本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種煙草GCN2啟動(dòng)子、其表達(dá)載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

21世紀(jì)以來(lái)，農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育面臨著諸多問(wèn)題。首先，由于化肥的過(guò)量使用及工業(yè)廢水的亂排放導(dǎo)致耕作土壤的板結(jié)、鹽堿化及重金屬過(guò)量；其次，由于除草劑過(guò)量使用及生物入侵，作物也不得不面對(duì)新的超級(jí)雜草；最后，由于大氣環(huán)境污染及溫室氣體的排放，近些年厄爾尼諾現(xiàn)象日趨頻繁，局部地區(qū)的干旱及內(nèi)澇現(xiàn)象越來(lái)越多。因此，如何使作物在如此新的復(fù)雜的生存環(huán)境下生長(zhǎng)發(fā)育變成了近些年研究的熱點(diǎn)。在這種背景下，除了常規(guī)技術(shù)手段外，更多的研究人員將目光聚焦于參與調(diào)節(jié)應(yīng)答各種脅迫的基因上。而啟動(dòng)子作為基因表達(dá)的“開(kāi)關(guān)”，是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要組成部分，也受到越來(lái)越多科學(xué)家的關(guān)注。

GCN2 (general control non-derepressible 2)作為eIF2的激酶，通過(guò)磷酸化eIF2的α亞基，來(lái)應(yīng)答各種生物和非生物脅迫。在動(dòng)物中存在四種eIF2α 激酶（PKR、PERK、HRI和GCN2）來(lái)分別應(yīng)答不同的脅迫。在植物中，GCN2是由單個(gè)基因編碼的，并且是唯一的eIF2α激酶。另外，序列分析表明高等植物中只存在一個(gè)GCN2類(lèi)似的eIF2α激酶(Zhang等，2003；Lageix等，2008；Zhang等，2008；Hey等，2010) 這表明植物與動(dòng)物不同，植物中僅存在一種eIF2α激酶，它在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起到重要作用。

目前研究發(fā)現(xiàn)植物中的GCN2能被多種植物信號(hào)物質(zhì)激活，如MMS(甲磺酸甲酯)、MeJA（甲基茉莉酸酯）、ACC(1-氨基環(huán)丙烷-1羧酸)或SA（水楊酸）等處理植物后，并且磷酸化真核翻譯起始因子eIF2α(Lageix等，2008；Zhang等，2008)；并且很多植物激素在植物免疫反應(yīng)中起著重要作用的信號(hào)分子，尤其是水楊酸（SA）更是被稱(chēng)之為植物抗病激素。此外，研究發(fā)現(xiàn)植物中GCN2介導(dǎo)的eIF2α磷酸化可以被UV輻射、冷脅迫、嘌呤缺乏和損傷等脅迫所激活(Lageix等，2008；Zhang等，2008)，這說(shuō)明GCN2對(duì)植物激素響應(yīng)與應(yīng)答脅迫之間有著密切關(guān)系。

啟動(dòng)子是提供RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的一段DNA序列和相關(guān)的調(diào)控元件，通常位于基因的上游，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，是調(diào)控基因表達(dá)的手段。而煙草GCN2啟動(dòng)子，在其基因序列上不僅有TATA-box(Goldberg-Hogness框或Hogness框)和起始因子(initiator)等核心元件，還發(fā)現(xiàn)了MeJA、ERE等應(yīng)答元件。由于煙草是重要的模式植物及經(jīng)濟(jì)作物， 因此，煙草GCN2啟動(dòng)子的分離和鑒定對(duì)于煙草應(yīng)答各種逆境脅迫研究以及煙草作為生物反應(yīng)器表達(dá)外源基因具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種可以啟動(dòng)GCN2基因的表達(dá)，其序列中存在的植物激素等響應(yīng)元件可以用來(lái)調(diào)控GCN2基因表達(dá)的煙草GCN2啟動(dòng)子。

為達(dá)到以上目的，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

設(shè)計(jì)一種煙草GCN2啟動(dòng)子，其核苷酸序列為：

（1）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或

（2）與（1）限定的核苷酸序列中至少具有90%同源性的核苷酸序列。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的真核表達(dá)載體，該載體的啟動(dòng)子是核苷酸序列為SEQ ID NO.1的啟動(dòng)子，可以是外源目的基因在煙草中表達(dá)。

上述煙草GCN2啟動(dòng)子可在啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用，所述目的基因優(yōu)選為GUS 基因。

上述煙草GCN2啟動(dòng)子啟動(dòng)GUS 基因表達(dá)的方法，包括以下步驟：

（1）將上述煙草GCN2啟動(dòng)子插入pCAMBIA-NPT-GUS載體的中并且替換該載體中已有的35S啟動(dòng)子，得到重組質(zhì)粒；

（2）將所得重組質(zhì)粒導(dǎo)入出發(fā)植物并進(jìn)行培育，在所述出發(fā)植物中由所述GCN2啟動(dòng)子啟動(dòng)所述重組質(zhì)粒中的GUS基因表達(dá)。所述出發(fā)植物為單子葉植物或雙子葉植物，優(yōu)選為煙草，更優(yōu)選為煙草K326。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種在植物中表達(dá)外源基因的方法，采用上述重組表達(dá)載體，將外源目的基因?qū)朐撦d體，轉(zhuǎn)化植物，獲得的轉(zhuǎn)化植物可以表達(dá)外源基因。

本發(fā)明啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)目的基因在植物中表達(dá)，能夠作為生物反應(yīng)器的技術(shù)支撐。此外，本發(fā)明提供的啟動(dòng)子序列上包含多個(gè)激素和脅迫響應(yīng)位點(diǎn)，有助于促進(jìn)人們對(duì)煙草應(yīng)答脅迫機(jī)理的研究，本發(fā)明在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間和市場(chǎng)前景。

本發(fā)明具有以下積極有益的技術(shù)效果：

1.本發(fā)明分離了煙草GCN2基因的上游啟動(dòng)子序列，提供的啟動(dòng)子序列可驅(qū)動(dòng)GUS基因在煙草中表達(dá)，能作為植物遺傳轉(zhuǎn)化表達(dá)外源基因及煙草生物反應(yīng)器所用的表達(dá)元件。

2. 本發(fā)明所提供的序列包含乙烯(ERE)和茉莉酸甲酯(MeJA)等植物激素響應(yīng)位點(diǎn)，同時(shí)該序列位于煙草GCN2的上游，在煙草中可以啟動(dòng)GCN2基因的表達(dá)，其序列中存在的植物激素等響應(yīng)元件可以用來(lái)調(diào)控GCN2基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控?zé)煵莸牡鞍缀铣伞?/p>

附圖說(shuō)明

圖1：本發(fā)明煙草GCN2啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增電泳圖。

圖2: 本發(fā)明的重組表達(dá)載體pCAMBIA-NPT-GCN2-Pro11:GUS轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后質(zhì)粒提取電泳圖。

圖3：本發(fā)明的重組表達(dá)載體pCAMBIA-NPT- GCN2-Pro11:GUS轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后質(zhì)粒PCR電泳圖。

圖4：本發(fā)明重組表達(dá)載體pCAMBIA-NPT-GCN2-Pro11:GUS侵染煙草K326遺傳轉(zhuǎn)化效果；其中左上為陰性對(duì)照，右上為陽(yáng)性對(duì)照，左下為轉(zhuǎn)GCN2啟動(dòng)子陽(yáng)性分化苗，右下為煙草GCN2啟動(dòng)子陽(yáng)性分化苗的生根圖。

圖5：本發(fā)明煙草GCN2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化煙草葉片的GUS染色效果。 其中左圖陰性對(duì)照為未轉(zhuǎn)基因的煙草K326染色圖；中圖陽(yáng)性對(duì)照為含有35S啟動(dòng)子的pCAMBIA-NPT-GUS轉(zhuǎn)基因煙草染色圖；右圖為pCAMBIA-NPT-NtGCN2-Pro11:GUS轉(zhuǎn)化煙草后染色圖。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。

實(shí)施例1煙草GCN2啟動(dòng)子基因的分離，包括以下步驟：

（1）煙草基因組DNA的制備

取種植于溫室兩個(gè)月的煙草，取其嫩葉，采用CTAB 法提取基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后于-20℃下進(jìn)行保存。

（2） NtGCN2啟動(dòng)子的克隆和序列分析

以煙草基因組DNA為模板，根據(jù)設(shè)計(jì)的如下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物為GCN2-Pro11-F：CACACACCCCTATCCATCGC；

下游引物為GCN2-Pro11-R：AAAAAATACACTGGAAGCTGGCC。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性4 min，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，共28個(gè)循環(huán)，4℃保存。

將PCR產(chǎn)物連接到pCAMBIA-NPT-GUS載體，克隆并進(jìn)行質(zhì)粒PCR 檢測(cè)（質(zhì)粒命名為pCAMBIA-NPT-GCN2-Pro11:GUS），并測(cè)序獲得長(zhǎng)度為1184 bp的GCN2啟動(dòng)子，其序列為SEQ ID NO：1。然后使用PLACE軟件（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）對(duì)啟動(dòng)子序列中的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子含有真核生物啟動(dòng)子的基本保守元件TATA-box 和CAAT-box，還含有損傷誘導(dǎo)、MeJA和ERE等植物激素響應(yīng)元件。

實(shí)施例2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建，包括以下步驟：

將pCAMBIA-NPT-GUS載體用EcoRI/HindIII酶切后，回收大片段待用。

將實(shí)施例1中的GCN2-Pro的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，將該目的片段連接至酶切后的pCAMBIA-NPT-GUS載體中。在10 μl體系中，把目的片段與載體片段用ClonExpress^TMⅡ酶進(jìn)行重組反應(yīng)，采用PCR方法確定陽(yáng)性重組子，見(jiàn)圖1。從而使本發(fā)明的啟動(dòng)子與GUS基因融合，得到表達(dá)GUS基因的植物重組表達(dá)載體pCAMBIA-NPT- GCN2-Pro11:GUS。

實(shí)施例3 煙草啟動(dòng)子活性的鑒定，包括以下步驟：

（1）農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化

通過(guò)熱激轉(zhuǎn)化法，將在實(shí)施例2中構(gòu)建的表達(dá)GUS基因的植物重組表達(dá)載體pCAMBIA-NPT-GCN2-Pro11:GUS轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中EHA105中，提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR鑒定，見(jiàn)圖3，確定質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到了農(nóng)桿菌中。

取煙草種子，利用酒精和次氯酸鈉消毒后播種到發(fā)苗培養(yǎng)基上，等苗子長(zhǎng)到0.5 cm左右轉(zhuǎn)到移苗培養(yǎng)基上。待葉片長(zhǎng)至5-8片葉的時(shí)候，選取綠色葉片，進(jìn)行上述的轉(zhuǎn)入了pCAMBIA-NPT-GUS的農(nóng)桿菌侵染，具體就是將28℃ 培養(yǎng)的農(nóng)桿菌，OD₆₀₀=0.8，加入20 mg/L 的AS（乙酰丁香酮），利用葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草，并通過(guò)選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。

（2）轉(zhuǎn)基因植株Gus 表達(dá)活性分析

GUS 緩沖液：由溶劑和溶質(zhì)組成；溶劑為pH7.0、50 mmol/L 磷酸氫鈉緩沖液；溶質(zhì)及其濃度：10 mmol/L EDTA、0.1%(體積比)Triton X-100、2 mmol/L 鐵氫化鉀和2 mmol/L 亞鐵氫化鉀；4° C 下保存?zhèn)溆?。GUS 染色液：用N，N- 二甲基甲酰胺溶解X-Gluc 粉劑，配成20mmol/L 的溶液，于-20° C 下保存?zhèn)溆谩?/p>

取轉(zhuǎn)基因煙草T0代葉片進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。待轉(zhuǎn)基因煙草植株長(zhǎng)至6片左右的葉片時(shí)，取一片葉進(jìn)行GUS組織化學(xué)檢測(cè)，見(jiàn)圖4。

圖5結(jié)果表明，GUS活性強(qiáng)的顯示出很深的藍(lán)色，無(wú)藍(lán)色表示GUS活性較低。其中陰性對(duì)照未染出顏色，陽(yáng)性對(duì)照染出藍(lán)色表明GUS染液能夠正常染色，而右圖染出藍(lán)色表明煙草GCN2啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)，進(jìn)而使其在GUS染液中呈現(xiàn)藍(lán)色。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 煙草GCN2啟動(dòng)子及其應(yīng)用

<130> /

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1184

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cacacacccc tatccatcgc tttgttctct ttggtacaac ctaggcttcc aacaattttt 60

catttgtttc ccatatattt gaaagttggt tatatagtct cctcttcatg gtaaacttga 120

tattttggat gtgagttgtt ggcttggagt tgagaaaaaa aaatattccg cttcttgatt 180

tataatttgt gcgatactag caataagtcc gatttagact ttcctatcca ttgccctggg 240

aatacaattt cttcacggaa aaaaccccct tcaaagaatg caggttttta attgagatca 300

aatggaataa acccccaaca gatactatca agctaatcat tgacgatgcc ttctcaaaaa 360

atacactgga agctggcctt ggtggtgtct ttagaaacaa caatggagat tggattgttg 420

gcttctgcaa atcaacttat gcttcatctc atacaatgtg aattaatggc tctctatgaa 480

ggattaaaaa ttgctcaaga aatgaggttc ccaaagatag aaatagagac agattcaacg 540

gatattataa cacttctcta tgagaacaac caaaacctct ctaatctaat ttttgaatgc 600

aggtggttaa tgcaccagtt gaagctccca acccttatgc ataacttcag ggaaggaaat 660

gttgtggccc atctcttggc gaaggaagca gtgaattttt taaagctttt aaatattttt 720

accatgcacg tccgccttgt tttattgaac ctcaattgtc aaatgacaag catggtctta 780

gtattagttc taagtatatt ttttcttctg tgtgtaacaa acttgccaag tttggcaatg 840

ttaatgtcct tagggactat ttaatgactt tgtaattttc cgttattaat atcatccttt 900

tatttcaaaa acaaaaaaaa aagagttaaa tggctaatta tgcaccctac ccaataacat 960

ttttccaaca aataacatta tttttcagca cactaataga ttgtcgcaat tttttcattt 1020

ttttttcttt cataaatcca actagttttt gacgaaagtg taaaattgat aagtaatttg 1080

tgttgaagct aaagcgttaa aggtaaagaa aatagaaggt acgatcgaat tgctcaattg 1140

ttgaatctag tttcgctccc gcctccattc gggcaaatct caga 1184

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cacacacccc tatccatcgc 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaaaaataca ctggaagctg gcc 23