本發(fā)明涉及一種來(lái)源于肺炎克雷伯氏菌的新型漆酶及其基因、工程菌和制備方法，具體涉及通過(guò)基因工程技術(shù)和分子生物學(xué)手段獲得表達(dá)該新型漆酶的重組表達(dá)菌株，以及該細(xì)菌漆酶蛋白在染料脫色工業(yè)上的應(yīng)用，屬于酶的基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
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漆酶(Laccase，E.C.1.10.3.2)，又稱(chēng)漆酚氧化酶、多銅氧化酶，是一種含銅的多酚氧化酶，它與植物中的抗壞血酸氧化酶、哺乳動(dòng)物的血漿銅藍(lán)蛋白、細(xì)胞色素C氧化酶、膽紅素氧化酶同源，屬于藍(lán)色多銅氧化酶家族的一員。它能夠催化多種酚類(lèi)和非酚類(lèi)化合物氧化，使之生成相應(yīng)的苯醌，同時(shí)伴隨電子的轉(zhuǎn)移，將分子氧還原成水，且反應(yīng)過(guò)程中無(wú)其它副產(chǎn)物生成。

漆酶是一種被公認(rèn)為環(huán)境友好的“綠色酶”，在自然界中分布十分廣泛。漆酶按其來(lái)源可以分為4大類(lèi)：植物漆酶、動(dòng)物漆酶、真菌漆酶和細(xì)菌漆酶。漆酶最早發(fā)現(xiàn)于日本漆樹(shù)的汁液成分中，在隨后的研究中，研究者從多種植物中均發(fā)現(xiàn)漆酶，但是植物漆酶在提取過(guò)程中包含大量的其它氧化酶，使得純化漆酶過(guò)程較為復(fù)雜。后來(lái)又證實(shí)，漆酶除了存在于植物中，還存在于動(dòng)物、真菌和細(xì)菌中。

真菌漆酶主要存在于高等真菌(特別是擔(dān)子菌)中，目前工業(yè)化的商品漆酶主要來(lái)源于真菌，但是，真菌漆酶易受羥基離子的影響，在堿性條件下活性非常低或者幾乎沒(méi)有，熱穩(wěn)定性也較差，且絲狀真菌生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，對(duì)培養(yǎng)基要求較高，在發(fā)酵罐中容易受到高剪切力的損傷，且真菌漆酶需要進(jìn)行翻譯后修飾，只能依靠篩選高產(chǎn)菌株自身表達(dá)或者使用真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組表達(dá)，存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)、成本高、產(chǎn)量低等缺點(diǎn)，這嚴(yán)重影響了真菌漆酶在工業(yè)上的應(yīng)用。

細(xì)菌漆酶包括芽胞桿菌屬的CotA蛋白、海單胞菌的PpoA蛋白、大腸桿菌CueO蛋白等，與真菌漆酶相比，細(xì)菌漆酶可以克服真菌漆酶的上述缺點(diǎn)，并且在堿性條件下具有良好的催化活性和較高的穩(wěn)定性。細(xì)菌漆酶具有自己一些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，如：無(wú)需糖基化修飾、酶的最適pH范圍廣、溫度穩(wěn)定性好、存在Cu²⁺抗性等。這些性質(zhì)正是目前工業(yè)上漆酶應(yīng)用所需要的。因此，細(xì)菌漆酶的研究對(duì)于漆酶應(yīng)用領(lǐng)域的擴(kuò)展具有十分重要的意義。目前，關(guān)于細(xì)菌漆酶的研究很少，更多具有高活力高穩(wěn)定性能力的細(xì)菌漆酶基因有待進(jìn)一步發(fā)掘和研究。

由于漆酶來(lái)源不同，并且不同來(lái)源的漆酶在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)方面存在一定的差別，因此不同來(lái)源的漆酶在其催化特性方面會(huì)表現(xiàn)出一定的差異。漆酶的作用底物及其廣泛，能夠催化氧化包括多酚類(lèi)、二胺、芳胺類(lèi)、羧酸類(lèi)在內(nèi)的250多種有機(jī)物發(fā)生氧化、聚合等反應(yīng)。因其特殊的催化性能和寬泛的作用底物，所以漆酶的應(yīng)用也及其廣泛，包括污染物降解、染料脫色解毒、紙漿和紡織品漂白、口腔保健牙齒美白劑、漂白衣物洗滌劑、食品風(fēng)味改良、飼料營(yíng)養(yǎng)改善、生物電子研發(fā)等。對(duì)于許多應(yīng)用，可以通過(guò)使用介體來(lái)提高漆酶的氧化能力。目前已知的介體包括：HBT(1-羥基苯并三唑)、ABTS(2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽、丁香酸甲酯、NHA(N-羥基乙酰苯胺)、NEIAA(N-乙酰基-N-苯基羥胺)、HBTO(3-羥基1,2,3-苯并三嗪-4(3H)酮)、VIO(紫尿酸)。

枯草芽胞桿菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌?？莶菅堪麠U菌表達(dá)系統(tǒng)具有以下優(yōu)點(diǎn)：1、能夠高效的分泌各種蛋白質(zhì)；2、許多枯草芽胞桿菌在發(fā)酵工業(yè)上的使用已有相當(dāng)長(zhǎng)的歷史，無(wú)致病性，不產(chǎn)生任何內(nèi)毒素；3、芽胞桿菌屬微生物遺傳學(xué)背景研究的十分清楚，并且生長(zhǎng)迅速，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)無(wú)特殊要求等優(yōu)點(diǎn)；4、密碼子偏愛(ài)性不明顯；5、發(fā)酵過(guò)程簡(jiǎn)單，枯草芽胞桿菌屬于好氧菌，無(wú)需厭氧發(fā)酵設(shè)備，發(fā)酵結(jié)束后，簡(jiǎn)單的分離發(fā)酵液和細(xì)菌菌體，即可進(jìn)入目的蛋白的分離、純化回收階段；6、具有抗逆性，可以生產(chǎn)多種耐熱性酶制劑。

畢赤酵母是一種單細(xì)胞低等真核生物，培養(yǎng)條件普通，生長(zhǎng)繁殖速度迅速。畢赤酵母系統(tǒng)用于表達(dá)基因工程產(chǎn)品時(shí)，可以大規(guī)模生產(chǎn)，有效降低了生產(chǎn)成本。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)外源目的蛋白時(shí)具有很多優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的前景，適合工業(yè)化和規(guī)?；a(chǎn)，該表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)主要表現(xiàn)在：1、表達(dá)量高：畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體，是以醇氧化酶基因的啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)的，其外源目的蛋白的表達(dá)量很高，P.pastoris的表達(dá)量比一般表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量(常用表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量一般在毫克級(jí))高10倍甚至100倍。2、穩(wěn)定性高：畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體通過(guò)整合在酵母的染色體上而存在，并且隨染色體的復(fù)制而復(fù)制，不是以質(zhì)粒自我復(fù)制的形式存在，因此重組菌株的穩(wěn)定性很高。3、高分泌表達(dá)：畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體中a因子前導(dǎo)序列是一個(gè)具有很好的分泌效果的分泌信號(hào)序列，能夠通過(guò)一定的途徑使表達(dá)產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外，同時(shí)減輕了宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷，有利于細(xì)胞的持續(xù)生長(zhǎng)。4、目的蛋白翻譯后的加工和修飾：畢赤酵母具有真核生物完整的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，能夠進(jìn)行真核生物蛋白翻譯后的加工修飾過(guò)程(如糖基化、脂酞化、磷酸化、蛋白裂解、折疊以及二硫鍵的形成等)，從而使分泌蛋白的結(jié)構(gòu)更接近于天然蛋白，而且糖基化程度合適，適于臨床使用。5、遺傳背景研究較清楚，能夠通過(guò)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制實(shí)現(xiàn)目的蛋白的高水平表達(dá)。6、易于進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，畢赤酵母屬于單細(xì)胞微生物，具有生產(chǎn)成本低，營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單(酵母的碳源一般為甘油、葡萄糖以及甲醇等)，發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，可進(jìn)行高密度發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)，酵母具有大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)外源蛋白的潛力，而且酵母表達(dá)系統(tǒng)自我分泌的雜蛋白很少，對(duì)于目的蛋白的純化有利。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已成為現(xiàn)代分子生物學(xué)研究最重要的工具和模型，是表達(dá)外源基因較為理想的工具。

在本發(fā)明中，新型漆酶編碼基因來(lái)源于肺炎克雷伯氏菌，它屬于細(xì)菌，對(duì)肺炎克雷伯氏菌基因組中新型漆酶編碼基因進(jìn)行克隆，新型漆酶基因在枯草芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，分別得到枯草芽胞桿菌高穩(wěn)定性漆酶重組菌株和畢赤酵母高穩(wěn)定性漆酶游離表達(dá)重組菌株，重組菌株發(fā)酵后，經(jīng)過(guò)相應(yīng)的處理，可以得到高穩(wěn)定性漆酶催化劑，并且該新型重組漆酶可以對(duì)蒽醌類(lèi)和偶氮類(lèi)染料進(jìn)行脫色。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于克服和避免目前工業(yè)上生產(chǎn)漆酶所存在的不足之處，并提供一種來(lái)源于肺炎克雷伯氏菌的新型細(xì)菌漆酶編碼基因及表達(dá)該新型細(xì)菌漆酶基因的工程菌株。

本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)路線(xiàn)如下：以肺炎克雷伯氏菌的基因組為模板，并根據(jù)已報(bào)道的肺炎克雷伯氏菌漆酶成熟肽基因，分析其保守序列，設(shè)計(jì)本發(fā)明的漆酶成熟肽基因的擴(kuò)增引物P1和P2、P3和P4，其中，上游引物P1和下游引物P2是用來(lái)擴(kuò)增在枯草芽胞桿菌中表達(dá)的目的基因，上、下游引物分別引入限制性酶切位點(diǎn)BamH I、Hind III；上游引物P3和下游引物P4是用來(lái)擴(kuò)增在畢赤酵母GS115中表達(dá)的目的基因，上、下游引物分別引入限制性酶切位點(diǎn)EcoR I、Not I。通過(guò)PCR克隆獲得肺炎克雷伯氏菌的漆酶基因Lac，將其與pBSA43載體和pPIC9K載體分別連接后，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBSA43-Lac和pPIC9K-Lac；轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，獲得重組菌株JM109/pBSA43-Lac和JM109/pPIC9K-Lac。再次將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒pBSA43-Lac和pPIC9K-Lac，分別在枯草芽胞桿菌WB600和畢赤酵母GS115中成功表達(dá)，得到產(chǎn)高穩(wěn)定性新型漆酶的重組菌株，進(jìn)一步通過(guò)發(fā)酵工藝優(yōu)化獲得高產(chǎn)的高穩(wěn)定性新型漆酶。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一為：一種新型細(xì)菌漆酶，所述漆酶來(lái)源于一株經(jīng)發(fā)明人篩選的肺炎克雷伯氏菌，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID No：2所示；

所述漆酶以ABTS為底物測(cè)定新型漆酶酶學(xué)性質(zhì)時(shí)，最適作用溫度為35℃，最適作用pH為4；以DMP為底物測(cè)定新型漆酶酶學(xué)性質(zhì)時(shí)，最適作用溫度為70℃，最適作用pH為8；

同時(shí)，以DMP為底物測(cè)定該新型漆酶的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，結(jié)果表明：該新型細(xì)菌漆酶在pH5～9的范圍內(nèi)穩(wěn)定性良好，具體表現(xiàn)為在pH5、pH6和pH9保溫35h，殘余酶活在60％以上，在pH7和pH8保溫35h，殘余酶活在85％以上；在30～60℃熱穩(wěn)定性好，具體表現(xiàn)為在30～40℃保溫5h，殘余酶活為95％以上，在50～60℃保溫4h，殘余酶活為50％以上；與已報(bào)道的來(lái)源于肺炎克雷伯氏菌的漆酶相比，本專(zhuān)利所要保護(hù)的新型漆酶的pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性更好；

所述漆酶的編碼基因?yàn)長(zhǎng)ac，堿基序列如序列表中的SEQ ID No：1所示；

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二為：將上述基因重新構(gòu)建重組載體，并在枯草芽胞桿菌WB600和畢赤酵母GS115中的高效表達(dá)，得到產(chǎn)高穩(wěn)定性新型漆酶的重組菌株，進(jìn)一步通過(guò)發(fā)酵工藝優(yōu)化獲得高產(chǎn)的高穩(wěn)定性新型漆酶；

用于表達(dá)所述的新型細(xì)菌漆酶的宿主細(xì)胞為枯草芽胞桿菌WB600，表達(dá)載體為pBSA43；

用于表達(dá)所述的新型細(xì)菌漆酶的宿主細(xì)胞為畢赤酵母GS115，表達(dá)載體為pPIC9K；

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)步驟概述如下：

1、一種來(lái)源于肺炎克雷伯氏菌的新型漆酶基因，構(gòu)建表達(dá)該新型漆酶的重組菌株(枯草芽胞桿菌WB600/pBSA43-Lac)及其該新型細(xì)菌漆酶的制備過(guò)程包括如下步驟：

(1)通過(guò)高通量菌種篩選獲得一株能夠產(chǎn)生漆酶的菌株，即肺炎克雷伯氏菌；

(2)以肺炎克雷伯氏菌的基因組為模板，根據(jù)已報(bào)道肺炎克雷伯氏菌漆酶成熟肽基因，分析其保守序列，設(shè)計(jì)本發(fā)明的漆酶成熟肽基因的擴(kuò)增引物P1和P2，通過(guò)PCR克隆獲得肺炎克雷伯氏菌的漆酶基因Lac，將其與大腸桿菌-枯草芽胞桿菌穿梭質(zhì)粒pBSA43連接后，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBSA43-Lac，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，獲得重組菌株JM109/pBSA43-Lac；得到肺炎克雷伯氏菌新型漆酶編碼基因；

(3)將重組質(zhì)粒pBSA43-Lac轉(zhuǎn)化入枯草芽胞桿菌WB600，構(gòu)建獲得重組菌株WB600/pBSA43-Lac；

(4)將重組菌株進(jìn)行發(fā)酵制備高穩(wěn)定性新型細(xì)菌漆酶；

(5)制備高穩(wěn)定性新型漆酶。

2、一種來(lái)源于肺炎克雷伯氏菌的新型漆酶基因，構(gòu)建游離表達(dá)該新型漆酶的重組菌株(畢赤酵母GS115/pPIC9K-Lac)及其該新型細(xì)菌漆酶的制備過(guò)程包括如下步驟：

(1)通過(guò)高通量菌種篩選獲得一株能夠產(chǎn)生漆酶的菌株，即肺炎克雷伯氏菌。

(2)以肺炎克雷伯氏菌的基因組為模板，根據(jù)已報(bào)道肺炎克雷伯氏菌漆酶成熟肽基因，分析其保守序列，設(shè)計(jì)本發(fā)明的漆酶成熟肽基因的擴(kuò)增引物P3和P4，通過(guò)PCR克隆獲得肺炎克雷伯氏菌的漆酶基因Lac，將其與大腸桿菌-畢赤酵母穿梭質(zhì)粒pPIC9K連接后，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-Lac，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，獲得重組菌株JM109/pPIC9K-Lac；得到肺炎克雷伯氏菌新型漆酶編碼基因；

(3)將重組質(zhì)粒pPIC9K-Lac轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115，構(gòu)建獲得重組菌株GS115/pPIC9K-Lac；

(4)將得到的重組菌株經(jīng)遺傳霉素篩選，結(jié)合漆酶的酶活測(cè)定，得到產(chǎn)高穩(wěn)定性漆酶的重組菌株；

(5)將高產(chǎn)菌株進(jìn)行發(fā)酵制備高穩(wěn)定性新型細(xì)菌漆酶；

(6)制備高穩(wěn)定性新型漆酶。

有益效果：

1、本發(fā)明通過(guò)特定的能夠產(chǎn)生漆酶的高通量菌株篩選，獲得一株能夠產(chǎn)生漆酶的細(xì)菌菌株，即肺炎克雷伯氏菌，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得的該菌株的漆酶基因，經(jīng)測(cè)序?yàn)橐欢涡碌膲A基序列。

2、本發(fā)明中通過(guò)枯草芽胞桿菌表達(dá)新型漆酶重組菌株和畢赤酵母游離表達(dá)新型漆酶重組菌株發(fā)酵后制備的新型重組漆酶具有如下的酶學(xué)性質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)：以ABTS為底物測(cè)定新型漆酶酶學(xué)性質(zhì)時(shí)，最適作用溫度為35℃，最適作用pH為4；以DMP為底物測(cè)定新型漆酶酶學(xué)性質(zhì)時(shí)，最適作用溫度為70℃，最適作用pH為8；同時(shí)該新型細(xì)菌漆酶在pH5～9的范圍內(nèi)穩(wěn)定，在30～60℃熱穩(wěn)定性好。

3、該新型細(xì)菌重組漆酶對(duì)偶氮類(lèi)和蒽醌類(lèi)染料具有較好的脫色效果。因此，該重組漆酶在實(shí)際應(yīng)用中具有較大應(yīng)用潛力。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明新型漆酶成熟肽基因的PCR擴(kuò)增電泳圖；

其中：M為DNA Marker，1、2分別為漆酶成熟肽基因Lac；

圖2為本發(fā)明重組質(zhì)粒pBSA43-Lac酶切驗(yàn)證圖；

其中：M為DNA Marker，1為重組質(zhì)粒pBSA43-Lac經(jīng)BamHI單酶切圖，2為重組質(zhì)粒pBSA43-Lac經(jīng)BamHI和Hind III雙酶切圖；

圖3為本發(fā)明重組質(zhì)粒pPIC9K-Lac酶切驗(yàn)證圖；

其中：M為DNA Marker，1為重組質(zhì)粒pPIC9K-Lac經(jīng)EcoR I單酶切圖，2為重組質(zhì)粒pPIC9K-Lac經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容做進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明不只限于這些實(shí)施例，不能以下述實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1：肺炎克雷伯氏菌新型漆酶成熟肽基因的獲得

1、新型漆酶成熟肽基因來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室篩選出的肺炎克雷伯氏菌，提取其基因組DNA，其中肺炎克雷伯氏菌基因組DNA的提取步驟如下：

(1)從甘油管中接種劃線(xiàn)于LB固體平板中，37℃靜置培養(yǎng)12h；

(2)從培養(yǎng)菌體的平板上挑取一單菌落接種于含5mL液體LB培養(yǎng)基中，于220r/min，37℃條件下培養(yǎng)12h；

(3)將菌液分裝到滅菌的1.5mL微量離心管中，12000r/min離心1min收集菌體，棄上清；

(4)將沉淀重懸于200μL預(yù)冷的溶液I中用槍頭反復(fù)吹打混勻，并加入50μL的50mg/mL溶菌酶，37℃水浴1h；

(5)加入20μL的10％SDS以及10μL的蛋白酶K，65℃水浴2-3h；

(6)加入250μL新配的溶液II，蓋緊管口，溫和地將1.5mL的EP管上下翻轉(zhuǎn)6～8次，使EP管中的菌體充分裂解；

(7)加入350μL預(yù)冷的溶液III，立即溫和地將1.5mL的EP管上下翻轉(zhuǎn)6～8次，此時(shí)EP管中會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀；

(8)以12000r/min離心10min，將上清轉(zhuǎn)移到另一EP管中，加等體積的Tris飽和酚/氯仿(1∶1)混合溶液，混合均勻后，12000r/min離心10min，再將上清轉(zhuǎn)移到另一EP管中；

(9)反復(fù)抽提2次，再用等體積氯仿抽提1次，去除痕量苯酚；

(10)加入2倍體積的無(wú)水乙醇，混勻，于-20℃放置30min。12000r/min離心10min收集沉淀；

(11)用70％乙醇洗滌沉淀2～3次，棄去殘液；

(12)空氣中干燥20-30min，用30μL滅菌的ddH2O溶解沉淀；

2、通過(guò)NCBI基因庫(kù)查找，根據(jù)已報(bào)道的肺炎克雷伯氏菌漆酶成熟肽基因，分析其保守序列，設(shè)計(jì)本發(fā)明的漆酶成熟肽編碼基因的擴(kuò)增引物如下：

上游引物P1(SEQ ID NO.3)：5’—CGCGGATCCTCAACGTCGAGACTTCCTCA—3’

下游引物P2(SEQ ID NO.4)：5’—AAAACTGCAGTTAAACCGTGAACCCCAAC—3’

上游引物P3(SEQ ID NO.5)：5’—CCGGAATTCCAACGTCGAGACTTCCTCAA—3’

下游引物P4(SEQ ID NO.6)：5’—ATAAGAATGCGGCCGCTTAAACCGTGAACCCCAAC—3’

其中，上游引物P1和下游引物P2是用來(lái)擴(kuò)增在枯草芽胞桿菌中表達(dá)的目的基因，上、下游引物分別引入限制性酶切位點(diǎn)BamH I、Hind III；上游引物P3和下游引物P4是用來(lái)擴(kuò)增在畢赤酵母GS115中表達(dá)的目的基因，上、下游引物分別引入限制性酶切位點(diǎn)EcoR I、Not I。

擴(kuò)增模板為肺炎克雷伯氏菌基因組DNA，其擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：

擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性10min；95℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min40s反應(yīng)30個(gè)循壞；72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳，得到1600bp的條帶(圖1)，用小量DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，并進(jìn)行雙酶切和純化回收，得到本發(fā)明的肺炎克雷伯氏菌新型漆酶成熟肽編碼基因Lac，見(jiàn)序列1。

實(shí)施例2：枯草芽胞桿菌高穩(wěn)定性新型漆酶重組菌的構(gòu)建

1、表達(dá)載體pBSA43的構(gòu)建

pBSA43是以大腸桿菌-枯草芽胞桿菌穿梭克隆載體pBE2為骨架，克隆入一個(gè)強(qiáng)的芽胞桿菌組成型啟動(dòng)子P43，以及能夠使重組蛋白直接分泌到培養(yǎng)基中果聚糖蔗糖酶信號(hào)序列sacB而獲得。它帶有Amp^r基因，可以在大腸桿菌中利用氨芐青霉素抗性作為篩選標(biāo)記；同時(shí)也具有Km^r基因，可以在枯草芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌中利用卡那霉素抗性作為篩選標(biāo)記。

2、新型漆酶表達(dá)載體pBSA43-Lac的構(gòu)建

將經(jīng)PCR擴(kuò)增并經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切后回收的新型漆酶基因(Lac)與同樣雙酶切的枯草芽胞桿菌表達(dá)載體pBSA43用連接酶進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)Amp抗性篩選，挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，并進(jìn)行單、雙酶切驗(yàn)證和測(cè)序，確定構(gòu)建獲得正確的重組菌株JM109/pBSA43-Lac。

3、重組表達(dá)載體pBSA43-Lac轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌WB600

將1μL(50ng/μL)的pBSA43-Lac重組質(zhì)粒加入到50μL的枯草芽胞桿菌WB600感受態(tài)細(xì)胞中并混勻，之后轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯(1mm)中，冰浴1-1.5min后，電擊一次(25uF，200Ω，4.5-5.0ms)。電擊完畢之后，立即加入1mL復(fù)蘇培養(yǎng)基(LB+0.5mol/L山梨醇+0.38mol/L甘露醇)。37℃搖床震蕩培養(yǎng)3h之后，將復(fù)蘇物涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)12-24h，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并進(jìn)行單、雙酶切驗(yàn)證，確定獲得枯草芽胞桿菌重組菌株WB600/pBSA43-Lac。

實(shí)施例3：畢赤酵母高穩(wěn)定性新型漆酶游離表達(dá)重組菌的構(gòu)建

1、新型漆酶表達(dá)載體pPIC9K-Lac的構(gòu)建

將經(jīng)PCR擴(kuò)增并經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切后回收的新型漆酶基因(Lac)與同樣雙酶切的畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K用連接酶進(jìn)行連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)Amp抗性篩選，挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，經(jīng)37℃搖管培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，并進(jìn)行單、雙酶切初步驗(yàn)證，并將酶切驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為pPIC9K-Lac；將酶切驗(yàn)證正確的陽(yáng)性克隆送至北京華大基因科技股份有限公司測(cè)序，以進(jìn)一步確保目的基因的正確性，最終確定構(gòu)建獲得正確的重組菌株JM109/pPIC9K-Lac。

2、新型漆酶重組菌株的構(gòu)建及新型漆酶高表達(dá)重組菌株的篩選

(1)線(xiàn)性化重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-Lac的制備

重組質(zhì)粒在電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115前，要先將構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-Lac進(jìn)行線(xiàn)性化以提高重組質(zhì)粒在畢赤酵母染色體上的整合效率。每次轉(zhuǎn)化需要線(xiàn)性化質(zhì)粒DNA 15μg，且質(zhì)粒越純，轉(zhuǎn)化效率越高。用SacⅠ和SalⅠ這2種限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行線(xiàn)性化酶切。酶切完之后，用小量DNA回收試劑盒回收線(xiàn)性化酶切產(chǎn)物。

(2)線(xiàn)性化質(zhì)粒pPIC9K-Lac電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115、陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的鑒定及新型漆酶高表達(dá)菌株的篩選

a、將經(jīng)線(xiàn)性化回收的重組質(zhì)粒DNA(15μg)加入到提前制備好的100μL畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴20min后，將混勻的反應(yīng)液加入到預(yù)先冰浴的電轉(zhuǎn)杯中。

b、冰浴裝有轉(zhuǎn)化液的轉(zhuǎn)化杯5min，根據(jù)電轉(zhuǎn)裝置推薦的參數(shù)(電壓2500V，電擊時(shí)間5ms)，進(jìn)行畢赤酵母電轉(zhuǎn)化。

c、脈沖后，立即向電轉(zhuǎn)杯中加入1mL預(yù)冷的1mol/L的山梨醇溶液，把轉(zhuǎn)化液再轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5mL的離心管中。

d、30℃靜置培養(yǎng)1-2h，吸取畢赤酵母GS115電轉(zhuǎn)液200μL涂布在MD培養(yǎng)基平板上。

e、30℃靜置培養(yǎng)直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

f、挑取轉(zhuǎn)化子單菌落溶解在10μL去離子水中，取2μL菌液，加入Lyticase破壁酶，30℃反應(yīng)10min，反應(yīng)液立即放入-80℃冰箱冷凍10min，使酵母細(xì)胞壁充分裂解，釋放的基因組作為模板進(jìn)行PCR。以轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒pPIC9K的畢赤酵母GS115/pPIC9K作為對(duì)照，確定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

g、在確定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的基礎(chǔ)上，先用含不同濃度遺傳霉素的抗性平板篩選高遺傳霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，然后分別測(cè)定這些高遺傳霉素抗性的轉(zhuǎn)化子的新型漆酶的酶活，以得到新型漆酶的高產(chǎn)菌株GS115/pPIC9K-Lac。

實(shí)施例4：漆酶酶活的測(cè)定

不同來(lái)源(植物、動(dòng)物、真菌、細(xì)菌)的漆酶與底物反應(yīng)的親和力不同，酶活測(cè)定方法中所用的反應(yīng)底物、反應(yīng)條件以及酶活單位定義對(duì)漆酶活性的測(cè)定結(jié)果有很大影響。對(duì)苯二胺、愈創(chuàng)木酚、鄰聯(lián)甲苯胺、鄰苯二酚、漆酚、丁香醛連氮、2,6-二甲氧基苯酚、2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽都可以用作漆酶活力測(cè)定的底物。其中，鄰聯(lián)甲苯胺水溶性較差；以愈創(chuàng)木酚為底物時(shí)，反應(yīng)非常穩(wěn)定，但是反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)、測(cè)得的漆酶酶活值偏低，已較少采用；當(dāng)以丁香醛連氮為底物測(cè)定漆酶酶活時(shí)，漆酶活性值雖然較高，但當(dāng)?shù)孜锖兔敢河昧枯^高時(shí)反應(yīng)不穩(wěn)定，若采取減少底物和酶液用量的方法，可以較大程度地克服反應(yīng)不易終止的缺陷。以ABTS為底物測(cè)定漆酶的酶活時(shí)，具有反應(yīng)靈敏、穩(wěn)定性好、重現(xiàn)行好等特點(diǎn)。

測(cè)定漆酶酶活的方法具有HPLC法、測(cè)氧法、分光光度法、級(jí)譜法等。以ABTS為底物測(cè)定漆酶酶活是目前國(guó)外最為常見(jiàn)的方法之一。它具有以下優(yōu)缺點(diǎn)：(1)ABTS易溶于水，在室溫下放置6個(gè)月仍較穩(wěn)定。(2)其反應(yīng)只有一步，即從ABTS到它的陽(yáng)離子自由基。ABTS的陽(yáng)離子自由基在水溶液中呈淺藍(lán)綠色，且比較穩(wěn)定，通常在幾個(gè)小時(shí)或幾天之內(nèi)是穩(wěn)定的。(3)在漆酶的作用下，ABTS有色溶液的摩爾吸光系數(shù)較高，說(shuō)明以其為底物測(cè)定的靈敏度較高。(4)到目前為止，還未曾有報(bào)道稱(chēng)ABTS有致癌作用、誘變作用或是強(qiáng)烈的毒性。(5)以ABTS為底物進(jìn)行漆酶的定量分析，通常在420nm下測(cè)定3min內(nèi)吸光度的變化。用這種底物進(jìn)行定量分析有一個(gè)缺點(diǎn)，即ABTS陽(yáng)離子自由基溶液的吸光度容易受到溶液中未反應(yīng)的ABTS濃度的影響。這就產(chǎn)生了一個(gè)問(wèn)題：420nm下的摩爾吸光系數(shù)36000L/(mol·cm)是在純ABTS陽(yáng)離子自由基的條件下求得的，而在實(shí)際測(cè)定反應(yīng)中，ABTS是過(guò)量的，這就導(dǎo)致人們低估了酶活。這種影響不能忽視，因?yàn)榉磻?yīng)終止時(shí)，溶液中至少還要有1mmol/L的ABTS。盡管用ABTS為底物存在上述問(wèn)題，但是它仍是漆酶酶活測(cè)定的最佳底物之一。

1、以ABTS(2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽)為底物測(cè)定漆酶的酶活

(1)以ABTS為底物測(cè)定漆酶酶活的原理

漆酶分解ABTS變?yōu)锳BTS陽(yáng)離子自由基，然而在420nm處ABTS陽(yáng)離子自由基的吸光系數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于底物ABTS。所以，隨著漆酶和底物ABTS的不斷反應(yīng)，ABTS自由基的濃度逐漸增大，其吸光度值也逐漸增大。

酶活的定義：在一定的條件下，每分鐘氧化1μmol的ABTS所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位。

(2)以ABTS為底物測(cè)定漆酶酶活的方法及步驟

a、取200μL的含4mmol/L Cu²⁺的0.1mol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH＝2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8)或200μL的含4mmol/LCu²⁺的0.05mol/L的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH＝8.5、9、9.5、10、10.5、11)，于96孔板中，20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90℃保溫1min。

b、加入10μL的稀釋適當(dāng)倍數(shù)的酶液，再加入30μL的底物(50mmol/L的ABTS)，混勻，記錄反應(yīng)初始的OD值和反應(yīng)3分鐘的OD值。

2、以2,6-二甲氧基苯酚(2,6-dimethoxyphenol,DMP)為底物測(cè)定漆酶酶活

(1)以DMP為底物測(cè)定漆酶酶活的原理

漆酶能將DMP氧化為3,5,3’,5’-四甲氧基二苯基醌，該產(chǎn)物在468nm處有最大吸收峰，其摩爾吸光系數(shù)49.6mM^-1cm^-1，在一定濃度范圍內(nèi)該產(chǎn)物的濃度與其吸光度值成線(xiàn)性關(guān)系，通過(guò)測(cè)吸光度的變化來(lái)測(cè)定計(jì)算產(chǎn)物的生成速率。

酶活的定義：在一定的條件下，每分鐘氧化1μmol的DMP所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位。

(2)以DMP為底物測(cè)定漆酶酶活的方法及步驟

a、取200μL的含4mmol/L Cu²⁺的0.1mol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH＝2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8)或200μL的含4mmol/LCu²⁺的0.05mol/L的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH＝8.5、9、9.5、10、10.5、11)，于96孔板中，20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90℃保溫1min。

b、加入10μL的稀釋適當(dāng)倍數(shù)的酶液，再加入30μL的底物(8mmol/L的DMP)，混勻，記錄反應(yīng)初始的OD值和反應(yīng)3分鐘的OD值。

3、酶活力計(jì)算

酶活力

式中：△OD代表從反應(yīng)開(kāi)始到結(jié)束，吸光度的變化量。

V₁代表反應(yīng)體系的總體積。

△t代表從反應(yīng)開(kāi)始到結(jié)束，所用時(shí)間。

V₂代表在反應(yīng)體系中，酶液的體積。

ε代表以ABTS為底物時(shí)，其產(chǎn)物在420nm處摩爾吸光系數(shù)36mM^-1cm^-1。

ε代表以DMP為底物時(shí)，其產(chǎn)物在468nm處摩爾吸光系數(shù)49.6mM^-1cm^-1。

d代表吸光杯的內(nèi)徑或光程厚度(cm)。

通過(guò)上述方法測(cè)定新型漆酶的酶學(xué)性質(zhì)，該新型漆酶酶學(xué)性質(zhì)如下：

以ABTS為底物測(cè)定新型漆酶酶學(xué)性質(zhì)時(shí)，最適作用溫度為35℃，最適作用pH為4；以DMP為底物測(cè)定新型漆酶酶學(xué)性質(zhì)時(shí)，最適作用溫度為70℃，最適作用pH為8；

以DMP為底物測(cè)定該新型漆酶的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，結(jié)果表明：該新型細(xì)菌漆酶在pH5～9的范圍內(nèi)穩(wěn)定性良好，具體表現(xiàn)為在pH5、pH6和pH9保溫35h，在pH8、70℃下測(cè)定殘余酶活在60％以上，在pH7和pH8保溫35h，在pH8、70℃下測(cè)定殘余酶活在85％以上；

在30～60℃熱穩(wěn)定性好，具體表現(xiàn)為在30～40℃保溫5h，在pH8、70℃下測(cè)定殘余酶活為95％以上，在50～60℃保溫4h，在pH8、70℃下測(cè)定殘余酶活為50％以上；與已報(bào)道的來(lái)源于肺炎克雷伯氏菌的漆酶相比，本專(zhuān)利所要保護(hù)的新型漆酶的pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性更好。

實(shí)施例5：新型漆酶在枯草芽胞桿菌重組菌株中的表達(dá)及制備

將枯草芽胞桿菌重組菌株WB600/pBSA43-Lac接種于5mL的LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素，50μg/mL)中，37℃，220r/min培養(yǎng)過(guò)夜，按照2％接種量轉(zhuǎn)接于50mL新鮮LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)以37℃，220r/min培養(yǎng)48h，即可制備獲得高穩(wěn)定性新型漆酶粗酶液，以ABTS為底物測(cè)定新型漆酶粗酶液酶活力(pH4、35℃條件下)，枯草芽胞桿菌表達(dá)新型漆酶重組菌株發(fā)酵后漆酶酶活可達(dá)到16.8U/mL，以DMP為底物測(cè)定新型漆酶粗酶液酶活力(pH8、70℃條件下)，枯草芽胞桿菌表達(dá)新型漆酶重組菌株發(fā)酵后漆酶酶活可到19.7U/mL；然后采用分級(jí)鹽析法沉淀新型漆酶，收集蛋白質(zhì)沉淀，溶解后，透析除鹽，再經(jīng)離子交換層析、凝膠層析后，冷凍干燥制得新型漆酶純酶酶粉。

實(shí)施例7：新型漆酶在畢赤酵母游離表達(dá)重組菌株中的表達(dá)及制備

將培養(yǎng)于YPD固體平板上的畢赤酵母游離表達(dá)新型漆酶重組菌GS115/pPIC9K-Lac接種至YPD液體培養(yǎng)基中，30℃，220r/min培養(yǎng)24h。以2％的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮BMGY培養(yǎng)基中，繼續(xù)以30℃，220r/min培養(yǎng)24h，然后以6000rpm/min離心10min收集菌體，將菌體轉(zhuǎn)接到BMMY培養(yǎng)基中。再以30℃，220r/min培養(yǎng)，并每隔12h補(bǔ)加一次甲醇，使其終濃度保持在0.5％V/V，培養(yǎng)120h后可得到新型漆酶的粗酶液，以ABTS為底物測(cè)定新型漆酶粗酶液酶活力(pH4、35℃條件下)，畢赤酵母游離表達(dá)新型漆酶重組菌株發(fā)酵后漆酶酶活可達(dá)到15.3U/mL，以DMP為底物測(cè)定新型漆酶粗酶液酶活力(pH8、70℃條件下)，畢赤酵母游離表達(dá)新型漆酶重組菌株發(fā)酵后漆酶酶活可達(dá)到18.6U/mL；然后采用分級(jí)鹽析法沉淀新型漆酶，收集蛋白質(zhì)沉淀，溶解后，透析除鹽，再經(jīng)離子交換層析、凝膠層析后，冷凍干燥制得新型漆酶純酶酶粉。

實(shí)施例8：新型漆酶對(duì)染料的脫色處理及脫色率的計(jì)算

利用新型漆酶酶液對(duì)蒽醌和偶氮染料進(jìn)行脫色處理，需要考慮催化反應(yīng)體系中：反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH值、染料種類(lèi)及濃度、介體種類(lèi)及濃度、酶液用量、脫色時(shí)間等因素。本研究中使用的染料包括：活性艷藍(lán)X-BR、活性艷藍(lán)K-GR、活性艷藍(lán)KN-R、活性深藍(lán)M-2GE、剛果紅、棉藍(lán)、孔雀石綠、偶氮熒光桃紅、溴酚藍(lán)、酸性媒介黑PV。

(1)新型漆酶對(duì)染料脫色的方法及步驟

漆酶催化染料脫色的處理采用300μL的反應(yīng)體系：

a、取275μL的含4mmol/L Cu²⁺的0.1mol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH＝4)或者含4mmol/L Cu²⁺的0.05mol/L的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH＝8)，于96孔板中，70℃保溫1min。

b、加入15μL的濃度為2000mg/L的上述染料。

c、再加入10μL的稀釋適當(dāng)倍數(shù)的漆酶酶液(對(duì)應(yīng)酶活力為0.05U/mL)(或者在相同實(shí)驗(yàn)條件下，加入等量的100℃滅活15min的酶液作為空白對(duì)照)，測(cè)其吸光度A₀。

d、于70℃條件下脫色60min，測(cè)定其吸光度為A₁。

以上每個(gè)脫色處理均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

(2)脫色率的計(jì)算：

將得到的兩株重組菌發(fā)酵后，利用制備的新型漆酶酶粉，按照上述脫色步驟，對(duì)上述染料進(jìn)行脫色處理，60min脫色率都達(dá)到了85％以上。