本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種重組腺病毒的生產(chǎn)方法，尤其涉及一種WAVE無血清培養(yǎng)懸浮細(xì)胞制備重組腺病毒的方法。
背景技術(shù)：
：腺病毒(Adenovirus，Adv)載體是基因治療中最有前途的基因轉(zhuǎn)移載體之一。其生物學(xué)特性得到廣泛研究。Adv有一個中等大小的基因組，其大小平均36kb，適合于容納大片段基因，與反轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，腺病毒載體能有效地將外源基因轉(zhuǎn)移到各種靶細(xì)胞或組織中。腺病毒載體容易構(gòu)建和操作，容易制得高滴度病毒載體，在細(xì)胞培養(yǎng)物中重組病毒滴度可達(dá)1.0×1011IU/mL。宿主范圍廣，感染性強(qiáng)，可經(jīng)不同途徑進(jìn)入不同組織，能感染分化后的非分裂期細(xì)胞。在Adv生活周期中，其基因不整合到宿主細(xì)胞中，無插入突變激活癌基因的危險，外源基因能游離地表達(dá)。Adv制成疫苗臨床應(yīng)用表明，采用Adv進(jìn)行體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移是安全的。目前，針對重組腺病毒的中試級生產(chǎn)中，多采用細(xì)胞工廠或細(xì)胞罐結(jié)合片狀載體或微載體的方式進(jìn)行病毒包裝細(xì)胞的培養(yǎng)，采用這些方式培養(yǎng)的細(xì)胞多為293系列等貼壁細(xì)胞，與懸浮培養(yǎng)法相比，貼壁細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)困難，培養(yǎng)過程不能有效監(jiān)測細(xì)胞生長，占地面積大，投資大。此外貼壁細(xì)胞培養(yǎng)時需要使用血清培養(yǎng)，而懸浮細(xì)胞在培養(yǎng)過程可以采用無血清培養(yǎng)。有研究結(jié)果表明，細(xì)胞培養(yǎng)中使用牛血清存在污染外源病毒和致病因子的風(fēng)險，而且不同批次牛血清間的生物活性和因子的不一致，導(dǎo)致產(chǎn)品和實驗結(jié)果的重現(xiàn)性差，制品中殘留的牛血清易引起接種者對血清的過敏反應(yīng)。而無血清培養(yǎng)過程中不使用牛血清，能減少血清帶來的不利因素，使細(xì)胞培養(yǎng)的條件更穩(wěn)定，可簡化純化和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序，避免血清污染造成的危害。隨著人們對基于細(xì)胞培養(yǎng)制備的生物制品的產(chǎn)業(yè)化需求越來越高，對此類生物制品的質(zhì)量要求也越來越嚴(yán)格，能確保批次間質(zhì)量穩(wěn)定的無血清懸浮細(xì)胞培養(yǎng)勢必成為細(xì)胞培養(yǎng)和病毒擴(kuò)增領(lǐng)域的一大趨勢。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對以上技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種WAVE(波浪式生物反應(yīng)器)無血清培養(yǎng)懸浮細(xì)胞制備重組腺病毒的方法，解決了目前中試過程中采用血清培養(yǎng)貼壁細(xì)胞制備重組腺病毒所存在的技術(shù)缺陷和產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性差的問題，也為進(jìn)一步生產(chǎn)工藝的放大提供了較為直接的理論和可行性數(shù)據(jù)支持。對此，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種WAVE無血清培養(yǎng)懸浮細(xì)胞制備重組腺病毒的方法，其特征在于：其包括以下步驟：步驟S1：確認(rèn)WAVE設(shè)備運(yùn)行正常以及細(xì)胞袋無菌情況正常后，取懸浮細(xì)胞種子液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞袋中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞袋中細(xì)胞初始密度為3-5×105個細(xì)胞/mL；設(shè)定培養(yǎng)參數(shù)為：溫度37℃±1、二氧化碳濃度5％、通氣量0.2Lpm；在培養(yǎng)過程，根據(jù)細(xì)胞密度逐級調(diào)整反應(yīng)器搖擺速度和角度；其中，所述懸浮系細(xì)胞包括HER096、其他適應(yīng)無血清馴化后的適用于制備重組腺病毒的懸浮系細(xì)胞中的任意一種，如HEK293懸浮細(xì)胞(HEK293-F)。步驟S2：步驟S1中進(jìn)行灌注培養(yǎng)后，使用新鮮的培養(yǎng)基逐步稀釋培養(yǎng)袋中的培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到4-6×106個細(xì)胞/ml時，計算細(xì)胞袋中總的細(xì)胞數(shù)量，調(diào)整病毒種子液中病毒顆粒數(shù)，按照MOI(VP/cell)＝100:1～300:1接種重組腺病毒，染毒2-3h后，啟動灌注程序，進(jìn)行病毒擴(kuò)增，灌注速度5-10L/d，進(jìn)行病毒擴(kuò)增，調(diào)整反應(yīng)器搖擺速度為15-30rpm，，搖擺角度為6-12°，病毒擴(kuò)增30-48h后，離心收集細(xì)胞，預(yù)處理后進(jìn)行純化；步驟S3：先將步驟S2中收集的細(xì)胞進(jìn)行純化預(yù)處理，得到病毒純化預(yù)處理樣品，然后將病毒純化預(yù)處理樣品依次進(jìn)行陰離子交換色譜層析和分子篩層析收集得到腺病毒。優(yōu)選的，所述純化預(yù)處理采用反復(fù)凍融法、超聲破碎法或高壓破碎法。進(jìn)一步優(yōu)選的，采用反復(fù)凍融法對進(jìn)行純化預(yù)處理，包括以下步驟：將收集的細(xì)胞加入病毒保存液重懸，分裝細(xì)胞懸液，于-80℃和37℃反復(fù)凍融三次得到細(xì)胞勻漿；然后向細(xì)胞勻漿中加入核酸水解酶，充分混勻，在37℃進(jìn)行處理后，于轉(zhuǎn)速6000×g、4℃條件下離心20min，收集上清；向收獲的上清液中加入緩沖液AB液進(jìn)行稀釋，得到病毒純化預(yù)處理樣品。進(jìn)一步優(yōu)選的，采用高壓破碎進(jìn)行純化預(yù)處理，包括以下步驟：將收集的細(xì)胞加入病毒保存液重懸，用高壓破碎儀，采用200-1000bar的高壓壓力，優(yōu)選400-800bar的高壓壓力對細(xì)胞進(jìn)行破碎處理；然后向細(xì)胞勻漿中加入核酸水解酶，充分混勻，在37℃進(jìn)行處理后，于轉(zhuǎn)速6000×g、4℃條件下離心20min，收集上清；向收獲的上清液中加入緩沖液AB液進(jìn)行稀釋，得到病毒純化預(yù)處理樣品；然后將病毒純化預(yù)處理樣品依次進(jìn)行陰離子交換色譜層析和分子篩層析收集得到腺病毒。其中，核酸水解酶用以去除樣品中DNA和RNA。緩沖液AB液是離子層析時的流動相。上述本技術(shù)方案按照步驟S1～步驟S3分別為細(xì)胞培養(yǎng)、病毒擴(kuò)增和病毒純化三部分。本技術(shù)方案與貼壁細(xì)胞培養(yǎng)受限于載體表面積不同，在懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)中，細(xì)胞的生長受限于培養(yǎng)過程中的細(xì)胞密度，因此在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過程中對細(xì)胞密度進(jìn)行監(jiān)測，同時根據(jù)培養(yǎng)過程中細(xì)胞密度的變化對生物反應(yīng)器的搖擺速度和角度進(jìn)行調(diào)整，即可以實現(xiàn)高密度細(xì)胞培養(yǎng)的順利進(jìn)行。采用上述技術(shù)方案，擺脫了現(xiàn)有技術(shù)通常采用貼壁細(xì)胞培養(yǎng)制備重組腺病毒的傳統(tǒng)做法，而且現(xiàn)有技術(shù)在采用貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的中試化制備病毒工藝中，常采用生物反應(yīng)器微載體或片狀載體結(jié)合的方法，在這種類型的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)過程中，比表面積和可獲得的細(xì)胞濃度較小，細(xì)胞易受攪拌、珠間碰撞、流動剪切力等動力學(xué)因素的破壞，此類載體在某種程度上阻礙了氧等營養(yǎng)成分的傳遞和病毒對細(xì)胞的感染，而且這類載體也較容易受代謝廢物積累的影響。上述兩種載體均存在吸附血清、易于變形且僅可一次性使用、培養(yǎng)后的分離過程損失細(xì)胞等缺點(diǎn)。采用懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，并采用WAVE反應(yīng)器，解決了目前中試過程中采用血清培養(yǎng)貼壁細(xì)胞制備重組腺病毒所存在的技術(shù)缺陷和產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性差的問題，也為生產(chǎn)工藝的放大工藝的研發(fā)提供了較為直接的理論和可行性數(shù)據(jù)支持。經(jīng)過實踐發(fā)現(xiàn)，采用懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時，在高密度細(xì)胞條件下進(jìn)行病毒擴(kuò)增，病毒接種量和擴(kuò)增時間對病毒的單細(xì)胞產(chǎn)量影響很大，因此優(yōu)化病毒接種量和病毒擴(kuò)增時間，可以提高單細(xì)胞病毒產(chǎn)量，同時，優(yōu)化純化工藝，以提高病毒回收率。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟S1中，在細(xì)胞培養(yǎng)的初始階段，反應(yīng)器的搖擺速度為10-30rpm，搖擺角度為4-8°；隨著細(xì)胞培養(yǎng)的進(jìn)行，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到約1-2×106個細(xì)胞/ml時，調(diào)整反應(yīng)器的搖擺速度和角度，同時開始進(jìn)行灌注培養(yǎng)，灌注速度為5-10L/d，此階段，反應(yīng)器的搖擺速度為15-30rpm，搖擺角度為5-10°。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟S1中，在細(xì)胞培養(yǎng)的初始階段，反應(yīng)器的搖擺速度為15-25rpm，搖擺角度為5-7°；在進(jìn)行灌注培養(yǎng)時，反應(yīng)器的搖擺速度為20-25rpm，搖擺角度為6-8°。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟S1中，在WAVE進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)前，先預(yù)運(yùn)行WAVE生物反應(yīng)器過夜，檢查設(shè)備運(yùn)行及細(xì)胞袋無菌情況，設(shè)置CO2濃度5％，溫度37±1℃，搖動速度15rpm，轉(zhuǎn)動角度5°～8°。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟S2中，進(jìn)行病毒擴(kuò)增時，所述反應(yīng)器搖擺速度為15-30rpm，搖擺角度為6-12°。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟S2中，進(jìn)行病毒擴(kuò)增時，所述反應(yīng)器搖擺速度為20-25rpm，搖擺角度為7-10°。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟S3中，在進(jìn)行所述陰離子交換色譜層析中，對色譜柱先進(jìn)行預(yù)處理，然后用病毒純化預(yù)處理樣品上樣，上樣量為5×1013-1.5×1015VP，上樣流速20-50mL/min；上樣后梯度洗脫，洗脫流速30-70mL/min；腺病毒特征峰出現(xiàn)后收集第一次層析的樣品，然后用于下一步純化。優(yōu)選的，其中洗脫過程中，洗脫梯度為30％B液，2-4CV，30-60％B液，4-6CV，100％B液，1-2CV。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述對色譜柱先進(jìn)行預(yù)處理包括以下步驟：依次以1-2倍CV的0.5MNaOH洗柱，1-2倍CV的注射用水、以及1-2倍CV的BB液分別沖洗色譜柱，最后，用2-4倍CV的AB液平衡色譜柱。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述色譜柱中采用的層析填料為Source30Q。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述色譜柱中采用的層析填料為QSepharoseXL。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟S3中，在進(jìn)行所述分子篩層析中，以2-4倍CV的病毒保存液平衡分子篩層析柱；用經(jīng)陰離子層析純化后的樣品上樣，上樣體積2％-20％CV，流速20-30mL/min；以病毒保存液洗脫，洗脫流速為20-30mL/min，腺病毒特征峰出現(xiàn)后開始收集腺病毒樣品；所述分子篩層析柱的填料為Sepharose4FastFlow。優(yōu)選的，所述WAVE反應(yīng)器為美國GE公司的WAVE生物反應(yīng)器系統(tǒng)20/50，是為實驗室規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)、工藝開發(fā)和生產(chǎn)而設(shè)計的通用型生物反應(yīng)器系統(tǒng)，控制更加可靠。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明的技術(shù)方案利用WAVE工藝無血清培養(yǎng)懸浮細(xì)胞制備重組腺病毒，解決了目前中試過程中采用血清培養(yǎng)貼壁細(xì)胞制備重組腺病毒所存在的技術(shù)缺陷和產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性差的問題。采用培養(yǎng)貼壁細(xì)胞制備重組腺病毒一方面產(chǎn)量受基質(zhì)表面積的限制，以及需要采用胰酶消化分離細(xì)胞，增加后續(xù)純化成本，另一方面，需要使用牛血清，細(xì)胞培養(yǎng)中使用牛血清存在污染外源病毒和致病因子的風(fēng)險，而且不同批次牛血清間的生物活性和因子的不一致，導(dǎo)致產(chǎn)品和實驗結(jié)果的重現(xiàn)性差，制品中殘留的牛血清易引起接種者對血清的過敏反應(yīng)。采用細(xì)胞工廠或瓶皿等貼壁培養(yǎng)方式進(jìn)行中試生產(chǎn)，所需器具很多，占用空間大，每個器具之間存在操作以及細(xì)胞生長等差異，在繼續(xù)擴(kuò)大工藝的過程中采用這種方法既不現(xiàn)實，也不能滿足臨床研究中對病毒樣品質(zhì)和量的需求，而此時再進(jìn)行工藝的更改需要重新進(jìn)行工藝開發(fā)，需要再次耗費(fèi)大量人力和物力。采用生物反應(yīng)器結(jié)合片狀載體或微載體等貼壁培養(yǎng)形式同樣存在一定的不足，以應(yīng)用最廣的Pharmacia公司生產(chǎn)的Cytodex系列和Cytopore系列為例，Cytodex系列盡管具有細(xì)胞貼壁快，生長快，能長時間培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，但其比表面積和可獲得的細(xì)胞濃度較小，細(xì)胞易受攪拌、珠間碰撞、流動剪切力等動力學(xué)因素的破壞。盡管Cytopore系列解決了因攪拌、氣泡等引起的機(jī)械損傷，而且細(xì)胞可以擁有更充分的生長空間，但這種培養(yǎng)方式在某種程度上阻礙了氧等營養(yǎng)成分的傳遞和病毒對細(xì)胞的感染，而且這種微載體也較容易受代謝廢物積累的影響。上述兩種微載體均存在吸附血清、易于變形且僅可一次性使用、培養(yǎng)后的分離過程損失細(xì)胞等缺點(diǎn)。而采用無血清培養(yǎng)懸浮細(xì)胞，細(xì)胞生長受細(xì)胞密度影響，采用稀釋法即可刺激細(xì)胞生長，操作簡單，采用WAVE生物反應(yīng)器可通過調(diào)整反應(yīng)器搖擺角度和搖擺速度即可調(diào)整溶氧量以滿足細(xì)胞的高密度生長，接種病毒過程中，病毒與細(xì)胞能夠充分接觸，保證了病毒的感染效率，灌流后代謝廢物能及時清除，減少了代謝廢物對細(xì)胞的影響，培養(yǎng)過程不使用牛血清，保證了產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，WAVE生物反應(yīng)器成熟的控制體系和完善的產(chǎn)品規(guī)格也使得后續(xù)的工藝放大成為可能，保證了生產(chǎn)放大過程中工藝評價的一致性，小試以及中試工藝開發(fā)即采用WAVE生物反應(yīng)器建立細(xì)胞培養(yǎng)和病毒生產(chǎn)工藝為生產(chǎn)工藝的放大提供了較為直接的理論和可行性數(shù)據(jù)支持。本發(fā)明中優(yōu)選采用的美國GE公司的WAVE生物反應(yīng)器系統(tǒng)20/50，為實驗室規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)、工藝開發(fā)和生產(chǎn)而設(shè)計的通用型生物反應(yīng)器系統(tǒng)，依托于這個系統(tǒng)可以實現(xiàn)100mL-10L甚至25L的放大需求，后期通過采用同一工作原理的其他更大規(guī)模的WAVE生物反應(yīng)器系統(tǒng)進(jìn)行cGMP生產(chǎn)工藝研發(fā)，即可輕松實現(xiàn)小試、中試、生產(chǎn)三個階段工藝放大，保證了研發(fā)工藝的連續(xù)性和穩(wěn)定性，減少工藝研發(fā)投入，提高了工藝研發(fā)效率。附圖說明圖1是本發(fā)明不同病毒接種量及收獲時間的結(jié)果圖。圖2是本發(fā)明不同的預(yù)處理方式病毒釋放效果對比圖。圖3是本發(fā)明重組腺病毒柱陰離子交換層析純化圖。圖4是本發(fā)明細(xì)胞袋工藝穩(wěn)定性研究分析比較圖。具體實施方式下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明的較優(yōu)的實施例作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。本發(fā)明提供了一種利用WAVE生物反應(yīng)器進(jìn)行無血清培養(yǎng)懸浮細(xì)胞中試化生產(chǎn)重組腺病毒的技術(shù)，包括如下步驟：步驟S1：細(xì)胞培養(yǎng)；預(yù)運(yùn)行WAVE生物反應(yīng)器過夜，檢查設(shè)備運(yùn)行及細(xì)胞袋無菌情況，設(shè)置CO2濃度5％，溫度37±1℃，搖動速度15rpm，轉(zhuǎn)動角度6°左右。確認(rèn)設(shè)備運(yùn)行以及細(xì)胞袋無菌情況正常后，取制備好的懸浮細(xì)胞HER096種子液轉(zhuǎn)移至20L細(xì)胞袋中，使得細(xì)胞初始密度為3-5×105個細(xì)胞/mL。設(shè)定培養(yǎng)參數(shù)如下：溫度為37℃±1、二氧化碳濃度5％、通氣量0.2Lpm，在培養(yǎng)過程，根據(jù)細(xì)胞密度逐級調(diào)整反應(yīng)器搖擺速度和角度。在本發(fā)明的初始階段，反應(yīng)器的搖擺速度為10-30rpm，優(yōu)選15-25rpm，搖擺角度為4-8°，優(yōu)選5-7°。隨著細(xì)胞培養(yǎng)的進(jìn)行，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1-2×106個細(xì)胞/ml時，再次調(diào)整搖擺速度和角度，同時開始灌注培養(yǎng)，灌注速度5-10L/d。在該階段，反應(yīng)器的搖擺速度為15-30rpm，優(yōu)選20-25rpm，搖擺角度為5-10°，優(yōu)選6-8°。步驟S2：病毒擴(kuò)增；采用本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)工藝培養(yǎng)懸浮細(xì)胞HER096，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到1-2×106個細(xì)胞/mL時，根據(jù)培養(yǎng)期間細(xì)胞密度的變化及時調(diào)整反應(yīng)器搖擺角度和搖擺速度，同時啟動灌注培養(yǎng)，灌注速度5-10L/d，使用新鮮的培養(yǎng)基逐步稀釋培養(yǎng)袋中的培養(yǎng)液。在細(xì)胞密度達(dá)到4-6×106個細(xì)胞/ml時，計算細(xì)胞袋中總的細(xì)胞數(shù)量，調(diào)整病毒種子液中病毒顆粒數(shù)，按照MOI(VP/cell)＝100:1-300:1接種重組腺病毒，染毒2-3h后，啟動灌注程序，灌注速度5-10L/d。病毒擴(kuò)增期間，反應(yīng)器搖擺速度為15-30rpm，優(yōu)選20-25rpm。搖擺角度為6-12°，優(yōu)選7-10°。病毒擴(kuò)增30-48h后，離心收集細(xì)胞，預(yù)處理后進(jìn)行純化。步驟S3：病毒純化；3.1純化預(yù)處理向收獲的細(xì)胞沉淀中加入緩沖液重懸，采用優(yōu)選的預(yù)處理方式處理細(xì)胞沉淀，于轉(zhuǎn)速6000×g，4℃條件下，離心20min，收集上清。向收獲的上清液中加入AB液進(jìn)行稀釋，為病毒純化預(yù)處理樣品。3.2陰離子交換色譜層析本步驟中采用的層析填料為GE公司的Source30Q，優(yōu)選QSepharoseXL，依次以1-2倍CV的0.5MNaOH洗柱，1-2倍CV的注射用水，以及1-2倍CV的BB液沖洗色譜柱。最后，用2-4倍CV的AB液平衡色譜柱。用病毒純化預(yù)處理樣品上樣。上樣量為5×1013-1.5×1015VP，上樣流速20-50mL/min。上樣后梯度洗脫，洗脫流速30-70mL/min，洗脫梯度為30％B，2-4CV，30-60％B，4-6CV，100％B，1-2CV。腺病毒特征峰出現(xiàn)后開始收樣，樣品用于下一步純化。3.3分子篩層析本步驟中使用的層析柱填料類型為Sepharose4FastFlow，以2-4倍CV的病毒保存液平衡層析柱。用經(jīng)陰離子層析純化后的樣品上樣，上樣體積2％-20％CV，流速20-30mL/min。以病毒保存液洗脫，洗脫流速為20-30mL/min，腺病毒特征峰出現(xiàn)后開始收樣。純化后的病毒樣品送質(zhì)量部門檢測各項指標(biāo)。實施例1病毒感染復(fù)數(shù)MOI(VP/cell)以及病毒擴(kuò)增時間的優(yōu)化。在本發(fā)明的病毒擴(kuò)增階段，對病毒擴(kuò)增效果影響較大的因素為病毒接種量以及病毒擴(kuò)增時間，因此，確定病毒擴(kuò)增階段生物反應(yīng)器的搖擺條件，同時對病毒接種量和病毒擴(kuò)增時間進(jìn)行優(yōu)化。具體如下：取制備好的懸浮細(xì)胞種子液接種至20L細(xì)胞袋中，使得細(xì)胞初始密度約為3-5×105個細(xì)胞/mL，以搖擺速度為10-30rpm，優(yōu)選15-25rpm，搖擺角度為4-8°，優(yōu)選5-7°的搖擺條件培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到1-2×106個細(xì)胞/mL時，根據(jù)培養(yǎng)期間細(xì)胞密度的變化及時調(diào)整反應(yīng)器搖擺角度和搖擺速度，具體為搖擺速度為15-30rpm，優(yōu)選20-25rpm，搖擺角度為5-10°，優(yōu)選6-8°。同時啟動灌注培養(yǎng)，灌注速度5-10L/d，使用新鮮的培養(yǎng)基逐步稀釋培養(yǎng)袋中的培養(yǎng)液。在細(xì)胞密度達(dá)到4-6×106個細(xì)胞/ml時，計算細(xì)胞袋中總的細(xì)胞數(shù)量，調(diào)整病毒種子液中病毒顆粒數(shù)，按照MOI(VP/cell)為100:1、300:1、500:1、700:1分別接種重組腺病毒，染毒2-3h后，啟動灌注程序，灌注速度5-10L/d。病毒擴(kuò)增期間，反應(yīng)器搖擺速度為15-30rpm，優(yōu)選20-25rpm，。搖擺角度為6-12°，優(yōu)選7-10°。分別于病毒擴(kuò)增30h、48h、60h、72h收獲病毒，結(jié)果見圖1。從實驗結(jié)果可知，隨著病毒接種量的提高，病毒收獲時間隨之提前，綜合考慮工藝放大可行性和工藝成本，本發(fā)明的病毒擴(kuò)增工藝中病毒接種量和收獲時間優(yōu)選MOI(VP/cell)＝100:1-300:1，擴(kuò)增30-48h后收獲病毒。實施例2病毒純化工藝預(yù)處理方法優(yōu)化。在病毒純化階段，細(xì)胞破碎的預(yù)處理影響著病毒的釋放效果，該步驟的回收率直接影響本階段工藝的最終純化效果，因此對細(xì)胞破碎條件進(jìn)行優(yōu)化。本發(fā)明采用反復(fù)凍融裂解，超聲破碎、高壓破碎的方法預(yù)處理細(xì)胞培養(yǎng)物。實驗分三組進(jìn)行，具體如下：A組反復(fù)凍融裂解：收獲細(xì)胞后，于4℃、1000×g轉(zhuǎn)速下離心10min，棄上清，向細(xì)胞沉淀中加入適量的病毒保存液進(jìn)行重懸，重懸后在-80℃凍存后，于37℃融化至剛剛成液體后重新放入-80℃冷凍，反復(fù)凍融，隨后4℃、2000×g轉(zhuǎn)速下離心40min，取上清液送檢，分別檢定病毒顆粒數(shù)和病毒滴度。B組超聲破碎：收獲細(xì)胞后，于4℃、1000×g轉(zhuǎn)速下離心10min，棄上清，向細(xì)胞沉淀中加入適量的病毒保存液進(jìn)行重懸，調(diào)節(jié)超聲破碎儀參數(shù)為：AMPL20％-60％，time1min，pulse3s，3s，temp4℃，對重懸的細(xì)胞按此條件超聲處理3次。隨后4℃、2000×g轉(zhuǎn)速下離心40min，取上清液送檢，分別檢定病毒顆粒數(shù)和病毒滴度。C組高壓破碎：收獲細(xì)胞后，于4℃、1000×g轉(zhuǎn)速下離心10min，棄上清，向細(xì)胞沉淀中加入適量的病毒保存液進(jìn)行重懸，調(diào)節(jié)壓力參數(shù)200-1000bar，將重懸的細(xì)胞經(jīng)高壓破碎處理后于4℃、2000×g轉(zhuǎn)速下離心40min，取上清液送檢，分別檢定病毒顆粒數(shù)和病毒滴度。實驗結(jié)果見圖2，從實驗結(jié)果可知，使用反復(fù)凍融、超聲破碎、高壓破碎等方式均可獲得較好的病毒釋放效果，其中以高壓破碎效果最佳，超聲破碎效果次之，反復(fù)凍融效果稍差，但就比滴度而言超聲破碎效果較其他兩種方法處理的病毒比滴度更低，即超聲破碎會對病毒活性造成一定損失，因此本發(fā)明純化工藝中純化預(yù)處理的方法優(yōu)選使用高壓破碎細(xì)胞釋放病毒，4℃，2000×g轉(zhuǎn)速下離心40min取上清進(jìn)行純化，但反復(fù)凍融和超聲破碎也可實現(xiàn)釋放病毒的目的。實施例3病毒純化工藝離子交換色譜層析工藝優(yōu)化。分別采用美國GE公司的Source30Q、QSepharoseXL以及德國MERCK公司FractogelDEAE為介質(zhì)對預(yù)處理后收獲的上清液進(jìn)行純化，純化結(jié)果見表1。從表1中可知，使用純化介質(zhì)Source30Q和QSepharoseXL均達(dá)到了較好的回收效果，兩種介質(zhì)均可用于重組腺病毒純化。Source30Q吸附能力最強(qiáng)，同時也吸附了更多的雜質(zhì)，相對更難以清洗。相較于QSepharoseXL，Source30Q的使用成本更高。因此在純化工藝中可選擇Source30Q作為層析介質(zhì)，綜合工藝放大及生產(chǎn)成本，優(yōu)選QSepharoseXL。表1不同交換層析柱純化結(jié)果比較實施例4病毒純化工藝采用優(yōu)選的美國GE公司的QSepharoseXL填料，依次以1-2倍CV的0.5MNaOH洗柱，1-2倍CV的注射用水，以及1-2倍CV的BB液沖洗色譜柱。最后，用2-4倍CV的AB液平衡色譜柱。上樣量為5×1013-1.5×1015VP，上樣流速20-50mL/min。上樣后梯度洗脫，洗脫流速30-70mL/min，洗脫梯度為30％B，2-4CV，30-60％B，4-6CV，100％B，1-2CV。腺病毒特征峰出現(xiàn)后開始收樣，樣品用于分子篩層析。本發(fā)明中分子篩層析使用的層析柱填料類型為Sepharose4FastFlow，以2-4倍CV的病毒保存液平衡層析柱。上樣體積2％-20％CV，流速20mL/min。以病毒保存液洗脫，洗脫流速為20mL/min，腺病毒特征峰出現(xiàn)后開始收樣。參照上述參數(shù)進(jìn)行病毒純化，純化后的病毒樣品送質(zhì)量部門檢測各項指標(biāo)。結(jié)果見表2。從實驗結(jié)果可見，本發(fā)明的純化工藝純化獲得的重組腺病毒原液質(zhì)量符合2015版《中國藥典》以及《人基因治療研究和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》的相關(guān)規(guī)定。表2采用優(yōu)化的純化工藝純化后的病毒原液檢測結(jié)果檢驗項目質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)原液總病毒數(shù)(VP)——4.12×1014體積(mL)——389病毒顆粒數(shù)(VP/mL)——1.06×1012病毒滴度(IU/mL)——5.63×1010病毒比滴度≥3.3％5.31％病毒純度(HPLC法)>95％100％病毒純度(紫外吸收法)1.2～1.41.27腺相關(guān)病毒(AAV)不得檢出沒有檢出，符合要求宿主細(xì)胞DNA殘留量≤10ng/劑量<10ng/劑量細(xì)菌內(nèi)毒素<10EU/劑量<10EU/劑量表2中的宿主細(xì)胞DNA殘留量、細(xì)菌內(nèi)毒素采用檢測試劑盒檢測，根據(jù)陰陽性結(jié)果判定。實施例5工藝穩(wěn)定性實驗。按照前述實施例中確定的工藝參數(shù)和要求，連續(xù)進(jìn)行3批次生產(chǎn)，三批細(xì)胞培養(yǎng)袋培養(yǎng)批號分別為：W1、W2和W3，三批細(xì)胞袋培養(yǎng)細(xì)胞生長曲線見圖4。從圖4可看出，采用WAVE20L細(xì)胞袋進(jìn)行3批次培養(yǎng)過程中，批次之間的細(xì)胞總量保持高度一致，這說明確定的細(xì)胞培養(yǎng)袋工藝穩(wěn)定、可重復(fù)性強(qiáng)，適合作為中試規(guī)模重組腺病毒樣品生產(chǎn)的生產(chǎn)工藝。WAVE20L細(xì)胞袋培養(yǎng)工藝中，細(xì)胞在良好的狀態(tài)下生長代謝，使細(xì)胞在對數(shù)生長期同步的情況下擴(kuò)增病毒，收獲病毒細(xì)胞按實施例中的純化工藝進(jìn)行純化，純化后樣品產(chǎn)量信息和質(zhì)檢結(jié)果分別見表3和表4。可以看出，三批樣品所獲得的總病毒數(shù)在1.0-1.5×1015VP之間，批次之間產(chǎn)量相對穩(wěn)定，純化后病毒顆粒數(shù)為5-7×1014VP之間，病毒顆粒數(shù)回收率在44％-47％之間。說明WAVE反應(yīng)器20L細(xì)胞袋病毒擴(kuò)增工藝和純化工藝均有一定的穩(wěn)定性。由表4可以看出，采用本發(fā)明工藝制備的重組腺病毒原液質(zhì)量能夠滿足藥學(xué)研究和臨床申報需求。表3三批樣品產(chǎn)量和收率統(tǒng)計表表4三批原液質(zhì)檢結(jié)果統(tǒng)計表以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3