本發(fā)明涉及植物基因工程及作物育種技術(shù)領(lǐng)域。具體地說(shuō)，涉及一種抗螟蟲(chóng)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻KCRC03的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

我國(guó)是世界上主要的水稻種植國(guó)和消費(fèi)國(guó)，目前，中國(guó)水稻的種植面積位居全球第二，產(chǎn)量位居世界第一(蘇少泉，滕春紅。稻田除草劑的新發(fā)展。世界農(nóng)藥，2010，32:1-6.)。2011年，我國(guó)水稻的種植面積達(dá)到了3005.7萬(wàn)公頃，稻谷的年產(chǎn)量達(dá)到了20100.1萬(wàn)噸，占所有糧食產(chǎn)量的35.2％(中國(guó)統(tǒng)計(jì)年鑒，2012)。截至2008年底，我國(guó)的耕地面積已縮減至12171.6萬(wàn)公頃，近幾年來(lái)耕地保有量也僅僅是維持在這一數(shù)量之上，而人口卻以每年5‰的速度增長(zhǎng)(中國(guó)統(tǒng)計(jì)年鑒，2012)。從以上的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可以看出，水稻的安全、穩(wěn)定的生產(chǎn)是保障國(guó)家糧食安全的關(guān)鍵。但是蟲(chóng)害和雜草等不良環(huán)境因素限制了水稻產(chǎn)量潛力的發(fā)揮。

(1)昆蟲(chóng)危害問(wèn)題：蟲(chóng)害是影響水稻生產(chǎn)的重要因素，每年造成的產(chǎn)量損失高達(dá)15％左右(張啟發(fā)。綠色超級(jí)稻的構(gòu)想與實(shí)踐，2009，科學(xué)出版社)。當(dāng)前對(duì)農(nóng)作物害蟲(chóng)的防治措施還主要依賴化學(xué)農(nóng)藥。我國(guó)農(nóng)藥使用量全球第一，1990年用量不到30萬(wàn)噸，而2005年用量就已達(dá)到140萬(wàn)噸。農(nóng)藥的大量使用，既增加了農(nóng)民的種植成本，減少了種糧收益，又造成了環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留、害蟲(chóng)抗藥性增強(qiáng)以及殺傷天敵等一系列生態(tài)環(huán)境問(wèn)題。Bt抗蟲(chóng)蛋白，主要對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)如水稻螟蟲(chóng)的幼蟲(chóng)有毒，有很強(qiáng)的專一性，通過(guò)培育轉(zhuǎn)基因Bt抗蟲(chóng)水稻，能夠有效的防治水稻螟蟲(chóng)的危害，減少農(nóng)藥使用量，增加農(nóng)民的收入，降低農(nóng)藥使用對(duì)環(huán)境造成的危害。

(2)雜草危害問(wèn)題：稻田雜草與水稻在水、肥、生長(zhǎng)空間上進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，直接影響水稻的產(chǎn)量。近年來(lái)直播和拋秧等栽培方法的使用，使得稻田的雜草危害變得日益嚴(yán)重。另外，隨著農(nóng)村人口往城市遷移速度的加快，水稻種植的規(guī)模化和機(jī)械化是一個(gè)可預(yù)見(jiàn)的趨勢(shì)，這使得傳統(tǒng)的人工除草的方法變得不現(xiàn)實(shí)。施用除草劑是解決這些新出現(xiàn)問(wèn)題的最佳方案之一。因此，抗除草劑雜交稻將具有很大的實(shí)際需求和市場(chǎng)潛力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種抗螟蟲(chóng)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻KCRC03的構(gòu)建方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因水稻事件，通過(guò)將抗蟲(chóng)抗除草劑基因構(gòu)建到一個(gè)表達(dá)載體上使得受體植物同時(shí)具有抗蟲(chóng)抗除草劑的特性。通過(guò)多代的性狀定向篩選和鑒定，得到了抗蟲(chóng)抗除草劑優(yōu)異株系并分離了外源載體的側(cè)翼序列，確定了其整合位點(diǎn)。該轉(zhuǎn)化事件獲得的轉(zhuǎn)基因水稻植株不僅可以用來(lái)作為品種改良的供體，而且特異性檢測(cè)方法的設(shè)計(jì)為鑒定與KCRC03轉(zhuǎn)化事件含有同樣的T-DNA片段、且插入到同樣基因組位置的轉(zhuǎn)基因植株提供了途徑。

本發(fā)明構(gòu)建了包含草甘膦抗性基因cp4 epsps(SEQ ID NO:15)和抗螟蟲(chóng)基因cry1C(SEQ ID NO:16)的遺傳轉(zhuǎn)化載體pZHZH15003，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法、以草甘膦作為篩選劑，成功地將pZHZH15003的T-DNA區(qū)單拷貝整合到水稻基因組中，并培育出抗螟蟲(chóng)、抗草甘膦、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因水稻植株KCRC03，明確了外源T-DNA的插入位置并設(shè)計(jì)了特異性檢測(cè)方法。

本發(fā)明提供抗螟蟲(chóng)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻KCRC03的T-DNA區(qū)核苷酸序列，所述T-DNA區(qū)核苷酸序列為如SEQ ID NO:1所示、或其互補(bǔ)序列或與其同源性達(dá)到90％以上的核苷酸序列；所述T-DNA區(qū)核苷酸序列的左邊界側(cè)翼序列為如SEQ ID NO:2所示、或其互補(bǔ)序列或與 其同源性達(dá)到90％以上的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供抗螟蟲(chóng)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻KCRC03的T-DNA區(qū)核苷酸序列，所述T-DNA區(qū)核苷酸序列為如SEQ ID NO:1所示、或其互補(bǔ)序列或與其同源性達(dá)到90％以上的核苷酸序列；所述T-DNA區(qū)核苷酸序列的右邊界側(cè)翼序列為如SEQ ID NO:3所示、或其互補(bǔ)序列或與其同源性達(dá)到90％以上的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供了用于普通PCR定性檢測(cè)KCRC03轉(zhuǎn)化事件及基因型的特異性引物對(duì)，包括：

LBF1:TAACCTTTTGACATCCACAATATACCA；

LBR:CAGTACATTAAAAACGTCCGCAAT；

RBR:ATTGTAGTTTAATTTGTTCATTTTGTTGC。

本發(fā)明還提供了用于Realtime-PCR定量檢測(cè)KCRC03轉(zhuǎn)化事件的特異性引物對(duì)，包括：

LBF2:ACACATCTTAACATCTATTCTTGTCTTCAAT；

LBR:CAGTACATTAAAAACGTCCGCAAT。

本發(fā)明還提供了抗螟蟲(chóng)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

1)提取待測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻的總DNA；

2)以步驟1)的DNA為模板，利用引物SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6進(jìn)行普通PCR或Realtime-PCR擴(kuò)增；

3)凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物或分析Realtime-PCR擴(kuò)增曲線。

本發(fā)明還提供所述檢測(cè)方法在水稻育種中的應(yīng)用。涉及對(duì)上述轉(zhuǎn)化事件的水稻植株的檢測(cè)，以進(jìn)行轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)、含量分析、基因漂移研究及雜交育種跟蹤等應(yīng)用。所述植株包含但不限于親本、自交后代、雜交后代的種子、花粉、雌蕊、葉片、根等各器官及植物細(xì)胞、植物組織等。

本發(fā)明還提供所述檢測(cè)方法在判斷KCRC03轉(zhuǎn)化事件的基因型中的應(yīng)用，具體為：

只有一條343bp大小帶型的材料為KCRC03純合基因型的材料；

只有一條470bp大小帶型的材料為不含KCRC03事件的材料；

有兩條帶型且大小分別為343bp和470bp的材料為KCRC03雜合基因型的材料。

本發(fā)明進(jìn)一步提供抗螟蟲(chóng)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)人工合成草甘膦和螟蟲(chóng)抗性基因cp4 epsps和cry1C；

(2)將步驟(1)中合成的基因構(gòu)建到同一遺傳轉(zhuǎn)化載體pZHZH15003中；

所述轉(zhuǎn)化載體pZHZH15003的具體構(gòu)建過(guò)程為：將CP4片段與PU130載體(該載體為pCambia3300的衍生載體，其構(gòu)建過(guò)程是：pCambia3300經(jīng)XhoI和HindIII酶切處理，用Pubi取代P35s-Bar部分得到PU130)分別用BamHI和SacI酶切，連接后得到骨架載體Pubi-CP4-T35spolyA；PCR擴(kuò)增rbcs啟動(dòng)子并在其兩端分別添加HindIII和XmaI酶切位點(diǎn)，連接到來(lái)自Promega公司的克隆載體pGEM7Z上，獲得中間載體7Z-rbcs；合成cry1C-Tnos片段并添加酶切位點(diǎn)XmaI和SphI；分別用XmaI和SphI切割該片段和中間載體7Z-rbcs，連接后得到中間載體Prbcs-cry1C-Tnos；使用PmeI單酶切骨架載體Pubi-CP4-T35spolyA，并用CIP處理去磷酸化；使用SacI酶切中間載體Prbcs-cry1C-Tnos，并補(bǔ)平粘性末端。連接上述處理后的骨架片段和插入片段Prbcs-cry1C-Tnos，構(gòu)建得到pZHZH15003載體。

(3)將步驟(2)中獲得的重組載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入到水稻品種‘空育131’中；具體步驟為：將構(gòu)建得到的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中；將農(nóng)桿菌菌液侵染水稻的胚性愈傷組織；將愈傷組織轉(zhuǎn)移到添加了草甘膦的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，挑選抗性愈傷組織；將 抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)，將分化形成的再生小苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，幼苗生根后煉苗、移栽，得到轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)化體。

(4)對(duì)步驟(3)的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行分子鑒定，篩選單拷貝插入且無(wú)載體骨架的T0代轉(zhuǎn)化植株，種植并收獲T1代種子；

(5)待步驟(4)的T1代種子發(fā)芽15天后噴施草甘膦，選取具有草甘膦抗性且符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律的轉(zhuǎn)基因水稻株系，檢測(cè)基因型，篩選純合株收獲T2代種子；

(6)種植步驟(5)的T2代種子，在植株不同生長(zhǎng)階段鑒定其對(duì)水稻螟蟲(chóng)的抗性，篩選抗蟲(chóng)性好的株系收獲T3代種子；

(7)將步驟(6)的T3代種子培育成植株，評(píng)估株系的農(nóng)藝性狀，選取農(nóng)藝性狀優(yōu)良的株系檢測(cè)T-DNA區(qū)核苷酸序列，篩選具有T-DNA區(qū)單拷貝的轉(zhuǎn)基因水稻植株；所述T-DNA區(qū)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或其互補(bǔ)序列或與其同源性達(dá)到90％以上的核苷酸序列；

(8)利用所述檢測(cè)方法對(duì)步驟(7)的轉(zhuǎn)基因水稻植株進(jìn)行驗(yàn)證，最終獲得抗螟蟲(chóng)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻；

所述抗螟蟲(chóng)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻，其T-DNA左邊界側(cè)翼序列如SEQ ID NO:2所示，或其互補(bǔ)序列或與其同源性達(dá)到90％以上的核苷酸序列；其T-DNA右邊界側(cè)翼序列如SEQ ID NO:3所示，或其互補(bǔ)序列或與其同源性達(dá)到90％以上的核苷酸序列。

其中，所述步驟5)中草甘膦的噴施濃度范圍為0.3％-9％V/V。

本發(fā)明還進(jìn)一步提供了抗螟蟲(chóng)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的構(gòu)建方法在雜草控制和害蟲(chóng)防治方面的應(yīng)用。

本發(fā)明獲得的抗螟蟲(chóng)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻植株KCRC03是以水稻品種‘空育131’為受體通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的，同時(shí)該轉(zhuǎn)化事件也適用于具有同樣的T-DNA片段、且插入到同樣基因組位置，而利用其他受體品種改良而獲得的植株。

本發(fā)明提供了抗螟蟲(chóng)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的檢測(cè)方法及應(yīng)用，適用于轉(zhuǎn)基因水稻的安全評(píng)估和檢測(cè)，以及由該轉(zhuǎn)化事件獲得的轉(zhuǎn)基因水稻為供體而得到的各種轉(zhuǎn)基因水稻新品種。

一方面，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因水稻事件，由該轉(zhuǎn)化事件獲得的轉(zhuǎn)基因水稻具有抗螟蟲(chóng)抗草甘膦的特性，應(yīng)用該轉(zhuǎn)基因水稻可以進(jìn)行轉(zhuǎn)基因水稻新品種的培育和改良以防治螟蟲(chóng)危害及雜草危害。

另一方面，本發(fā)明提供了一種抗螟蟲(chóng)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的檢測(cè)方法，應(yīng)用該方法可以對(duì)包含與該轉(zhuǎn)化事件具有同樣的T-DNA片段、且插入到同樣基因組位置的轉(zhuǎn)基因水稻(包含親本、雜種及其后代)及其制品(包括植株、組織、稻谷、大米及其制品)實(shí)施檢測(cè)、監(jiān)測(cè)和安全管理。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中轉(zhuǎn)化事件的T-DNA區(qū)及插入位置示意圖。箭頭表示轉(zhuǎn)化事件檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)位置，各元件的名稱標(biāo)注在圖上。LB，Left Border；RB，Right Border；S，SEQ ID NO。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中轉(zhuǎn)基因植株分子鑒定結(jié)果(抗體試紙檢測(cè))。A：Southern雜交鑒定轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)；B：抗體試紙鑒定外源蛋白表達(dá)。星號(hào)表示含KCRC03事件的樣品。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中轉(zhuǎn)基因植株的除草劑抗性及性狀分離的情況。箭頭指示的株系為野生型對(duì)照。轉(zhuǎn)基因株系中枯死的植株為分離出來(lái)的陰性基因型。星號(hào)表示含KCRC03事件的樣品。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中轉(zhuǎn)化事件對(duì)不同濃度草甘膦的耐受性的鑒定情況。A：野生型‘空育131’噴施0.3％的草甘膦；B、C、D、E、F、G、H、I分別為KCRC03轉(zhuǎn)基因水稻分別噴施0、0.3％、2.4％、4.8％、6％、9％、15％、24％(V/V)的草甘膦。噴施兩周后照相。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1中轉(zhuǎn)化事件對(duì)水稻螟蟲(chóng)的抗性鑒定情況。A：轉(zhuǎn)化事件對(duì)水稻二化螟的抗性；B：轉(zhuǎn)化事件對(duì)稻縱卷葉螟的抗 性。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例2中轉(zhuǎn)化事件的特異性檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果。A：普通PCR對(duì)KCRC03的定性檢測(cè)及基因型檢測(cè)。M，DL2000 plus DNA marker，大小標(biāo)注在旁邊；+/+表示KCRC03純合基因型；+/-表示KCRC03雜合基因型；-/-表示不含有KCRC03的基因型；B：Realtime-PCR對(duì)KCRC03的定量檢測(cè)。1-4分別為KCRC03不同含量模板的擴(kuò)增曲線產(chǎn)物。1，1000pg基因組DNA；2，125pg基因組DNA；3，15.6pg基因組DNA；4，1.9pg基因組DNA。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造廠商說(shuō)明書(shū)建議的條件。

實(shí)施例1抗螟蟲(chóng)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的獲得

抗螟蟲(chóng)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的構(gòu)建方法如下：

1、基因的合成、遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建以及轉(zhuǎn)基因植株的獲得

根據(jù)SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的序列，人工合成cp4 epsps和cry1C基因。構(gòu)建到同一遺傳轉(zhuǎn)化載體pZHZH15003中。載體pZHZH15003的具體構(gòu)建過(guò)程為：將CP4片段與PU130載體(該載體為pCambia3300的衍生載體，其構(gòu)建過(guò)程是：pCambia3300經(jīng)XhoI和HindIII酶切處理，用Pubi取代P35s-Bar部分得到PU130)分別用BamHI和SacI酶切，連接后得到骨架載體Pubi-CP4-T35spolyA；PCR擴(kuò)增rbcs啟動(dòng)子并在其兩端分別添加HindIII和XmaI酶切位點(diǎn)，連接到來(lái)自Promega公司的克隆載體pGEM 7Z上，獲得中間載體7Z-rbcs；合成cry1C-Tnos片段并添加酶切位點(diǎn)XmaI和SphI；分別用XmaI和SphI切割該片段和中間載體7Z-rbcs，連接后得到中間載體Prbcs-cry1C-Tnos；使用PmeI單酶切骨架載體Pubi-CP4-T35spolyA，并用CIP處理去磷酸 化；使用SacI酶切中間載體Prbcs-cry1C-Tnos，并補(bǔ)平粘性末端。連接上述處理后的骨架片段和插入片段Prbcs-cry1C-Tnos，構(gòu)建得到pZHZH15003載體。

載體T-DNA區(qū)域示意圖見(jiàn)圖1，T-DNA區(qū)核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。將重組pZHZH15003載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入到水稻品種‘空育131’中。具體導(dǎo)入的步驟為：將構(gòu)建得到的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中；將農(nóng)桿菌菌液侵染水稻的胚性愈傷組織；將愈傷組織轉(zhuǎn)移到添加了草甘膦的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，挑選抗性愈傷組織；將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)，將分化形成的再生小苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，幼苗生根后煉苗、移栽，得到轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)化體。

2、水稻轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定

對(duì)這些轉(zhuǎn)化事件拷貝數(shù)和載體骨架進(jìn)行分析，同時(shí)分析CP4EPSPS和cry1C蛋白的表達(dá)，篩選到單拷貝且沒(méi)有T-DNA區(qū)域以外載體骨架、蛋白正常表達(dá)的轉(zhuǎn)基因T0植株種到溫室并收獲T1代種子。KCRC03的分子鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1KCRC03的DNA陽(yáng)性鑒定結(jié)果

注：RQ值代表外源基因與內(nèi)源基因Actin的DNA拷貝比值。

RQ值在0.1-0.6區(qū)間時(shí)，認(rèn)為靶標(biāo)基因是單拷貝插入。但由于檢測(cè)RQ值存在著一定誤差，需要Southern方法進(jìn)行驗(yàn)證，具體操作按照如下步驟進(jìn)行。

1)CTAB法抽提轉(zhuǎn)化植株總基因組DNA。分單株取葉片0.5-1g，放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮快速將葉片研磨成粉末，倒入2mL離心管中。加入700μl預(yù)熱至65℃的1.5％CTAB提取液并搖勻，65℃水浴保溫30-60min，期間搖動(dòng)幾次；室溫冷卻后，加入700μl氯仿，搖勻后，顛倒輕搖10min，室溫下8000rpm離心10min；將上清移至另一離 心管中，加入等體積的沉淀液(異丙醇)，-20℃下沉淀30分鐘，室溫下8000rpm離心10min；用700μl 75％乙醇漂洗2-3次，風(fēng)干后溶于50μl TE中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2)基因組DNA的酶切。選用限制性內(nèi)切酶HindIII酶切轉(zhuǎn)化植株總基因組DNA，酶切反應(yīng)體系如下：

混勻后于37℃酶切10-18h左右，酶切后先取5μl酶切產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)電泳，檢測(cè)酶切效果。最后將酶切后的總DNA在1％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行低電壓(30-40V)電泳過(guò)夜。

3)轉(zhuǎn)膜。將凝膠修整后切去右下角作為標(biāo)記，浸泡在0.25mol/L HCl至溴酚藍(lán)變黃，蒸餾水洗兩次；堿變性液(1.5M NaCl,0.5M NaOH)中變性45min，去離子水漂洗；中和液(1M pH7.4的Tris-HCl，1.5M NaCl)中漂洗30min，更換中和液漂洗15min；置于搭好的轉(zhuǎn)膜臺(tái)上，用10×SSC作為轉(zhuǎn)膜液，Hybond-N+尼龍膜漂洗于去離子水液面，直至完全濕潤(rùn)，浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中；用10×SSC溶液進(jìn)行毛細(xì)管法轉(zhuǎn)移16-20h，將膠上的DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將尼龍膜用2×SSC溶液簡(jiǎn)單漂洗后，紫外交聯(lián)儀上交聯(lián)1min后，室溫晾干，用保鮮膜將膜包好，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

4)探針合成及雜交與顯影。探針標(biāo)記及雜交與顯影采用Roche公司DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit I，按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作。本發(fā)明以CP4基因部分序列作為雜交探針。

5)雜交。加熱雜交液DIG Easy Hyb(10ml/100cm2)，在雜交爐中42℃下預(yù)雜交30分鐘；95℃下變性探針(25ng/ml)，5分鐘后置于冰上；將變性探針加入到預(yù)先加熱的DIG Easy Hyb中(3.5ml/100cm2)，混勻；倒掉預(yù)雜交液，加入變性的探針；雜交爐中42℃下雜交4h-O/N。

6)洗膜。倒掉雜交液，然后用2×SSC，0.1％SDS室溫下洗滌兩次，每次5分鐘；最后用0.5×SSC，0.1％SDS，65℃下洗滌兩次，每次15分鐘。

7)顯色。同探針檢測(cè)操作。結(jié)果如圖2A所示，KCRC03轉(zhuǎn)化事件為外源T-DNA單拷貝插入基因組的事件。

利用上海佑隆生物科技有限公司產(chǎn)品AntiCP4和AntiCry1C試紙條通過(guò)如下步驟檢測(cè)植物組織中的蛋白。取樣：取測(cè)定組織(葉片、根、花粉等)，加水磨碎樣品；檢測(cè)：取試紙條，檢測(cè)端浸入樣品；結(jié)果觀察：5-10分鐘后觀察結(jié)果，對(duì)照線顯出，表示試驗(yàn)正常。檢測(cè)線是否顯出表示是否含有檢測(cè)蛋白。如圖2B所示，PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株全部可以檢測(cè)出條帶來(lái)，而野生型對(duì)照材料沒(méi)有檢測(cè)出條帶。表明外源的cp4 epsps基因和cry1C基因可以在轉(zhuǎn)基因水稻細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出蛋白。

3、水稻轉(zhuǎn)基因植株的草甘膦抗性鑒定及基因型分析

T1種子發(fā)芽，15天后噴施草甘膦，選取草甘膦抗性和敏感植株符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律的株系，取樣檢測(cè)基因型，選取純合株收獲T2種子；

為了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)草甘膦除草劑的抗性，于兩葉期以0.6％(V/V)濃度的草甘膦噴施，一周后觀察植株表型。結(jié)果顯示噴施除草劑后轉(zhuǎn)基因植株可以正常生長(zhǎng)而野生型材料逐漸干枯、死亡(如圖3所示，照片拍攝于噴施除草劑一周后)。這表明了含有本發(fā)明轉(zhuǎn)化事件的轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)草甘膦除草劑具有抗性。同時(shí)因?yàn)橥庠椿虻膯慰截惒迦?，在T0代時(shí)表現(xiàn)為雜合狀態(tài)，自交收獲T1種子后會(huì)有基因和性狀分離現(xiàn)象且符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，因此統(tǒng)計(jì)草甘膦抗性和敏感植株的比例可以驗(yàn)證外源基因的整合狀況。表2中數(shù)據(jù)表明，

KCRC03轉(zhuǎn)化事件的遺傳特點(diǎn)符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。

表2KCRC03 T1代株系的除草劑抗性及分離情況結(jié)果

4、水稻轉(zhuǎn)基因植株的螟蟲(chóng)抗性鑒定

播種T2代種子，鑒定其對(duì)草甘膦不同濃度的耐受性及對(duì)水稻螟蟲(chóng)的抗性。選取抗性好的株系收獲T3種子。

草甘膦耐受性分析通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)。播種：將轉(zhuǎn)基因和對(duì)照種子播種在穴盤(pán)中，待幼苗長(zhǎng)至三葉一心到五葉一心時(shí)期進(jìn)行草甘膦噴灑。施藥后二周內(nèi)觀察并記錄植株的葉色和長(zhǎng)勢(shì)等情況。草甘膦噴灑設(shè)計(jì)8個(gè)梯度，分別是草甘膦含量為0，0.3％，2.4％，4.8％，6％，9％，15％，24％(V/V)。結(jié)果如圖4所示(照片拍攝于噴施除草劑兩周后)，0.3％為廠家推薦的田間噴施濃度，野生型對(duì)照噴施0.3％的草甘膦后即會(huì)枯死，而轉(zhuǎn)基因水稻可以耐受9％(V/V)以下的濃度，相當(dāng)于可以耐受推薦噴施濃度的30倍。在噴施15％和24％濃度的草甘膦后轉(zhuǎn)基因植株會(huì)表現(xiàn)出葉尖變黃，生長(zhǎng)減緩，但依然能夠存活。

螟蟲(chóng)抗性鑒定通過(guò)室內(nèi)生測(cè)和田間調(diào)查兩種方式評(píng)估。室內(nèi)生測(cè)實(shí)驗(yàn)通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)。播種：將轉(zhuǎn)基因和對(duì)照種子播種在穴盤(pán)中，待發(fā)芽25天左右備用；接蟲(chóng)：在培養(yǎng)皿內(nèi)加入3-5片水稻葉片或2cm長(zhǎng)的莖稈，底部加入一層干凈濕潤(rùn)的濾紙，接入10頭二化螟初孵幼蟲(chóng)，用透氣膠帶封口，再用一塊大小合適的黑布蓋住，橡皮筋固定；培養(yǎng)：接種完畢后放在培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度28℃，濕度85％±5％，光照時(shí)間16L/8D；統(tǒng)計(jì)：接蟲(chóng)5天后統(tǒng)計(jì)二化螟死亡率和校正死亡率。死亡率以對(duì)照植株進(jìn)行校正，計(jì)算公式為：

田間調(diào)查方式為隨機(jī)選取10株水稻，計(jì)算整株葉片數(shù)和卷葉數(shù)以計(jì)算卷葉率來(lái)評(píng)估對(duì)稻縱卷葉螟的抗性；計(jì)算整株分蘗數(shù)和枯心數(shù)以計(jì)算枯心率來(lái)評(píng)估對(duì)水稻二化螟的抗性。螟蟲(chóng)抗性鑒定結(jié)果見(jiàn)表3和圖5，數(shù)據(jù)表明KCRC03對(duì)水稻螟蟲(chóng)的抗性較強(qiáng)，能夠有效的降低螟蟲(chóng)的危害，從而減少農(nóng)藥的施用量。

表3KCRC03對(duì)水稻螟蟲(chóng)的抗性。

5、水稻轉(zhuǎn)基因植株的綜合農(nóng)藝性狀

農(nóng)藝性狀分析采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，小區(qū)面積10.8平米，植株行間距26cm×16.5cm(五八寸)，小區(qū)內(nèi)種植20株×15行，轉(zhuǎn)基因和對(duì)照各種植3次重復(fù)。整個(gè)生育期采用正常的田間管理措施。收獲時(shí)，排除小區(qū)四周兩行的植株，在剩余范圍內(nèi)，隨機(jī)選取10個(gè)植株作為樣本，測(cè)定產(chǎn)量相關(guān)性狀并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，評(píng)估株系的綜合農(nóng)藝性狀。KCRC03的綜合農(nóng)藝性狀表現(xiàn)見(jiàn)表4。數(shù)據(jù)表明在螟蟲(chóng)沒(méi)有發(fā)生或是害蟲(chóng)防治措施良好的情況，KCRC03的綜合農(nóng)藝性狀不會(huì)比野生型對(duì)照的差。

表4KCRC03的綜合農(nóng)藝性狀

6、T-DNA區(qū)的側(cè)翼序列分離及插入位置確定

選取農(nóng)藝性狀優(yōu)良的株系分離T-DNA區(qū)的側(cè)翼序列。得到的側(cè)翼序列與水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，明確外源T-DNA插入位置。

利用Adaptor-PCR分析轉(zhuǎn)基因片段插入位置，具體步驟如下：

用2mL離心管法制備基因組DNA備用。

用ddH2O將接頭引物AD-L(CTAATACGAGTCACTATAGCGCTCGAGCGGCCGCCGGGGAGGT)和AD-S(Pi-ACCTCCCC-NH2)分別稀釋到100μmol/L，等體積 混合，94℃水浴變性4min，自然冷卻至室溫后即為50μmol/L的接頭。

在滅菌的0.5mL離心管中加入下列反應(yīng)體系，室溫(25℃)孵育16h：

反應(yīng)結(jié)束后65℃水浴10min終止反應(yīng)。

以步驟3中的酶切連接產(chǎn)物作為第一輪PCR反應(yīng)的模板。反應(yīng)體系如下：

其中，所述SP1和VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示和SEQ ID NO:13所示。

首輪PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃，5min；(94℃，30sec；72℃，3min)×7cycles；(94℃，30sec；67℃，3min)×32cycles；67℃，7min；25℃，10min。

以步驟4中相應(yīng)的PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：

其中，所述SP2和VP2的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示和SEQ ID NO:14所示。

二輪PCR反應(yīng)程序：94℃，5min；(94℃，30sec；72℃，3min)×5cycles；(94℃，30sec；67℃，3min)×20cycles；67℃，7min；25℃，10min。

取5μL第二輪PCR的產(chǎn)物于1％(w/v)0.5×TBE瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，挑選有250bp以上DNA片段的PCR產(chǎn)物用雙脫氧鏈終止法進(jìn)行測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果在RGAP數(shù)據(jù)庫(kù)中(http://rice.plantbiology.msu.edu/)用BLASTN工具與水稻基因組序列進(jìn)行同源比對(duì)，以最好的匹配結(jié)果為插入位點(diǎn)。

得到的側(cè)翼序列如SEQ ID NO:2所示和SEQ ID NO:3所示。

利用以上步驟獲得的轉(zhuǎn)化事件KCRC03單拷貝插入水稻基因組第二染色體chr02:28815121-28815137位置，具有螟蟲(chóng)和草甘膦的抗性，且其他農(nóng)藝性狀與‘空育131’對(duì)照品種無(wú)明顯差異。包含該轉(zhuǎn)化事件的轉(zhuǎn)基因植株可以用大面積噴灑的方法去除雜草和雜株，提高工作效率。同時(shí)該類(lèi)轉(zhuǎn)基因植株可以防止螟蟲(chóng)對(duì)水稻植株的危害，減少農(nóng)藥的施用量，從而保證產(chǎn)量的穩(wěn)定，減少勞動(dòng)投入，降低農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的污染。此外，該轉(zhuǎn)化事件可以作為供體通過(guò)有性雜交或定點(diǎn)插入等方法導(dǎo)入其他水稻植株中從而使得其他水稻植株獲得抗螟蟲(chóng)抗草甘 膦的特性。因此只要含有與KCRC03轉(zhuǎn)化事件同樣的T-DNA片段、且插入到同樣基因組位置的水稻植株都屬于本發(fā)明保護(hù)范疇。

實(shí)施例2抗螟蟲(chóng)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的檢測(cè)方法

依據(jù)KCRC03轉(zhuǎn)化事件的外源T-DNA區(qū)邊界序列及側(cè)翼的水稻基因組序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增特異性條帶，以檢測(cè)水稻樣品中是否含有與KCRC03轉(zhuǎn)化事件同樣的T-DNA片段、且插入到同樣基因組位置的事件以及轉(zhuǎn)化事件的基因型和含量。具體操作按照如下步驟進(jìn)行。

1)抽提水稻葉片基因組DNA(具體方法見(jiàn)實(shí)施例1)。

2)采用普通PCR方法，設(shè)計(jì)特異性引物L(fēng)BF1、LBR和RBR，序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示進(jìn)行檢測(cè)。PCR反應(yīng)總體積為20μl：DNA模板2μl，10×PCR buffer 2μl，10mM dNTP 0.4μl，10mM LBF1引物0.8μl，10mM LBR和RBR引物各0.4μl，Taq DNA聚合酶0.2μl，加水到20μl。PCR反應(yīng)條件如下：①94℃預(yù)變性4分鐘，②94℃變性0.5分鐘，③58℃退火0.5分鐘，④72℃延伸0.5分鐘，⑤從②－④循環(huán)35次，⑥72℃延伸10分鐘，⑦4℃保存。PCR產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖6A所示。用此特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)出一條343bp大小帶型的材料為KCRC03純合基因型的材料，擴(kuò)出一條470bp大小帶型的材料為不含KCRC03事件的材料，擴(kuò)出兩條帶型且大小分別為343bp和470bp的材料為KCRC03雜合基因型的材料。PCR產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。

3)采用Realtime-PCR方法，設(shè)計(jì)特異性引物L(fēng)BF2和LBR，序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示進(jìn)行檢測(cè)。PCR反應(yīng)總體積為10μl：DNA模板0.5μl，10mM LBF2和LBR引物各0.2μl，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master[ROX]5μl，加水到10μl。PCR反應(yīng)條件如下：①95℃預(yù)變性10分鐘，②95℃變性10秒，③60℃退火延伸30 秒，④從②－③循環(huán)40次。Realtime-PCR擴(kuò)增曲線如圖6B所示，擴(kuò)增產(chǎn)物如SEQ ID NO:10所示。此方法最低檢測(cè)到的KCRC03基因組DNA含量為15pg，表明該檢測(cè)方法靈敏度高。

KCRC03轉(zhuǎn)化事件檢測(cè)方法的建立，可以確認(rèn)轉(zhuǎn)基因水稻樣品是否含有該轉(zhuǎn)化事件以及轉(zhuǎn)化事件的基因型和含量。這不僅能夠應(yīng)用于KCRC03轉(zhuǎn)基因水稻大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)對(duì)其轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測(cè)、監(jiān)測(cè)和標(biāo)識(shí)，還能在雜交育種過(guò)程中的目標(biāo)片段跟蹤方面發(fā)揮重要的作用。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。