本發(fā)明屬于遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種煙草腋芽生長調(diào)控基因NtIPT1及其克隆方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

煙草（Nicotiana tabacum）是重要的經(jīng)濟(jì)作物，是茄科一年生草本植物。打頂抹芽是優(yōu)質(zhì)烤煙種植過程中一項(xiàng)重要的生產(chǎn)技術(shù)措施。煙草在一定的生長時期必須打頂，而打頂后會萌生大量的側(cè)芽。側(cè)芽耗費(fèi)營養(yǎng)，會降低煙葉的品質(zhì)和產(chǎn)量，因此必須抹掉側(cè)芽。人工抹芽耗費(fèi)人力和物力，提高了煙葉生產(chǎn)成本。打頂后施用化學(xué)藥劑可抑制腋芽生長，降低了煙葉生產(chǎn)勞動強(qiáng)度。但化學(xué)藥劑需要成本，且會造成環(huán)境污染。本發(fā)明以發(fā)現(xiàn)打頂后產(chǎn)生側(cè)芽（腋芽）的相關(guān)基因?yàn)橥黄瓶?，通過生物技術(shù)創(chuàng)建無側(cè)芽、少側(cè)芽或小側(cè)芽的煙草，則有可能從根本上或大幅度解決上述問題，從而實(shí)現(xiàn)在煙草生長量、煙葉品質(zhì)、環(huán)保等方面均有較大提升。

異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（Isopentenyl-transferase）是細(xì)胞分裂素生物合成的限速酶，細(xì)胞分裂素（Cytokinin，CTK）是促進(jìn)細(xì)胞分裂的激素，在植物生長發(fā)育過程中行使重要功能，如參與細(xì)胞分裂、光合作用、衰老及營養(yǎng)代謝等過程。細(xì)胞分裂素從化學(xué)角度看主要分為兩類，一類是在天然細(xì)胞分裂素異戊烯腺嘌呤 N6 位上進(jìn)行取代，側(cè)鏈通常為芳香環(huán)衍生物或類異戊二烯基，包括6-呋喃甲基腺嘌呤（KT）、6-芐基腺嘌呤（6-BA）等，稱嘌呤型細(xì)胞分裂素；另一類為苯基脲型細(xì)胞分裂素，即N，N'-二苯基脲（DPU）以及一些苯基脲的衍生物，如噻重氮苯基脲、N-（4-吡啶基）N'-苯基脲、N-苯基-N'-（2-氯-4-吡啶基）脲等。隨著擬南芥（Arabidopsis）基因組測序工作的完成，編碼IPT的基因家族也被證實(shí)，包括9個成員AtIPT1~AtIPT9，據(jù)報(bào)道除AtIPT2和AtIPT9以外，其他7個基因能夠編碼大腸桿菌中細(xì)胞分裂素的生物合成，煙草（中國）基因組測序工作業(yè)已完成，但少有報(bào)道。我們在對煙草異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因家族（NtIPTs）進(jìn)行了廣泛理論研究和應(yīng)用實(shí)踐，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)煙草異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因1（NtIPT1）在煙草打頂后具有促進(jìn)側(cè)芽（腋芽）生長的多方面的生理作用，通過植物基因工程技術(shù)控制煙草打頂后側(cè)芽生長發(fā)育方面具有生產(chǎn)應(yīng)用重要意義，也使植物激素的基因工程在遺傳育種中的應(yīng)用方面展現(xiàn)了新的作用。

國際上一些知名煙草公司和研究機(jī)構(gòu)正采用生物技術(shù)和基因工程技術(shù)對煙草無腋芽少腋芽品種進(jìn)行研究，以提高煙草品質(zhì)，減少對煙草打頂后化學(xué)藥劑的施用，以降低煙葉生產(chǎn)勞動強(qiáng)度、化學(xué)藥劑成本和環(huán)境污染。目前，我國也提出了無腋芽優(yōu)質(zhì)煙的開發(fā)計(jì)劃，為煙草無腋芽少腋芽品種研究提供了無限契機(jī)。隨著煙草無腋芽少腋芽品種研究的深入，必將使我國煙草腋芽控制邁上新臺階，為我國煙葉的健康和可持續(xù)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。因此，開發(fā)一種利用生物技術(shù)手段創(chuàng)制無腋芽少腋芽品種的候選基因，通過基因操作減少煙草腋芽是非常必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種煙草腋芽生長調(diào)控基因NtIPT1；第二目的在于提供所述的煙草腋芽生長調(diào)控基因NtIPT1的克隆方法；第三目的在于提供所述的煙草腋芽生長調(diào)控基因NtIPT1的應(yīng)用。

本發(fā)明的第一目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的煙草腋芽生長調(diào)控基因NtIPT1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

本發(fā)明的第二目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，包括以下步驟：

A、確定NtIPT1基因序列；

（1）利用同源基因擬南芥At IPT1序列搜索NCBI煙草基因組數(shù)據(jù)庫，得到煙草NtIPT1的核苷酸序列，該核苷酸序列的NCBI號為XM_016617583.1；利用此序列設(shè)計(jì)基因克隆引物：

正向引物：5′- AACCTTTTCTTTCTCCAAAACG -3′；

反向引物：5′- CAAAACTGGCGATCGATTACG -3′；

B、提取煙草根組織RNA，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA；

C、根據(jù)NtIPT1基因序列設(shè)計(jì)合成特異性引物，以反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選用Phusion高保真擴(kuò)增酶反應(yīng)體系，體系總體積50μL，包括：200ng cDNA，5×Phusion HF反應(yīng)緩沖液，10mM dNTP，2U的Phusion? High-Fidelity DNA Polymerase，加入特異性引物的正反向引物各1μM，PCR反應(yīng)在Mastercycler? pro擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃，30秒；98℃，7秒，60℃，30秒，72℃，40秒，30個循環(huán)；72℃延伸7分鐘；回收和純化PCR產(chǎn)物；

D、純化產(chǎn)物與載體連接，通過試劑盒反應(yīng)與TOPO載體連接，連接體系與過程如下： 4μL純化產(chǎn)物+1μL salt solution +1μL PCR-BluntⅡ-TOPO混勻，25℃，水浴30min；將連好的載體通過熱激轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，加液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)后涂到含100mg/L 卡那霉素的LB平板上過夜培養(yǎng)， 長出菌后挑取菌落進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后取2ml菌液提取質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒PCR檢測。篩選陽性克隆，對陽性克隆進(jìn)行測序。

本發(fā)明的第三目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的煙草腋芽生長調(diào)控基因NtIPT1在獲得降低打頂后煙草產(chǎn)生腋芽的發(fā)育長度和重量的轉(zhuǎn)基因植株中的應(yīng)用。即所述的煙草腋芽生長調(diào)控基因NtIPT1用于抑制打頂后腋芽的生長。

本發(fā)明利用同源克隆技術(shù)從煙草中得到一個煙草腋芽生長調(diào)控基因NtIPT1，具體步驟為：利用同源基因擬南芥AtIPT1序列搜索NCBI煙草基因組數(shù)據(jù)庫，得到煙草NtIPT1的核苷酸序列（NCBI號：XM_016617583.1）；利用此序列信息設(shè)計(jì)基因特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到目的產(chǎn)物；對目的產(chǎn)物測序，得到NtIPT1基因序列；利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得NtIPT1基因的RNAi植株，對NtIPT1進(jìn)行功能驗(yàn)證，結(jié)果表明抑制NtIPT1基因的表達(dá)可以控制煙草側(cè)芽生長發(fā)育（包括腋芽發(fā)生長度、重量）。NtIPT1基因的發(fā)現(xiàn)，為通過調(diào)控基因的表達(dá)，控制煙草側(cè)芽生長發(fā)育，為生產(chǎn)綠色優(yōu)質(zhì)煙葉提供了基因資源。

附圖說明

圖1為利用引物對NtIPT1F/NtIPT1R擴(kuò)增NtIPT1基因結(jié)果，擴(kuò)增產(chǎn)物1176bp；

圖2為TOPO-NtIPT1載體PCR鑒定，所用引物對為NtIPT1F/NtIPT1R，擴(kuò)增產(chǎn)物為969 bp；

圖3為 TOPO-NtIPT1載體酶切鑒定，利用BamH I和XhoI雙酶切，可以獲得1000bp左右的目的條帶；

圖4為NtIPT1基因RNAi載體片段PCR擴(kuò)增結(jié)果，所用引物對為IPTRNAiF/IPTRNAiR，擴(kuò)增產(chǎn)物為200 bp；

圖5為RNAi 載體TOPO -NtIPT1的酶切驗(yàn)證，BamH I和XhoI雙酶切后，可以將200bp左右的（目的條帶）反向重復(fù)單元切下；

圖6為NtIPT1 RNAi煙草腋芽生長大小，Vector Control（VC）為轉(zhuǎn)空載體對照，其余為轉(zhuǎn)基因株系；

圖7為NtIPT1 RNAi煙草腋芽生長重量，Vector Control（VC）為轉(zhuǎn)空載體對照，其余為轉(zhuǎn)基因株系。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明所述的煙草腋芽生長調(diào)控基因NtIPT1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

所述的煙草腋芽生長調(diào)控基因NtIPT1編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本發(fā)明所述的煙草腋芽生長調(diào)控基因NtIPT1的克隆方法，包括以下步驟：

A、確定NtIPT1基因序列；

（1）利用同源基因擬南芥At IPT1序列搜索NCBI煙草基因組數(shù)據(jù)庫，得到煙草NtIPT1的核苷酸序列，該核苷酸序列的NCBI號為XM_016617583.1；利用此序列設(shè)計(jì)基因克隆引物：

正向引物：5′- AACCTTTTCTTTCTCCAAAACG -3′；

反向引物：5′- CAAAACTGGCGATCGATTACG -3′；

B、提取煙草根組織RNA，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA；

C、根據(jù)NtIPT1基因序列設(shè)計(jì)合成特異性引物，以反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選用Phusion高保真擴(kuò)增酶反應(yīng)體系，體系總體積50μL，包括：200ng cDNA，5×Phusion HF反應(yīng)緩沖液，10mM dNTP，2U的Phusion? High-Fidelity DNA Polymerase，加入特異性引物的正反向引物各1μM，PCR反應(yīng)在Mastercycler? pro擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃，30秒；98℃，7秒，60℃，30秒，72℃，40秒，30個循環(huán)；72℃延伸7分鐘；回收和純化PCR產(chǎn)物；

D、純化產(chǎn)物與載體連接，通過試劑盒反應(yīng)與TOPO載體連接，連接體系與過程如下： 4μL純化產(chǎn)物+1μL salt solution +1μL PCR-BluntⅡ-TOPO混勻，25℃，水浴30min；將連好的載體通過熱激轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，加液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)后涂到含100mg/L 卡那霉素的LB平板上過夜培養(yǎng)， 長出菌后挑取菌落進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后取2ml菌液提取質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒PCR檢測。篩選陽性克隆，對陽性克隆進(jìn)行測序。

C步驟中所述的特異性引物引物為：

正向引物：5′- AACCTTTTCTTTCTCCAAAACG -3′；

反向引物：5′- CAAAACTGGCGATCGATTACG -3′。

D步驟中所述的培養(yǎng)基為：稱取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g 溶解于1L 蒸餾水中，高溫滅菌（121℃，25min）后使用。

本發(fā)明所述的煙草腋芽生長調(diào)控基因NtIPT1的應(yīng)用為所述的煙草腋芽生長調(diào)控基因NtIPT1在獲得降低打頂后煙草產(chǎn)生腋芽的發(fā)育長度和重量的轉(zhuǎn)基因植株中的應(yīng)用。即所述的煙草腋芽生長調(diào)控基因NtIPT1用于抑制打頂后腋芽的生長。

所述用于獲得降低打頂后煙草產(chǎn)生腋芽的發(fā)育長度和重量的轉(zhuǎn)基因植株的方法包括以下步驟：

A、構(gòu)建RNAi載體：

a、以pCR?-BluntII-TOPO載體為中間載體、PK7GW1Wg2為表達(dá)載體構(gòu)建NtIPT1基因的RNAi 載體，構(gòu)建引物為：

NtIPT1-RNAiF: 5’-GGATCCCGCCGGAAAATCAAGACTGT-3’，

NtIPT1-RNAiR: 5’-CTCGAGACTGCAAGTGAAGCCATGTT-3’，

NtIPT1-RNAiF中GGATCC處為BamH I酶切位點(diǎn)；NtIPT1-RNAiR中CTCGAG處為Xho I酶切位點(diǎn)；

b、以NtIPT1陽性克隆TOPO質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體積為50μL，包括：200ng cDNA，5×Phusion HF反應(yīng)緩沖液，10mM dNTP，2U的Phusion? High-Fidelity DNA Polymerase，加入NtIPT1-RNAiF引物、NtIPT1-RNAiR引物各1μM，PCR反應(yīng)在Mastercycler? pro擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃，30秒；98℃，7秒，55℃，30秒，72℃，30秒，30個循環(huán)；72℃延伸7分鐘；回收和純化PCR產(chǎn)物；

c、回收目的片段產(chǎn)物與TOPO載體連接：通過試劑盒反應(yīng)與TOPO載體連接。連接體系與過程如下： 4μL純化產(chǎn)物+1μL salt solution +1μL PCR?-BluntⅡ-TOPO混勻，25℃，水浴30min，將連好的載體通過熱激轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，加培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)后涂到含100mg/L 卡那霉素的LB平板上過夜培養(yǎng)。 長出菌后挑取菌落進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后取2ml菌液提取質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒PCR檢測。篩選陽性克隆，對陽性克隆進(jìn)行測序；

d、入門克隆pENTR^TM2B-NtIPT1RNAi的構(gòu)建：用上步測序?qū)Φ腡OPO質(zhì)粒和pENTR^TM2B空載體做酶切反應(yīng)：BamH I + XhoI雙酶切TOPO質(zhì)粒和pENTR^TM2B-ccdB得到目的基因片段和載體片段pENTR^TM2B，切膠回收后進(jìn)行連接、連接體系：連接反應(yīng)總體積為10μL，含酶切目的片段的切膠回收產(chǎn)物4μL，pENTR^TM2B（BamHI+XhoI雙酶切）載體1μL，10 × T4 buffer1μL，T4 Ligase 1μL，滅菌雙蒸水3μL，混勻，室溫反應(yīng)2小時，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，加培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)后涂到含100mg/L 卡那霉素的LB平板上過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測和酶切檢測，以驗(yàn)證目的基因片段是否已經(jīng)插入載體片段，入門載體是否構(gòu)建成功。

e、通過LR反應(yīng)得到植物表達(dá)載體：挑選檢測正確的入門克隆與植物表達(dá)載體pK7GW1Wg2 (Destination clone)進(jìn)行LR反應(yīng)，具體反應(yīng)如下：體系與過程如下：

1）連上2B載體的入門克隆(50-150ng )1-7μL + 0.5μL Destination Vector + TE Buffer(up to 8μL)；

2）上述體系混勻，冰浴2min,輕彈2次；

3）加入2μL LR Clonease^TMⅡ enzyme Mix 到上述體系，輕彈，混勻，離心，25℃水浴1h；

4）加入1μL Proteinase K 輕彈，混勻，37℃水浴10min；

通過熱激轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌，加入培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)后涂含100mg/L 壯觀霉素的LB平板上，得到植物表達(dá)載體，挑菌提質(zhì)粒后，以載體質(zhì)粒為模板，用兩對引物（T35SF1/P35SR1、IntronF2/P35SR2）進(jìn)行PCR檢測，用LA taq體系進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系包括：200ng質(zhì)粒DNA，10×LA反應(yīng)緩沖液，10mM dNTP，2U的LA taq DNA Polymerase，加入正反向引物各1μM，PCR反應(yīng)在Mastercycler? pro擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃，5分鐘；94℃，30秒，55℃，30秒，72℃，2分鐘，35個循環(huán)；72℃延伸7分鐘；檢測重組質(zhì)粒的正確性，理論上由T35SF1/P35SR1引物擴(kuò)增的片段大小為1.7 kb，由IntronF2/P35SR2引物擴(kuò)增的片段大小為750bp ，同時滿足兩個條件，則表明表達(dá)載體構(gòu)建成功，將檢測對的質(zhì)粒進(jìn)行測序比對，進(jìn)一步驗(yàn)證；

其中兩對引物（T35SF1/P35SR1、IntronF2/P35SR2）為：

T35SF1：5’-AGGTCACTGGATTTTGGTTTTA-3’

P35SR1：5’-CTATCGTTCAAGATGCCTCTGC-3’

IntronF2：5’-ATTGGTGGCTCAAATCATAGAA-3’

P35SR2：5’-AGGACAGTAGAAAAGGAAGGTG-3’

B、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化：

從-80℃冰箱中取出農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在冰上溶解，并加入重組表達(dá)載體PK7G- NtIPT1 4μL；將混合物分別放入液氮速凍1分鐘，轉(zhuǎn)入37℃水浴5分鐘，再冰浴2分鐘，向混合物中加入1mL LB液體培養(yǎng)基，28℃、220rpm培養(yǎng)3~4小時；培養(yǎng)物涂布于含有壯觀霉素100mg/L和利福平25mg/L的LB固體培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)2~3天，可見含有目的載體的農(nóng)桿菌克??；

C、RNAi載體導(dǎo)入煙草、培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植株：

a、挑取含有目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌克隆，在含有壯觀霉素和利福平的LB平板上劃線，28℃培養(yǎng)2~3天；刮取劃線菌斑接菌于含有壯觀霉素和利福平的MS培養(yǎng)基中，28℃，220rpm震蕩培養(yǎng)，菌液濃度達(dá)到OD=0.5~0.8時進(jìn)行侵染，得到含目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌菌體；將菌體收集到離心管中，6,000rpm離心5分鐘富集菌體，棄上清，再用20ml液體MS培養(yǎng)基重懸菌體，得到含目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌懸浮菌液；

b、將煙草葉片置于500mL廣口瓶中， 加入適量75%乙醇，漂洗1min；倒掉乙醇，加入0.1%的HgCl₂溶液，置搖床上室溫振蕩15~30分鐘；倒掉溶液，用無菌水沖洗6遍；

c、將煙草葉片取出，用滅菌吸水紙洗去表面液體，取無菌葉片用剪刀切成1cm×1cm的小片，將切成小片的煙草葉片分別放入含目標(biāo)載體的無菌MS液體培養(yǎng)基懸浮菌液中，靜置15~20min；取出煙草葉片，用無菌濾紙吸去多余菌液，于加入6-BA 1.0mg/L、NAA 0.1mg/L的MS培養(yǎng)基中25℃暗培養(yǎng)兩天；把煙草葉片轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，切口接觸培養(yǎng)基，于溫室條件下分化培養(yǎng)；分化培養(yǎng)基為加入6-BA 1.0mg/L、NAA 0.1mg/L、Kan 100mg/L、頭孢霉素500mg/L的MS培養(yǎng)基，每2~3周將其轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中，切口處逐漸長出愈傷組織，最后分化出芽；

d、將長至3~5cm的芽切下，轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，生根后的轉(zhuǎn)基因植株由生根培養(yǎng)基中取出，用自來水洗凈培養(yǎng)基，移植于滅菌的營養(yǎng)土中；

e、轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)NPTII基因特異引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，鑒定轉(zhuǎn)基因陽性植株。

C步驟b中所述的0.1%的HgCl₂溶液配制方法為稱取升汞0.1克，用少許酒精溶解，再加水定容至100毫升。

下面以具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明：

實(shí)施例1 ——NtIPT1基因的分離克隆

利用同源基因擬南芥At IPT1序列搜索NCBI煙草EST數(shù)據(jù)庫，得到煙草NtIPT1的基因序列，具體步驟為：利用同源基因擬南芥AtIPT1序列搜索NCBI煙草數(shù)據(jù)庫，得到煙草NtIPT1的序列登錄號XM_016617583.1，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)克隆基因特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到目的產(chǎn)物；對目的產(chǎn)物測序，得到NtIPT1基因序列；其核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示，其中140～1108bp為該基因的編碼區(qū)，包含969bp的開放閱讀框；編碼322個氨基酸，如序列表SEQIDNO.2所示。

提取云煙87根部RNA，抽提使用Trizol試劑盒（Invitrogen,按該試劑盒提供的說明書操作）。

取2μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（TAKARA）試劑盒進(jìn)行基因組DNA去除并反轉(zhuǎn)錄（按試劑盒操作手冊操作）。

將反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA作為模板，用于PCR擴(kuò)增NtIPT1基因全長，并設(shè)計(jì)特性行引物如下：

正向引物：NtIPT1F：5′- AACCTTTTCTTTCTCCAAAACG -3′；

反向引物：NtIPT1R：5′- CAAAACTGGCGATCGATTACG -3′。

PCR反應(yīng)體系為50μL，包括：200ng cDNA，5×Phusion HF反應(yīng)緩沖液，10mM dNTP，2U的Phusion? High-Fidelity DNA Polymerase，上述引物各1μM。PCR反應(yīng)在Mastercycler? pro（Eppendorf，德國）擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃，30秒；98℃，7秒，60℃，30秒，72℃，30秒，30個循環(huán)；72℃延伸7分鐘。

產(chǎn)物經(jīng)1%（g/mL）的瓊脂糖凝膠電泳分離，擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生一條單一PCR條帶，見圖1。用QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN，德國）回收擴(kuò)增條帶，提取步驟參照試劑盒使用說明?；厥占兓腄NA與TOPO載體（Invitrogen ZERO BluntII -TOPO -PCR Cloning kit）連接，按說明書操作。連接產(chǎn)物利用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在含有100mg/L卡那霉素的LB固體平板中篩選陽性克隆，挑取5個克隆測序（大連寶生物工程有限公司）。

測序結(jié)果表明NtIPT1基因的全長為1176bp，其核苷酸序列為SEQ ID NO：1所示，通過測序、比對確定是本發(fā)明需要的目的基因，申請人將該基因命名為NtIPT1。NtIPT1基因包括969bp的開放閱讀框；編碼322個氨基酸。

實(shí)施例2 ——抑制表達(dá)（RNAi）載體構(gòu)建

a、以PCR?-BluntII-TOPO載體為中間載體、PK7GW1Wg2為表達(dá)載體構(gòu)建NtIPT1基因的RNAi 載體，構(gòu)建引物為：

NtIPT1-RNAiF: 5’-GGATCCCGCCGGAAAATCAAGACTGT-3’，

NtIPT1-RNAiR: 5’-CTCGAGACTGCAAGTGAAGCCATGTT-3’，

NtIPT1-RNAiF中GGATCC處為BamH I酶切位點(diǎn)；NtIPT1-RNAiR中CTCGAG處為XhoI酶切位點(diǎn)；

b、以NtIPT1陽性克隆TOPO質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體積為50μL，包括：200ng cDNA，5×Phusion HF反應(yīng)緩沖液，10mM dNTP，2U的Phusion? High-Fidelity DNA Polymerase，加入NtIPT1-RNAiF引物、NtIPT1-RNAiR引物各1μM，PCR反應(yīng)在Mastercycler? pro擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃，30秒；98℃，7秒，55℃，30秒，72℃，30秒，30個循環(huán)；72℃延伸7分鐘；回收和純化PCR產(chǎn)物；

c、回收目的片段產(chǎn)物與TOPO載體連接：通過試劑盒反應(yīng)與TOPO載體連接。連接體系與過程如下： 4μL純化產(chǎn)物+1μL salt solution +1μL PCR?-BluntⅡ-TOPO混勻，25℃，水浴30min。將連好的載體通過熱轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，加培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)后涂到含100mg/L 卡那霉素的LB平板上過夜培養(yǎng)。 長出菌后挑取菌落進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后取2ml菌液提取質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒PCR檢測。篩選陽性克隆，對陽性克隆進(jìn)行測序；

d、入門克隆pENTR^TM2B-NtIPT1RNAi的構(gòu)建：用上步測序?qū)Φ腡OPO質(zhì)粒和pENTR^TM2B空載體做酶切反應(yīng)：BamH I+XhoI雙酶切TOPO質(zhì)粒和pENTR^TM2B-ccdB得到目的基因片段和載體片段pENTR^TM2B，切膠回收后進(jìn)行連接、連接體系：連接反應(yīng)總體積為10μL，含酶切目的片段的切膠回收產(chǎn)物4μL，pENTR^TM2B（BamHI+XhoI雙酶切）載體1μL，10× T4 buffer1μL，T4 Ligase 1μL，滅菌雙蒸水3μL，混勻，室溫反應(yīng)2小時，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，加培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)后涂到含100mg/L 卡那霉素的LB平板上過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測和酶切檢測，以驗(yàn)證目的基因片段是否已經(jīng)插入載體片段，入門載體是否構(gòu)建成功。

e、通過LR反應(yīng)得到植物表達(dá)載體：挑選檢測正確的入門克隆與植物表達(dá)載體pK7GW1Wg2 (Destination clone)進(jìn)行LR反應(yīng)，具體反應(yīng)如下：體系與過程如下：

1）連上2B載體的入門克隆(50-150ng )1-7μL + 0.5μL Destination Vector + TE Buffer(up to 8μL)；

2）上述體系混勻，冰浴2min,輕彈2次；

3）加入2μL LR Clonease^TMⅡ enzyme Mix 到上述體系，輕彈，混勻，離心，25℃水浴1h；

4）加入1μL Proteinase K 輕彈，混勻，37℃水浴10min；

通過熱激轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌，加入培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)后涂含100mg/L 壯觀霉素的LB平板上。得到植物表達(dá)載體，挑菌提質(zhì)粒后，以載體質(zhì)粒為模板，用兩對引物（T35SF1/P35SR1、IntronF2/P35SR2）進(jìn)行PCR檢測，用LA taq體系進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系包括：200ng質(zhì)粒DNA，10×LA反應(yīng)緩沖液，10mM dNTP，2U的LA taq DNA Polymerase，加入正反向引物各1μM，PCR反應(yīng)在Mastercycler? pro擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃，5分鐘；94℃，30秒，55℃，30秒，72℃，2分鐘，35個循環(huán)；72℃延伸7分鐘；檢測重組質(zhì)粒的正確性，理論上由T35SF1/P35SR1引物擴(kuò)增的片段大小為1.7 kb，由IntronF2/P35SR2引物擴(kuò)增的片段大小為750bp ，同時滿足兩個條件，則表明表達(dá)載體構(gòu)建成功，將檢測對的質(zhì)粒進(jìn)行測序比對，進(jìn)一步驗(yàn)證。

其中兩對引物（T35SF1/P35SR1、IntronF2/P35SR2）為：

T35SF1：5’-AGGTCACTGGATTTTGGTTTTA-3’

P35SR1：5’-CTATCGTTCAAGATGCCTCTGC-3’

IntronF2：5’-ATTGGTGGCTCAAATCATAGAA-3’

P35SR2：5’-AGGACAGTAGAAAAGGAAGGTG-3’

實(shí)施例3 ——煙草的遺傳轉(zhuǎn)化

（1）表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

從-80℃冰箱中取出農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在冰上溶解，并加入重組表達(dá)載體PK7G- NtIPT1 4μL；將混合物分別放入液氮速凍1分鐘，轉(zhuǎn)入37℃水浴5分鐘，再冰浴2分鐘，向混合物中加入1mL LB液體培養(yǎng)基，28℃、220rpm培養(yǎng)3~4小時；培養(yǎng)物涂布于含有壯觀霉素100mg/L和利福平25mg/L的LB固體培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)2~3天，可見含有目的載體的農(nóng)桿菌克隆；

（2）煙草轉(zhuǎn)化

a、挑取含有目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌克隆，在含有壯觀霉素和利福平的LB平板上劃線，28℃培養(yǎng)2~3天；刮取劃線菌斑接菌于含有壯觀霉素和利福平的MS培養(yǎng)基中，28℃，220rpm震蕩培養(yǎng)，菌液濃度達(dá)到OD=0.5~0.8時進(jìn)行侵染，得到含目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌菌體；將菌體收集到離心管中，6,000rpm離心5分鐘富集菌體，棄上清，再用20ml液體MS培養(yǎng)基重懸菌體，得到含目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌懸浮菌液；

b、將煙草葉片置于500mL廣口瓶中， 加入適量75%乙醇，漂洗1min；倒掉乙醇，加入0.1%的HgCl₂溶液，置搖床上室溫振蕩15~30分鐘；倒掉溶液，用無菌水沖洗6遍；

c、將煙草葉片取出，用滅菌吸水紙洗去表面液體，取無菌葉片用剪刀切成1cm×1cm的小片，將切成小片的煙草葉片分別放入含目標(biāo)載體的無菌MS液體培養(yǎng)基懸浮菌液中，靜置15~20min；取出煙草葉片，用無菌濾紙吸去多余菌液，于加入6-BA 1.0mg/L、NAA 0.1mg/L的MS培養(yǎng)基中25℃暗培養(yǎng)兩天；把煙草葉片轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，切口接觸培養(yǎng)基，于溫室條件下分化培養(yǎng)；分化培養(yǎng)基為加入6-BA 1.0mg/L、NAA 0.1mg/L、Kan 100mg/L、頭孢霉素500mg/L的MS培養(yǎng)基，每2~3周將其轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中，切口處逐漸長出愈傷組織，最后分化出芽；

d、將長至3~5cm的芽切下，轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，生根后的轉(zhuǎn)基因植株由生根培養(yǎng)基中取出，用自來水洗凈培養(yǎng)基，移植于滅菌的營養(yǎng)土中；

e、轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)NPTII基因特異引物PCR驗(yàn)證擴(kuò)增，鑒定轉(zhuǎn)基因陽性植株。

實(shí)施例4 ——轉(zhuǎn)基因植株打頂試驗(yàn)

轉(zhuǎn)基因植株移栽到一次性花盆后，生長16天后，打頂，測定各腋芽的長度和重量，結(jié)果見圖6、圖7。RNAi植株與空載體對照Vector Control（VC）相比，腋芽長度和重量均降低約50%。上述結(jié)果表明，NtIPT1基因負(fù)責(zé)控制煙草腋芽生長的長度及重量，通過對該基因的遺傳操作，可以降低煙草腋芽的生長，該基因的開發(fā)利用有利于減少煙葉生產(chǎn)中抑芽劑的使用。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院

<120> 一種煙草腋芽生長基因NtIPT1及其克隆方法與應(yīng)用

<130> 2016

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1176

<212> DNA

<213> NtIPT1核苷酸

<400> 1

aaccttttct ttctccaaaa cgcgcttata acaaacacat tgtcaagttg ccgcatttcc 60

atctataagg tacttcccat ccgtacccat tttacgacga acttgtttga gattgaagcg 120

caattggtat cgtcctagta tgattgggat gagaaactct tcactaatgt gcaaacaagt 180

atggccaact ttgcgaaatt tgcctcaaaa ggacaaggtt gtgtttgtga tgggagtcac 240

cggcgccgga aaatcaagac tgtcaataga cttagccact caattcagag gagaaatagt 300

gaactccgac aaaatacaag tgtacaaagg tcttgatatt gccactaaca aaatcacaca 360

agaagaacgt tgtggtgtac cacaccatct cctaggcgta attgatcctt acaaagaatt 420

caccaccaaa aacttctgca acatggcttc acttgcagtt aactctataa ccgaccgcgg 480

taaacttccg atcatcgttg gaggttccaa ttcgtttatc gaggcgcttg tccacgacaa 540

ctctcataat tttcgtacga ggtatgattg ttgtttccta tgggtcgatg tgtccatgaa 600

cgtactaaat tcatttttgt acgaacgagt ggacaaaatg atggagcaag gtatgactga 660

cgaagtaaga agcatgttca atccaaaaaa cacagattat accaaaggca tacgtaaagc 720

aattggcgta ccagaattcg atagttattt tcgagctgaa ttatcaaatt ctgttgacgt 780

ggagacgcgc gagaggctac taaaagaagc tattaatgaa gtgaagatca ataactgtat 840

actagcaagt aagcaactag agaaaataaa gagactcata aatgttaagg gatggaaaat 900

tcaaagatta gatgcaacag aagtttttag gaggaaacag agaaatgcag aggaagaagc 960

cgaggaaatt tggaagaata tggtgatggg acagagcata aagattgtgg gtaaattttt 1020

atgcgaaaat aatcggagca aaatggttta cagaaatgat gtgacagcca ttaagagagc 1080

agcagcgtcg gccatagctc aatattagag caagttgtgc attaatctga agagcttttt 1140

tttgtacctt agtcgcgtaa tcgatcgcca gttttg 1176

<210> 2

<211> 322

<212> PRT

<213> NtIPT1 氨基酸

<400> 2

Met Ile Gly Met Arg Asn Ser Ser Leu Met Cys Lys Gln Val Trp Pro

1 5 10 15

Thr Leu Arg Asn Leu Pro Gln Lys Asp Lys Val Val Phe Val Met Gly

20 25 30

Val Thr Gly Ala Gly Lys Ser Arg Leu Ser Ile Asp Leu Ala Thr Gln

35 40 45

Phe Arg Gly Glu Ile Val Asn Ser Asp Lys Ile Gln Val Tyr Lys Gly

50 55 60

Leu Asp Ile Ala Thr Asn Lys Ile Thr Gln Glu Glu Arg Cys Gly Val

65 70 75 80

Pro His His Leu Leu Gly Val Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Thr Thr

85 90 95

Lys Asn Phe Cys Asn Met Ala Ser Leu Ala Val Asn Ser Ile Thr Asp

100 105 110

Arg Gly Lys Leu Pro Ile Ile Val Gly Gly Ser Asn Ser Phe Ile Glu

115 120 125

Ala Leu Val His Asp Asn Ser His Asn Phe Arg Thr Arg Tyr Asp Cys

130 135 140

Cys Phe Leu Trp Val Asp Val Ser Met Asn Val Leu Asn Ser Phe Leu

145 150 155 160

Tyr Glu Arg Val Asp Lys Met Met Glu Gln Gly Met Thr Asp Glu Val

165 170 175

Arg Ser Met Phe Asn Pro Lys Asn Thr Asp Tyr Thr Lys Gly Ile Arg

180 185 190

Lys Ala Ile Gly Val Pro Glu Phe Asp Ser Tyr Phe Arg Ala Glu Leu

195 200 205

Ser Asn Ser Val Asp Val Glu Thr Arg Glu Arg Leu Leu Lys Glu Ala

210 215 220

Ile Asn Glu Val Lys Ile Asn Asn Cys Ile Leu Ala Ser Lys Gln Leu

225 230 235 240

Glu Lys Ile Lys Arg Leu Ile Asn Val Lys Gly Trp Lys Ile Gln Arg

245 250 255

Leu Asp Ala Thr Glu Val Phe Arg Arg Lys Gln Arg Asn Ala Glu Glu

260 265 270

Glu Ala Glu Glu Ile Trp Lys Asn Met Val Met Gly Gln Ser Ile Lys

275 280 285

Ile Val Gly Lys Phe Leu Cys Glu Asn Asn Arg Ser Lys Met Val Tyr

290 295 300

Arg Asn Asp Val Thr Ala Ile Lys Arg Ala Ala Ala Ser Ala Ile Ala

305 310 315 320

Gln Tyr

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 正向引物

<400> 3

aaccttttct ttctccaaaa cg 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 反向引物

<400> 4

caaaactggc gatcgattac g 21

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> NtIPT1-RNAiF

<400> 5

ggatcccgcc ggaaaatcaa gactgt 26

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> NtIPT1-RNAiR

<400> 6

ctcgagactg caagtgaagc catgtt 26

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> T35SF1

<400> 7

aggtcactgg attttggttt ta 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> P35SR1

<400> 8

ctatcgttca agatgcctct gc 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> IntronF2

<400> 9

attggtggct caaatcatag aa 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> P35SR2

<400> 10

aggacagtag aaaaggaagg tg 22