本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；具體說(shuō)來(lái)，本發(fā)明確立了一種流感病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，用于表達(dá)外源蛋白，可作為單價(jià)苗或二價(jià)疫苗使用，在生產(chǎn)上有較大的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。

背景技術(shù)：

禽流感是由禽流感病毒引起的一種禽類(lèi)傳染病。禽流感病毒根據(jù)血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的不同，可分為16個(gè)HA亞型和9個(gè)NA亞型。高致病性禽流感是由某些H5或H7亞型禽流感病毒引起的嚴(yán)重威脅禽類(lèi)的烈性傳染病。

2003年以來(lái)，H5亞型高致病性禽流感一直在包括中國(guó)在內(nèi)的多個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，疫苗仍然是防控該病的重要手段。2005年，我國(guó)開(kāi)始實(shí)施針對(duì)禽流感的大規(guī)模強(qiáng)制性免疫政策，并取得了顯著成效。隨著病毒的不斷變異，疫苗也從Re-1更新到目前的Re-6、Re-7、Re-8。我們國(guó)家的這些禽流感疫苗都是使用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的，將母本病毒PR8的六個(gè)內(nèi)部基因（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）和流行毒的兩個(gè)外部基因（HA和NA）進(jìn)行重組，獲得重組病毒用于疫苗的生產(chǎn)。目前市場(chǎng)上使用的是Re-6+Re-7+Re-8三價(jià)苗或Re-6+Re-8二價(jià)苗。流感病毒有八個(gè)基因片段，NS基因是最小的片段，可以表達(dá)兩種蛋白：NS1和NEP。其中，NS1基因可以容許外源基因的插入，可作為基因操作的靶基因?？谔阋卟《荆‵MDV）的2A蛋白和豬捷申病毒1型（PTV-1）的2A蛋白具有自裂解功能，可以將表達(dá)的目的蛋白裂解成完整的個(gè)體。本專(zhuān)利利用NS1基因和2A蛋白的這些特性，提供了一種構(gòu)建流感病毒表達(dá)載體的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明研究建立了一種構(gòu)建流感病毒表達(dá)載體的方法。NS基因全長(zhǎng)890bp，其中，nt27-719編碼NS1蛋白（230aa），nt27-56和nt529-864表達(dá)NEP蛋白（121aa）。首先利用PCR或基因合成的方法，將口蹄疫病毒的2A蛋白（羧基端20aa）基因、目的蛋白基因（不含終止密碼子）、豬捷申病毒1型的2A蛋白（羧基端20aa）基因、nt27-56四者串聯(lián)，然后插入到NS基因的第nt246和nt529之間（替換nt246-528），這樣可以表達(dá)出NS1蛋白的N端73aa、完整的目的蛋白和完整的NS2蛋白。然后，將重組的NS基因插入到雙向表達(dá)載體中，與表達(dá)PR8病毒的其他五個(gè)內(nèi)部基因和任一病毒的HA和NA基因共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，利用反向遺傳技術(shù)獲得重組病毒。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例，說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于這個(gè)實(shí)施例。

本實(shí)施例利用基因合成技術(shù)，人工合成口蹄疫病毒的2A蛋白（羧基端20aa）、綠色熒光蛋白（GFP，不含終止密碼子）、豬捷申病毒1型的2A蛋白（羧基端20aa）、nt27-56四者串聯(lián)基因，然后與NS基因的nt1-245和nt529-890片段進(jìn)行重疊延伸PCR，將該片段插入到NS基因的第nt246和nt529之間，獲得NS基因與外源基因的重組體。然后，將該基因進(jìn)行Esp3I酶切，克隆到雙向表達(dá)載體中。然后與表達(dá)PR8病毒的其他五個(gè)內(nèi)部基因和PR8病毒的HA和NA基因共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，72h后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞懸液接種10日齡SPF雞胚，獲得重組病毒。將重組病毒接種MDCK細(xì)胞，48h后通過(guò)熒光顯微鏡可以觀察到有綠色熒光蛋白表達(dá)，同時(shí)重組病毒能凝集雞的紅細(xì)胞，說(shuō)明重組病毒拯救成功，不僅表達(dá)HA蛋白，還能表達(dá)外源蛋白（GFP）。將該病毒免疫動(dòng)物，不僅產(chǎn)生針對(duì)HA蛋白的抗體，還產(chǎn)生針對(duì)GFP蛋白的抗體。