測試條件，測定光電流響應(yīng)，研究結(jié)果顯示，100倍于7 β -雌二醇濃度的其他干擾物17 β -雌二醇的光電流造成的影響小于10.0%，如圖3所示?？梢姡苽涞倪m配體傳感器對17β-雌二醇具有高的選擇性，其他結(jié)構(gòu)相似或與17 β -雌二醇共存的六種環(huán)境內(nèi)分泌物對它的測定并不造成干擾。
[0024]實施例4
采用光電適配體傳感器對不同的環(huán)境污水中17 β-雌二醇的含量進行評估。首先選取了上海市楊浦區(qū)四個不同醫(yī)院，如新華醫(yī)院，曲陽醫(yī)院，上海海軍基地醫(yī)院以及同濟大學(xué)附屬醫(yī)院的醫(yī)藥廢水進行分析。其次選取了同濟大學(xué)校內(nèi)不同景觀湖水樣品，由于在這些景觀湖水中常有魚，家禽類動物活動。此外還選取本實驗室自來水進行分析。在實驗前，所有的樣品首先用普通的濾膜進行過濾，以除去顆粒物質(zhì)和懸浮物質(zhì)。之后用0.22 μ m的濾膜進行再次過濾。將過濾后的樣品收集于棕色的玻璃瓶，并儲存在4 °C冰箱。采用實例2的1-t曲線的方法，在可見光照射下，施加偏壓0.0 V，將I mL樣品溶液注入9 mL的0.1 mol/L PBS +0.1 mol/L AA (pH 7.41)的電解液中進行光電流測定，并根據(jù)工作曲線計算實際樣品的濃度以及回收率。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測17β-雌二醇的光電適配體傳感器的制備方法，其特征在于所述光電適配體傳感器以硒化鎘納米粒子(CdSe NPs)修飾二氧化鈦納米管(TiO2 NTs)為基體電極，在二氧化鈦納米管內(nèi)外修飾具有專一性識別能力的17 β -雌二醇適配體作為探針，并與光電分析技術(shù)結(jié)合構(gòu)筑了一種簡單、快速的光電適配體傳感器，所述光電適配體傳感器可實現(xiàn)高靈敏度和高選擇性檢測17 β -雌二醇；具體步驟如下: (1)鈦板依次用不同細度的磨砂紙機械打磨，接著將其放入二次蒸餾水和乙醇溶液中分別進行超聲清洗5~10 min ;然后將所得鈦板用18%的HCl刻蝕10 min ;之后將其放在兩電極體系中進行陽極化，鉬片作陰極，鈦板作陽極，兩電極間間距為I cm，外加槽電壓為40 V，在25°C溫度時，陽極化2~3 h ;電解液采用0.3 wt% NH4F和3.0 Vo 1% H2O的乙二醇溶液；陽極化后的TiO2 NTs用二次蒸餾水沖洗并在氮氣氣氛中吹干；之后將其置于管式爐中在氧氣氣氛下500 °C燒結(jié)，得到晶形化的TiO2 NTs ； (2)將步驟⑴制備得到的TiO2NTs放入三電極體系，TiO2 NTs為工作電極，鉬電極為輔助電極，飽和甘萊電極為參比電極，電解液為0.1 mol/L硫酸鎘,0.1 mol/L無水硫酸鈉和1.0 mmol/L 二氧化硒，在-0.7 V的恒電壓下，沉積I~2 h ;將CdSe NPs均勻的沉積在TiO2 NTs的管內(nèi)外，得到CdSe NPs-TiO2 NTs電極，并將CdSe NPs-TiO2 NTs電極在氮氣氣氛中，300 °C下燒結(jié)； (3)將步驟⑵得到的CdSeNPs-TiO2 NTs電極留有IcmX Icm大小的電極面積，將1%乙酸的殼聚糖溶液滴在I cm2的CdSe NPs-TiO2 NTs電極上，在40 °C恒溫下干燥；之后用0.1 mol/L NaOH和去離子水沖洗數(shù)次，并干燥；然后將5 %的戊二醛溶液滴在CdSeNPs-TiO2 NTs電極表面，室溫下，反應(yīng)30 min，用去離子水沖洗并干燥； (4)取末端氨基修飾的17β-雌二醇適配體，滴于步驟(3)所得附有殼聚糖和戊二醛的NPs-TiO2 NTs電極表面，在4 °C下反應(yīng)12~18 h ;并沖洗以去除物理吸附的適配體，然后用牛血清蛋白堵塞未鍵合的戊二醛活性位點，以避免非特性吸附，得到17β-雌二醇適配體修飾的CdSe NPs-TiO2 NTs的傳感器，不用時，將其置于0.1 mol/L PBS (pH 7.41)的緩沖溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中二氧化鈦納米管燒結(jié)時的升溫和冷卻速率為2 °C/min，步驟(2)中CdSe NPs-TiO2 NTs電極燒結(jié)時的升溫和冷卻速率為2°C /min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)中所用的牛血清蛋白的濃度為3%(w/v)。
【文檔編號】G01N27/26GK103940867SQ201410143464
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月11日
【發(fā)明者】趙國華, 范麗芳, 史慧杰, 劉梅川 申請人:同濟大學(xué)