一種用于檢測凝血酶的核酸適配體生物傳感器的制備方法
【專利摘要】一種用于檢測凝血酶的核酸適配體生物傳感器的制備方法，本發(fā)明方法通過簡單的一步電沉積法制備了水滑石-碳納米管復(fù)合納米材料修飾電極，然后采用強(qiáng)靜電吸附作用將核酸適配體負(fù)載在水滑石-碳納米管復(fù)合納米材料修飾電極表面制備了核酸適配體修飾電極，本發(fā)明利用水滑石-碳納米管復(fù)合納米材料的協(xié)同效應(yīng)和核酸適配體對底物的特異性結(jié)合作用，可以靈敏、準(zhǔn)確、特異性地檢測凝血酶。本發(fā)明只需要改變核酸適配體的序列，可以實(shí)現(xiàn)對其它底物分子的檢測。本發(fā)明適用于電化學(xué)阻抗法測定凝血酶。摘要附圖為本發(fā)明核酸適配體傳感器對凝血酶的阻抗響應(yīng)圖。
【專利說明】—種用于檢測凝血酶的核酸適配體生物傳感器的制備方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及一種用于檢測凝血酶的核酸適配體生物傳感器的制備方法，尤其涉及一種以水滑石-碳納米管復(fù)合納米材料制備用于檢測凝血酶的核酸適配體生物傳感器的方法，屬納米材料和電分析化學(xué)檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0002]【背景技術(shù)】
凝血酶是人體內(nèi)不可或缺的一種生理蛋白酶，具有快速止血的作用，能使血漿內(nèi)的纖維蛋白原從可溶性轉(zhuǎn)變成不溶性。在傷口愈合、凝血等病理和生理過程中扮演著關(guān)鍵的角色，因此對凝血酶的測定在臨床應(yīng)用和病理分析上具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。近年來，檢測凝血酶的電化學(xué)核酸適配體傳感器，由于其具有簡單、快速、靈敏、成本低廉和易于實(shí)現(xiàn)微型化等優(yōu)點(diǎn)，受到眾多研究者的青睞。
[0003]核酸適配體是在體外通過指數(shù)級富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)篩選出的一段由20-60個(gè)堿基所組成的單鏈或雙鏈寡聚核苷酸，具有高親和力，易于修飾和功能化，能與配體高效、專一結(jié)合等特點(diǎn)。基于核酸適配體的電化學(xué)核酸適配體傳感器，根據(jù)是否采用標(biāo)記物產(chǎn)生檢測信號，可分為標(biāo)記型和非標(biāo)記型；根據(jù)測量信號，電化學(xué)核酸適配體傳感器可分為電流型、電壓型和阻抗型。阻抗型電化學(xué)核酸適配體傳感器因靈敏度高、制備工藝簡單和非標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)而日益受到關(guān)注。阻抗型核酸適配體傳感器是通過檢測核酸適配體與靶分子雜交前后的電極界面變化而實(shí)現(xiàn)對靶分子的檢測。
[0004]水滑石是由二價(jià)和三價(jià)金屬離子組成的金屬氫氧化物層與層間填充的陰離子而構(gòu)成的一類無機(jī)層狀化合物。利用水滑石離子交換性能好、表面積大、生物相容性良好等特點(diǎn)，可以作為有效固定化核酸適配體的載體，進(jìn)而將核酸適配體固定在電極表面。
[0005]碳納米管是一種具有比表面積大、生物相容性好、電子傳遞速度快等優(yōu)點(diǎn)的納米材料，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和電化學(xué)性質(zhì)，可用于增強(qiáng)電化學(xué)傳感器的性能。
[0006]以碳納米管和水滑石兩者有機(jī)結(jié)合起來的復(fù)合納米材料為載體構(gòu)建的生物傳感器，因碳納米管和水滑石的協(xié)同作用，可顯著地提高傳感器的性能。目前，制備水滑石-碳納米管復(fù)合納米材料的方法有化學(xué)合成法和多步電沉積法，這兩者方法步驟繁瑣、時(shí)間長。
[0007]
【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明的目的是，針對目前檢測凝血酶的核酸適配體傳感器的靈敏度較低，制備傳感器的方法操作復(fù)雜的缺點(diǎn)，提供一種以水滑石-碳納米管復(fù)合納米材料制備核酸適配體傳感器并用于檢測凝血酶的方法。
[0008]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是，本發(fā)明采用一步電沉積法制備水滑石-碳納米管復(fù)合納米材料，以其為固定化核酸適配體的載體構(gòu)建測定凝血酶的阻抗型電化學(xué)傳感器。通過簡單的一步電沉積法，將水滑石和碳納米管共同修飾在電極表面，利用水滑石和碳納米管的大比表面積、良好的生物相容性和強(qiáng)吸附作用的協(xié)同效應(yīng)，將大量的核酸適配體穩(wěn)定地負(fù)載在電極表面，然后以牛血清蛋白封閉電極表面的空白位點(diǎn)，即可構(gòu)建核酸適配體生物傳感器，最后采用電化學(xué)阻抗用于凝血酶的分析檢測。
[0009]本發(fā)明提出一種用于檢測凝血酶的核酸適配體生物傳感器的制備方法，所述方法步驟如下:
(I)將硝酸鈷和硝酸鋁溶液混合成溶液A，將硝酸鉀、氯化鉀和碳納米管混合成懸浮液B，按A和B的體積比0.5?2.0，將溶液A和懸浮液B混合成懸浮液C。
[0010]所述溶液A的配制方法為:溶液A中硝酸鈷和硝酸鋁的摩爾比為1:1?5: 1，溶液A中硝酸鈷和硝酸鋁的總濃度為0.01?0.05 mol/L。
[0011]所述懸浮液B的配制方法為:溶液B中硝酸鉀、氯化鉀和碳納米管的濃度分別為0.1 ?0.4 mol/L、0.05 ?0.2 mol/L、0.5 ?2.0 mg/mL。
[0012](2)將干凈的玻碳電極在混合懸浮液C中-0.7?-1.2 V電位下電沉積30?300S，得到水滑石-碳納米管復(fù)合納米粒子修飾的玻碳電極。
[0013](3)將(2)得到的水滑石-碳納米管修飾電極依次置于0.5?2.0 μ mol/L的凝血酶適配體中12?24 h, 0.5?2.0 mg/mL的牛血清白蛋白中浸泡20?60 min,制得水滑石-碳納米管/核酸適配體/牛血清白蛋白修飾電極，該核酸適配體修飾電極即為測定凝血酶的核酸適配體傳感器。
[0014]本發(fā)明基于水滑石-碳納米管復(fù)合納米材料制備的核酸適配體傳感器檢測凝血酶的方法如下:
本發(fā)明利用傳感器中水滑石-碳納米管復(fù)合納米材料負(fù)載的核酸適配體對凝血酶的特異性結(jié)合，導(dǎo)致電極界面的阻抗變化可用于對凝血酶的檢測，將前述的核酸適配體修飾電極作為工作電極，參比電極為Ag/AgCl電極，輔助電極為鉬電極，組成三電極體系，即可實(shí)現(xiàn)對凝血酶的檢測。
[0015]由于水滑石-碳納米管復(fù)合納米材料的協(xié)同效應(yīng)，該核酸適配體傳感器對凝血酶的檢測具有高的靈敏度和穩(wěn)定性。該核酸適配體傳感器測定凝血酶的線性范圍為1.0 pg/mL?500.0 ng/mL,檢測限為0.4 pg/mL。利用同一根玻碳電極制備4次的修飾電極,測定凝血酶的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.4% ;利用4根不同的玻碳電極制備的修飾電極，對凝血酶測定的的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.6%。該核酸適配體傳感器吹干置于4 °C冰箱內(nèi)2周后，核酸適配體傳感器的響應(yīng)信號保留值為90.0%。
[0016]本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明通過一步電沉積法將水滑石和碳納米管有機(jī)結(jié)合起來構(gòu)建的核酸適配體傳感器，利用水滑石和碳納米管的協(xié)同效應(yīng)，極大地提高測定凝血酶的性能。
[0017]本發(fā)明適用于電化學(xué)阻抗法測定凝血酶。
[0018]【專利附圖】

【附圖說明】
圖1為本發(fā)明中水滑石-碳納米管復(fù)合納米材料的掃描電鏡圖；
圖2為本發(fā)明中水滑石-碳納米管復(fù)合納米材料的能譜圖；
圖3為核酸適配體傳感器對凝血酶的阻抗響應(yīng)圖；
圖4核酸適配體傳感器的阻抗響應(yīng)對凝血酶濃度的對數(shù)的校準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，以下實(shí)施例有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020]實(shí)施例1 以水滑石-碳納米管復(fù)合納米材料制備核酸適配體傳感器。
[0021](I)將溶液A 10 mL和懸浮液B 10 mL在燒杯中混合成懸浮液C。
[0022]其中，溶液A中硝酸鈷和硝酸招的濃度分別為0.02mol/L和0.02 mol/L,硝酸鈷和硝酸鋁的摩爾比為1:1 ;懸浮液B中硝酸鉀、氯化鉀和碳納米管的濃度分別為0.1 mol/L、0.05 mol/L和 0.5 mg/mL。
[0023](2)將干凈的玻碳電極在混合懸浮液C中-0.7 V電位下電沉積80 s,得到水滑石-碳納米管復(fù)合納米粒子修飾的玻碳電極。
[0024](3)將水滑石-碳納米管修飾電極依次置于0.5 μ mol/L的凝血酶適配體中12 h，0.5 mg/mL的牛血清白蛋白中浸泡40 min,制得核酸適配體傳感器。
[0025]實(shí)施例2
以水滑石-碳納米管復(fù)合納米材料制備核酸適配體傳感器。
[0026](I)將溶液A 15 mL和懸浮液B 15 mL在燒杯中混合成懸浮液C。
[0027]其中，溶液A中硝酸鈷和硝酸招的濃度分別為0.03mol/L和0.02 mol/L,硝酸鈷和硝酸鋁的摩爾比為1.5:1 ;懸浮液B中硝酸鉀、氯化鉀和碳納米管的濃度分別為0.2 mol/L、0.1 mol/L 和 L 5 mg/mL。
[0028](2)將干凈的玻碳電極在混合懸浮液C中-0.8 V電位下電沉積70 s,得到水滑石-碳納米管復(fù)合納米粒子修飾的玻碳電極。
[0029](3)將水滑石-碳納米管修飾電極依次置于1.0 μ mol/L的凝血酶適配體中12 h,
1.0mg/mL的牛血清白蛋白中浸泡20 min,制得核酸適配體傳感器。
[0030]實(shí)施例3
以水滑石-碳納米管復(fù)合納米材料制備核酸適配體傳感器。
[0031](I)將溶液A 10 mL和懸浮液B 10 mL在燒杯中混合成懸浮液C。
[0032]其中，溶液A中硝酸鈷和硝酸招的濃度分別為0.03mol/L和0.01 mol/L,硝酸鈷和硝酸鋁的摩爾比為3:1 ;懸浮液B中硝酸鉀、氯化鉀和碳納米管的濃度分別為0.3 mol/L、0.1 mol/L 和 1.0 mg/mL。
[0033](2)將干凈的玻碳電極在混合懸浮液C中-0.9 V電位下電沉積60 s,得到水滑石-碳納米管復(fù)合納米粒子修飾的玻碳電極。
[0034](3)將水滑石-碳納米管修飾電極依次置于1.0 μ mol/L的凝血酶適配體中12 h,
1.0mg/mL的牛血清白蛋白中浸泡40 min,制得核酸適配體傳感器。
[0035]實(shí)施例4
將實(shí)施例3得到的水滑石-碳納米管復(fù)合納米粒子修飾的玻碳電極進(jìn)行掃描電鏡表征和能譜分析:
(I)水滑石-碳納米管復(fù)合納米材料的掃描電鏡表征見圖1，可以看到碳納米管分散在片狀水滑石的層間形成復(fù)合納米材料。復(fù)合物在電極表面形成較致密的結(jié)構(gòu)。
[0036](2)水滑石-碳納米管復(fù)合納米材料的能譜分析見圖2，可以看到碳元素和鈷鋁水滑石中的鈷鋁各元素均存在，每個(gè)元素所對應(yīng)的出峰位置互不干擾，峰的強(qiáng)度也比較大，說明形成了水滑石和碳納米管的復(fù)合材料。
[0037]實(shí)施例5
將實(shí)施例3得到的核酸適配體傳感器用于電化學(xué)測試: (I)核酸適配體傳感器的電化學(xué)阻抗測試。
[0038]將核酸適配體修飾電極為工作電極，參比電極為Ag/AgCl電極，輔助電極為鉬電極；在含 0.1 mol/L 的 KCl 的 5 mmol/L K3 [Fe (CN) 6]/K4 [Fe (CN) 6] (V: V=1:1)的溶液中測定得到交流阻抗譜(振幅:0.005 V，頻率范圍:f 100000 Hz)，并通過ZSimpwin軟件模擬而成，測定結(jié)果見圖3。從圖3可見，代表電子傳遞阻抗的半圓直徑隨著凝血酶濃度的增加而增大。
[0039](2)核酸適配體傳感器的阻抗響應(yīng)對凝血酶濃度的對數(shù)的校準(zhǔn)曲線，見圖4。核酸適配體修飾電極對凝血酶在1.0 pg/mL?500.0 ng/mL范圍內(nèi)，阻抗響應(yīng)值與凝血酶濃度的對數(shù)呈線性關(guān)系，檢測限為0.4 pg/mL。
[0040](3)核酸適配體傳感器的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。利用同一根玻碳電極制備4次的修飾電極，測定凝血酶的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.4% ;利用4根不同的玻碳電極制備的修飾電極，對凝血酶測定的的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.6%。此電化學(xué)核酸適配體傳感器吹干置于4 °C冰箱內(nèi)2周后，傳感器的響應(yīng)信號保留值為90.0%。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測凝血酶的核酸適配體生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述方法步驟為: (1)將硝酸鈷和硝酸鋁溶液混合成溶液A，將硝酸鉀、氯化鉀和碳納米管混合成懸浮液B，按A和B的體積比0.5?2.0，將溶液A和懸浮液B混合成懸浮液C ； 所述溶液A的配制方法為:溶液A中硝酸鈷和硝酸鋁的摩爾比為1:1?5:1，溶液中硝酸鈷和硝酸鋁的總濃度為0.0l?0.05 mol/L ； 所述懸浮液B的配制方法為:溶液B中硝酸鉀、氯化鉀和碳納米管的濃度分別為0.1?0.4 mol/L、0.05 ?0.2 mol/L、0.5 ?2.0 mg/mL ； (2)將干凈的玻碳電極在混合懸浮液C中-0.7?-1.2 V電位下電沉積30?300 S，得到水滑石-碳納米管復(fù)合納米粒子修飾的玻碳電極； (3)將(2)得到的水滑石-碳納米管修飾電極依次置于0.5?2.0 μ mol/L的凝血酶適配體中12?24 h, 0.5?2.0 mg/mL的牛血清白蛋白中浸泡20?60 min,制得核酸適配體修飾電極；所述核酸適配體修飾電極即為測定凝血酶的核酸適配體傳感器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測凝血酶的核酸適配體生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述核酸適配體傳感器檢測凝血酶的方法如下: 利用水滑石和碳納米管的協(xié)同效應(yīng)及核酸適配體對凝血酶的特異性結(jié)合作用，采用電化學(xué)阻抗法可用于對凝血酶的檢測，將核酸適配體修飾電極為工作電極，參比電極為Ag/AgCl電極，輔助電極為鉬電極，組成三電極體系，即可實(shí)現(xiàn)對凝血酶的檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測凝血酶的核酸適配體生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述核酸適配體傳感器測定凝血酶的線性范圍為1.0 pg/mL?500.0 ng/mL,檢測限為0.4 pg/mL ο
【文檔編號】G01N33/573GK103926283SQ201410189097
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月7日
【發(fā)明者】楊紹明, 陳愛喜, 李紅, 李瑞琴, 尚培玲 申請人:華東交通大學(xué)